Charla científica

1. Nuestras otras defensas: Proteínas propias con acción antibiótica
Luis Rivas
luis.rivas@cib.csic.es

2. PROTEÍNAS Y PÉPTIDOS ANTIMICROBIANOS:
¿Qué son?

3. ADN -> ARN-> Proteína
Proteína está hecha de aminoácidos (20 diferentes)
Qué es un péptido
PÉPTIDO: UNA PROTEÍNA O UN TROZO DE PROTEÍNA PEQUEÑO

5. Inducción de actividad microbicida en la hemolinfa
de la larva de la mosca de la carne (Phormia terranovae)
Cociancich et al,(1994) Parasitol. Today 10:132
Tiempo (h)
0
3
6
9
12
24
48
Actividad Bactericida
(Zona de Inhibciión (mm))
0
2
4
6
8
10
12
14
Bacteria
Injury
Control

6. Inmunidad innata
Inmunidad antígeno específica
Preservación de los péptidos antibióticos en la evolución

7. Qué tiempo requieren los anticuerpos para “aparecer”?
Escherichia coli se divide cada 20 min
Los anticuerpos tardan en aparecer con memoria: 3 días .
E.coli se ha duplicado: 288 veces
El número de bacterias que habría en 3 días : 2 288 ~ 5 x1086
500 x 1000 x1000 x1000 x1000 x1000 x 1000 x1000 x1000 x1000 x1000 X
1000 x1000 x1000 x1000 x1000 x 1000 x1000 x1000 x1000 x1000 X
1000 x1000 x1000 x1000 x1000 x 1000 x1000 x1000

8. 106 proteínas y péptidos antibióticos
Tipos:
Constitutivos
De inducción rápida
Localización de los péptidos antimicrobianos

9. LL-37
LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES
Péptidos a-helicoidales
Ricos en un aminoácido específico
Indolicidina.
ILPWKWPWWPWRR-NH2
Péptidos circulares RTD-1
GFCRCLCR R
R TC I CRCVG
H ßD- 1 .
DHYNCVSSGGQCLYSACPIFTKIQGTCYRGKAKCCK
Péptidos cíclicos (disulfuro)
Principales grupos de péptidos antibióticos

10. Alta carga positiva
Anfipaticidad
Escasas modificaciones postraduccionales
Codificados por genes
Características comunes a los péptidos antibióticos

11. PÉPTIDOS ANTIMICROBIANOS:
¿Cómo funcionan?

12. Cómo es una membrana biológica

13. Duelas de barril
Tapizado
Dos estados
Poro Toroidal
Agujero de gusano
Principales modelos de permeabilización de membrana por PAM

15. E.coli
L. donovani
9.3
20 23.8
Fosfatidilinositol
Fosfatidilserina
Fosfatidilglicero
Cardiolipina
Ácido fosfatídico
Hepatocito
Fosfolípidos con carga negativa en la membr. plasmática (%)

16. Citoplasma
Medio
Extracelular
+ + + + + +
+ + + + + +
EUCARIOTAS SUPERIORES
PROCARIOTAS
EUCARIOTAS INFERIORES
¿CÉLULAS TUMORALES?
¿Cómo se enteran los péptidos de si es patógeno o célula propia?

18. Comparación antibiótico clásico-Péptido antimicrobiano
Antibiótico clásico
Péptido Antimicrobiano

19. -EL MECANISMO LETAL ES UNA INTERACCIÓN ESTEQUIOMÉTRICA, Y NO LA INHIBICIÓN DE UN SISTEMA BIOLÓGICO.
- LA ESPECIFIDAD DE MEMBRANA IMPONE LÍMITES PARA EL DISEÑO DE AMPs ( > μM)
-INDUCCIÓN DE RESISTENCIAS EXTREMADAMENTE ESCASA
CONCLUSIONES
-UN MISMO PÉPTIDO ANTIMICROBIANO ES POTENCIALMENTE ACTIVO FRENTE A UNA AMPLIA VARIEDAD DE PATÓGENOS.

20. H Chu et al. Science 2012;337:477-481
Nano-redes (HD6)

21. Entrada autopromovida de los PAMs en bacterias Gram- bacteria

22. Otras actividades para PAMs

23. PÉPTIDOS ANTIMICROBIANOS: Síntesis y optimización

24. H2N COOH
R1
Síntesis de Péptidos
Un dipéptido requiere 6 reacciones químicas :
H2N COOH
R2
HN
R1
Prot
O
Act
HN COOH
R1
Prot
Protección del N-amino Activación del COOH
Protección del COOH
H2N
R2
O
O-Prot
1 2
3
4
5-6
Acoplamiento
( formación del
enlace
Peptídico)
H2N
NH
COOH
R1
O R2
HN
N
O-Prot
R1
O R2
O
Prot
H
Desprotección de
amino y carboxilo

25. Síntesis en fase sólida de péptidos. Modificaciones disponibles
HN
NH
HN
NH
HN
H2
C
NH
HN
NH
O
O
O
O
H2N
O
O
NH2
O
NH2
S
O
H3C
CH3
O
O
HO
OH
OH
OH
O O
Flu
H3C
O
O
O3P
2
Residuos D
Fosforilación
sulfatación
lipidación
glicosilación
Residuos
no-naturales
Marcaje
fluorescente
Marcaje
isotópico
Bloqueo de
extremos
Isopéptido
peptoides

26. Bruce E. Merrifield
Hans G. Boman
David Andreu
Péptido quimera

27. KWKLFKKIEKVGQNIRDGIIKAGPAVAVVGQATQIAK-NH2
CECROPINA A
MELITINA
GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-NH2
CA(1-8)M(1-18)
KWKLFKKI-GIGAVLKVLTTGLPALIS-NH2

28. Actividad leishmanicida de CA(1-8)M(1-18)
0.5 μM
1.0 μM
2.0μM
-3
-20
-40
-100
Tiempo (s)
0
100
200
300
Fluorescencia (u.a.)
0
2
4
6
Adición de
Péptido
Despolarización de la membrana plasmática
Microscopía electrónica

29. K+
K+
K+
K+
Na+
Distorsión de membrana
-Cecropinas
-Magaininas
-Defensinas de
mamíferos
Diana intracelular
Histatina
-Buforin a
-Pirrocorricina
K+
K+
K+
Na+
Na+
Na+
Na+
Na+
Na+
Na+
K+
K+
K+

30. Control 12 mM L-Hst5 3 mM Dhvar4
Histatina 5, un péptido antibiótico humano de la saliva
actúa sobre la mitocondria de Leishmania
L-Hst5 (DSHAKRHHGYKRKFHEKHHSHRGY)

31. GSH
TSH
TSH
GSH
TSH
TSH
TSH
SH HS
HS
SH
S -S
DIANA

32. MILTEFOSINA (HEXADECILFOSFOCOLINA)
-Desarrollada inicialmente como fármaco antitumoral
-Primer fármaco oral con éxito frente a la Leishmaniasis
-Carente de efectos secundarios graves
-Efectiva contra la LV y la LC??
- Efectiva contra aislados resistentes a antimoniales
.
.
.
-Efectiva sobre otros patógenos : Acanthamoeba, hongos, T. cruzi
O
P
O
N
O
O
Miltefosina (MT)

33. LdmT y el transporte de Miltefosine
Pérez-Victoria, F.J. Et al, 2006, Drug Resist Update ;9:26

34. Miltefosina fluorescente (F.Amat, A.U.Acuña)
7.5 μM B-C11-MT
WT
R40
Hornillos, V et al. (2008) Bioorg. Med.Chem.Lett. 18, 6336

35. Reactivo [mM]
0 5 10 15 20 25 30
Inhibición de la proliferación
(% del control)
0
25
50
75
100
BODIPY-HePC
HePC-BODIPY-S-S-Tat
HePC-BODIPY-S-Tat
Tat
Tat + BODIPY-HePC
Reversión de la nula incorporación de Miltefosine en
R40 L.donovani promastigotes por conjugación a Tat
5 μM en MT-R40 L.donovani promastigotes.
BODIPY-HePC HePC-BODIPY-SS-Tat HePC-BODIPY-S-Tat
Luque-Ortega (2012)J Control Release. 161:835
Miltefosina Péptido Penetrante

36. PÉPTIDOS ANTIMICROBIANOS: IMPORTANCIA y PATOLOGÍA INFECCIOSA

38. PAMs y declive de poblaciones de anfibios

39. Sapo arlequín de Limosa(Atelopus limosus),
PAMs y declive de poblaciones de anfibios
Batrachochytrium dendrobatidis

40. Mycobacterium
1895.-Niels Finsen (Nobel, 1903)
Vitamina D, TUBERCULOSIS y péptidos antimicrobianos

41. Zasloff, M (2006) Nat.Med. 12, 389
CRAMP
GFP-Salmonella
Merge
Rosenberger, C et al (2004) PNAS, 101,2422
Péptidos antimicrobianos y patógenos intracelulares

42. Ileitis distal Colitis
-Wnt defectuoso Menor nº de copias para hBD-2
- Mutación en NOD2 & hbD-3
-Diferenciación defectuosa de las células dePaneth
-Bajo HD5& HD6 Bajo hBD-2 & hBD-3
Alta carga bacteriana
106-107 /g 1011-1012/g
Incremento drástico de bacterias invasoras
Microbiota anormal
Estimulación inmune muy alta
Inflamación

43. Fallos en la inmunidad innata de la piel:psoriasis

44. ¿DÓNDE SE BUSCAN NUEVOS PÉPTIDOS ANTIMICROBIANOS?

45. PÉPTIDOS DE PROTEÍNAS ALIMENTARIAS :
LACTOFERRINA BOVINA

47. Los wallaby retrasan la
aparición de su sistema
inmune hasta 100 días
postparto
Dependencia exclusiva de la
leche de la madre
Identificación de la proteína
AGG101

49. Q-defensinas y retrociclina
Péptido circular
Presente en macacos pero no en los
grandes monos
Abundancia de pseudogenes

50. Expresión de retrociclina en células humanas

52. UTILIDAD DE LOS
PÉPTIDOS ANTIMICROBIANOS

53. Maggot therapy:an alternative for wound infection
Dorothy Bonn
The Lancet, (2000) 356, 1174

54. ¿Puedo encontrar péptidos antimicrobianos en la farmacia?
De origen bacteriano: Bacitracina, gramicidinas A-D yS, polimixina B, estreptogramina, teicoplanina y vancomicina.

55. Nos-Barberá et al (1995) Cornea
Queratitis experimental por Pseudomonas aeruginosa
Control (-) Control(+) CA(1-7)M(2-9)

56. EL INCREMENTO DE LA ESTABILIDAD METABÓLICA DE LOS PAES ES ESENCIAL PARA SU ACTIVIDAD
Papo et al (2006) Cancer Res 66, 5371
D-K6L9 LKLLKKLLKKLLKLL-NH2,

57. Lisostafina en mastitis bovina

58. Patatas transgénicas con la defensina antifúngica.
Infección con el hongo Verticillium dahliae

60. Péptidos antimicrobianos como revestimiento en dispositivos clínicos

61. Lupetti A et al, (2003) Trends biotechnol, 21, 70.
Localización de focos infecciosos in vivo

62. Qué hay en la cocina?
-Prueba de concepto PAMs y PPCs en la quimioterapia de Leishmania
- Permeabilización de membrana - Dianas intracelulares - Reversión de la resistencia por acumulación defectuosa
de fármaco.
-Biodisponibilidad: - Estabilidad metabólica - Lesiones cutáneas no-diseminadas Favorecer la accesibilidad del fármaco Permite uso de péptidos más agresivos.
-Especificidad: -Péptido.- Incorporación de motivos de reconocimiento celular
específicos Direccionamiento intracelular.
- Molécula cargo: Explotar divergencia hospedero-parásito

63. Y el Microbioma…….
Selección de especies “benignas”
Inductores de péptidos antimicrobianos
Y llamáis a
esto vivir?