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Peptidos y proteinas antibioticos

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Peptidos y proteinas antibioticos

  1. 1. Nuestras otras defensas: Proteínas propias con acción antibiótica Luis Rivas luis.rivas@cib.csic.es
  2. 2. PROTEÍNAS Y PÉPTIDOS ANTIMICROBIANOS: ¿Qué son?
  3. 3. ADN -> ARN-> Proteína Proteína está hecha de aminoácidos (20 diferentes) Qué es un péptido PÉPTIDO: UNA PROTEÍNA O UN TROZO DE PROTEÍNA PEQUEÑO
  4. 4. Inducción de actividad microbicida en la hemolinfa de la larva de la mosca de la carne (Phormia terranovae) Cociancich et al,(1994) Parasitol. Today 10:132 Tiempo (h) 0 3 6 9 12 24 48 Actividad Bactericida (Zona de Inhibciión (mm)) 0 2 4 6 8 10 12 14 Bacteria Injury Control
  5. 5. Inmunidad innata Inmunidad antígeno específica Preservación de los péptidos antibióticos en la evolución
  6. 6. Qué tiempo requieren los anticuerpos para “aparecer”? Escherichia coli se divide cada 20 min Los anticuerpos tardan en aparecer con memoria: 3 días . E.coli se ha duplicado: 288 veces El número de bacterias que habría en 3 días : 2 288 ~ 5 x1086 500 x 1000 x1000 x1000 x1000 x1000 x 1000 x1000 x1000 x1000 x1000 X 1000 x1000 x1000 x1000 x1000 x 1000 x1000 x1000 x1000 x1000 X 1000 x1000 x1000 x1000 x1000 x 1000 x1000 x1000
  7. 7. 106 proteínas y péptidos antibióticos Tipos: Constitutivos De inducción rápida Localización de los péptidos antimicrobianos
  8. 8. LL-37 LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES Péptidos a-helicoidales Ricos en un aminoácido específico Indolicidina. ILPWKWPWWPWRR-NH2 Péptidos circulares RTD-1 GFCRCLCR R R TC I CRCVG H ßD- 1 . DHYNCVSSGGQCLYSACPIFTKIQGTCYRGKAKCCK Péptidos cíclicos (disulfuro) Principales grupos de péptidos antibióticos
  9. 9. Alta carga positiva Anfipaticidad Escasas modificaciones postraduccionales Codificados por genes Características comunes a los péptidos antibióticos
  10. 10. PÉPTIDOS ANTIMICROBIANOS: ¿Cómo funcionan?
  11. 11. Cómo es una membrana biológica
  12. 12. Duelas de barril Tapizado Dos estados Poro Toroidal Agujero de gusano Principales modelos de permeabilización de membrana por PAM
  13. 13. E.coli L. donovani 9.3 20 23.8 Fosfatidilinositol Fosfatidilserina Fosfatidilglicero Cardiolipina Ácido fosfatídico Hepatocito Fosfolípidos con carga negativa en la membr. plasmática (%)
  14. 14. Citoplasma Medio Extracelular + + + + + + + + + + + + EUCARIOTAS SUPERIORES PROCARIOTAS EUCARIOTAS INFERIORES ¿CÉLULAS TUMORALES? ¿Cómo se enteran los péptidos de si es patógeno o célula propia?
  15. 15. Comparación antibiótico clásico-Péptido antimicrobiano Antibiótico clásico Péptido Antimicrobiano
  16. 16. -EL MECANISMO LETAL ES UNA INTERACCIÓN ESTEQUIOMÉTRICA, Y NO LA INHIBICIÓN DE UN SISTEMA BIOLÓGICO. - LA ESPECIFIDAD DE MEMBRANA IMPONE LÍMITES PARA EL DISEÑO DE AMPs ( > μM) -INDUCCIÓN DE RESISTENCIAS EXTREMADAMENTE ESCASA CONCLUSIONES -UN MISMO PÉPTIDO ANTIMICROBIANO ES POTENCIALMENTE ACTIVO FRENTE A UNA AMPLIA VARIEDAD DE PATÓGENOS.
  17. 17. H Chu et al. Science 2012;337:477-481 Nano-redes (HD6)
  18. 18. Entrada autopromovida de los PAMs en bacterias Gram- bacteria
  19. 19. Otras actividades para PAMs
  20. 20. PÉPTIDOS ANTIMICROBIANOS: Síntesis y optimización
  21. 21. H2N COOH R1 Síntesis de Péptidos Un dipéptido requiere 6 reacciones químicas : H2N COOH R2 HN R1 Prot O Act HN COOH R1 Prot Protección del N-amino Activación del COOH Protección del COOH H2N R2 O O-Prot 1 2 3 4 5-6 Acoplamiento ( formación del enlace Peptídico) H2N NH COOH R1 O R2 HN N O-Prot R1 O R2 O Prot H Desprotección de amino y carboxilo
  22. 22. Síntesis en fase sólida de péptidos. Modificaciones disponibles HN NH HN NH HN H2 C NH HN NH O O O O H2N O O NH2 O NH2 S O H3C CH3 O O HO OH OH OH O O Flu H3C O O O3P 2 Residuos D Fosforilación sulfatación lipidación glicosilación Residuos no-naturales Marcaje fluorescente Marcaje isotópico Bloqueo de extremos Isopéptido peptoides
  23. 23. Bruce E. Merrifield Hans G. Boman David Andreu Péptido quimera
  24. 24. KWKLFKKIEKVGQNIRDGIIKAGPAVAVVGQATQIAK-NH2 CECROPINA A MELITINA GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-NH2 CA(1-8)M(1-18) KWKLFKKI-GIGAVLKVLTTGLPALIS-NH2
  25. 25. Actividad leishmanicida de CA(1-8)M(1-18) 0.5 μM 1.0 μM 2.0μM -3 -20 -40 -100 Tiempo (s) 0 100 200 300 Fluorescencia (u.a.) 0 2 4 6 Adición de Péptido Despolarización de la membrana plasmática Microscopía electrónica
  26. 26. K+ K+ K+ K+ Na+ Distorsión de membrana -Cecropinas -Magaininas -Defensinas de mamíferos Diana intracelular Histatina -Buforin a -Pirrocorricina K+ K+ K+ Na+ Na+ Na+ Na+ Na+ Na+ Na+ K+ K+ K+
  27. 27. Control 12 mM L-Hst5 3 mM Dhvar4 Histatina 5, un péptido antibiótico humano de la saliva actúa sobre la mitocondria de Leishmania L-Hst5 (DSHAKRHHGYKRKFHEKHHSHRGY)
  28. 28. GSH TSH TSH GSH TSH TSH TSH SH HS HS SH S -S DIANA
  29. 29. MILTEFOSINA (HEXADECILFOSFOCOLINA) -Desarrollada inicialmente como fármaco antitumoral -Primer fármaco oral con éxito frente a la Leishmaniasis -Carente de efectos secundarios graves -Efectiva contra la LV y la LC?? - Efectiva contra aislados resistentes a antimoniales . . . -Efectiva sobre otros patógenos : Acanthamoeba, hongos, T. cruzi O P O N O O Miltefosina (MT)
  30. 30. LdmT y el transporte de Miltefosine Pérez-Victoria, F.J. Et al, 2006, Drug Resist Update ;9:26
  31. 31. Miltefosina fluorescente (F.Amat, A.U.Acuña) 7.5 μM B-C11-MT WT R40 Hornillos, V et al. (2008) Bioorg. Med.Chem.Lett. 18, 6336
  32. 32. Reactivo [mM] 0 5 10 15 20 25 30 Inhibición de la proliferación (% del control) 0 25 50 75 100 BODIPY-HePC HePC-BODIPY-S-S-Tat HePC-BODIPY-S-Tat Tat Tat + BODIPY-HePC Reversión de la nula incorporación de Miltefosine en R40 L.donovani promastigotes por conjugación a Tat 5 μM en MT-R40 L.donovani promastigotes. BODIPY-HePC HePC-BODIPY-SS-Tat HePC-BODIPY-S-Tat Luque-Ortega (2012)J Control Release. 161:835 Miltefosina Péptido Penetrante
  33. 33. PÉPTIDOS ANTIMICROBIANOS: IMPORTANCIA y PATOLOGÍA INFECCIOSA
  34. 34. PAMs y declive de poblaciones de anfibios
  35. 35. Sapo arlequín de Limosa(Atelopus limosus), PAMs y declive de poblaciones de anfibios Batrachochytrium dendrobatidis
  36. 36. Mycobacterium 1895.-Niels Finsen (Nobel, 1903) Vitamina D, TUBERCULOSIS y péptidos antimicrobianos
  37. 37. Zasloff, M (2006) Nat.Med. 12, 389 CRAMP GFP-Salmonella Merge Rosenberger, C et al (2004) PNAS, 101,2422 Péptidos antimicrobianos y patógenos intracelulares
  38. 38. Ileitis distal Colitis -Wnt defectuoso Menor nº de copias para hBD-2 - Mutación en NOD2 & hbD-3 -Diferenciación defectuosa de las células dePaneth -Bajo HD5& HD6 Bajo hBD-2 & hBD-3 Alta carga bacteriana 106-107 /g 1011-1012/g Incremento drástico de bacterias invasoras Microbiota anormal Estimulación inmune muy alta Inflamación
  39. 39. Fallos en la inmunidad innata de la piel:psoriasis
  40. 40. ¿DÓNDE SE BUSCAN NUEVOS PÉPTIDOS ANTIMICROBIANOS?
  41. 41. PÉPTIDOS DE PROTEÍNAS ALIMENTARIAS : LACTOFERRINA BOVINA
  42. 42. Los wallaby retrasan la aparición de su sistema inmune hasta 100 días postparto Dependencia exclusiva de la leche de la madre Identificación de la proteína AGG101
  43. 43. Q-defensinas y retrociclina Péptido circular Presente en macacos pero no en los grandes monos Abundancia de pseudogenes
  44. 44. Expresión de retrociclina en células humanas
  45. 45. UTILIDAD DE LOS PÉPTIDOS ANTIMICROBIANOS
  46. 46. Maggot therapy:an alternative for wound infection Dorothy Bonn The Lancet, (2000) 356, 1174
  47. 47. ¿Puedo encontrar péptidos antimicrobianos en la farmacia? De origen bacteriano: Bacitracina, gramicidinas A-D yS, polimixina B, estreptogramina, teicoplanina y vancomicina.
  48. 48. Nos-Barberá et al (1995) Cornea Queratitis experimental por Pseudomonas aeruginosa Control (-) Control(+) CA(1-7)M(2-9)
  49. 49. EL INCREMENTO DE LA ESTABILIDAD METABÓLICA DE LOS PAES ES ESENCIAL PARA SU ACTIVIDAD Papo et al (2006) Cancer Res 66, 5371 D-K6L9 LKLLKKLLKKLLKLL-NH2,
  50. 50. Lisostafina en mastitis bovina
  51. 51. Patatas transgénicas con la defensina antifúngica. Infección con el hongo Verticillium dahliae
  52. 52. Péptidos antimicrobianos como revestimiento en dispositivos clínicos
  53. 53. Lupetti A et al, (2003) Trends biotechnol, 21, 70. Localización de focos infecciosos in vivo
  54. 54. Qué hay en la cocina? -Prueba de concepto PAMs y PPCs en la quimioterapia de Leishmania - Permeabilización de membrana - Dianas intracelulares - Reversión de la resistencia por acumulación defectuosa de fármaco. -Biodisponibilidad: - Estabilidad metabólica - Lesiones cutáneas no-diseminadas Favorecer la accesibilidad del fármaco Permite uso de péptidos más agresivos. -Especificidad: -Péptido.- Incorporación de motivos de reconocimiento celular específicos Direccionamiento intracelular. - Molécula cargo: Explotar divergencia hospedero-parásito
  55. 55. Y el Microbioma……. Selección de especies “benignas” Inductores de péptidos antimicrobianos Y llamáis a esto vivir?

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