2. Citogenética: Estudo da genética por meio da citologia, esta área da ciência engloba todo e qualquer estudo relacionado com o cromossomo, isolado ou em conjunto, condensado ou distendido, tanto no que diz respeito à sua morfologia, organização, função e replicação, quanto à sua variação e evolução. (Sacchet, 1999)
3. Histórico da citogenética Marco inicial em 1663 Hooke, matemático e microscopista, Estudos em cortiça em microscópio com aumento de apenas 100 a 200 vezes, observou que esta era constituída por inúmeras pequenas caixas que chamou de células.
4. Desde a época de Mendel, a Citologia e a Genética passaram a ser conhecimentos em área comum, mais tarde denominada citogenética. A partir disso, a citogenéticaexpandiu-se, se inserindo em vários campos da Biologia, como a Taxonomia, a Bioquímica, a Medicina Clínica e o Melhoramento Animal e Vegetal (Guerra, 1988).
6. Citogenéticamolecular A análise cromossômica: Grande importância para o entendimento da evolução, estabilidade cariotípica. a caracterização cromossômica foi baseada em parâmetros morfológicos, foi melhorada a partir da implantação de técnicas de bandeamento, a visualização de blocos de coloração diferenciada, (Brasileiro-Vidal & Guerra, 2002)
7. A análise cromossômica sempre foi um dos campos estimulantes da Citologia e da Genética, tendo relação entre estudos taxonômicos e evolutivos, bem como no melhoramento genético e na caracterização de germoplasma.
8. Continua sendo a única maneira de observar o genoma de um eucarioto na forma de blocos individualizados de material genético, fáceis de serem mensurados, diferenciados em sub-unidades e manipulados de diferentes formas.
9. Técnicas citogenéticas aplicadas à caracterização Bandeamento Cromossômico Coloração com nitrato de prata Quantidade de DNA Hibridização in situ
10. Bandeamento Cromossômico Originou de uma rápida série de estudos em 1968 e 1969, com o trabalho de Casperssone colaboradores na Suécia. Em síntese, corantes que têm uma afinidade pelo DNA, fluorescem sob a luz ultravioleta. Após tratamento adequado com esses corantes, cada cromossomo mostra zonas brilhantes e escuras, ou bandas, que são específicas em tamanho e localização para este cromossomo.
11. Os bandeamentos são especialmente importantes para a citogenética, porque permitem identificar pequenas variações estruturais, como deleções, duplicações, inversões, geralmente relacionadas com determinadas anomalias do desenvolvimento. Além disso, é possível localizar exatamente a região do cromossomo diretamente afetada, que seria impossível com a coloração convencional. (Guerra, 1988)
13. Bandeamento C Tem auxiliado também no estudo da estrutura e função das regiões eucromáticas e heterocromáticas, fornecendo uma estimativa da recombinação genética nas regiões cromossômicas específicas e possibilitando o reconhecimento de muitas alterações cromossômicas, antes não detectáveis. Permite uma análise mais detalhada do pareamento meiótico e o monitoramento da transferência de segmentos cromossômicos (Gill, 1993).
14. Bandas C: os cromossomos são tratados com solução ode hidróxido de bário e corados com Giemsa. Com este método, são coradas regiões específicas em que o cromossomo apresenta DNA altamente repetitivo, como nas regiões dos centrômeros e em outras regiões cromossômicas (ex: braço longo do Y e telômeros), correspondendo à heterocromatina constitutiva, motivo de sua denominação.
15. Bandeamento G Os cromossomos são desproteinizados por ação da tripsina ou tampão fosfato e, posteriormente são corados com Giemsa (de onde deriva o nome bandas G). Os cromossomos mostram um padrão de bandas claras e escuras, no qual as faixas escuras correspondem ao DNA rico em bases AT e poucos genes ativos; as bandas G claras têm DNA rico em bases GC e apresentam muitos genes ativos. Importância: detecção de deleções, inversões e duplicações em humanos.
16. Bandeamento Q Os cromossomos são submetidos a um tratamento com quinacrinamustarda, uma substância fluorescente e passam a apresentar faixas com diferentes intensidades de fluorescência, com um padrão de bandas brilhantes e opacas característico para cada par. Tais bandas foram designadas de bandas Q (de quinacrina). O material deve ser analisado em microscópio de fluorescência e as regiões brilhantes são ricas em AT. Tem como importância a detecção de deleções, inversões e duplicações em humanos.
17. Coloração com nitrato de prata O nitrato de prata tem sido usado para corar diferencialmente os nucléolos nos núcleos interfásicos e as RONs em cromossomos metafásicos (Lima-Brito et al., 1998) Essa técnica também tem sido usada para analisar anfiplastia. Em cereais, essa atividade tem sido estudada ao nível citológico, através da contagem do número e do volume dos nucléolos e do número de RONs coradas com prata (Martini & Flavell, 1985; Lima-Brito et al., 1998).
18. Quantidade de DNA As análises do conteúdo de DNA têm sido utilizadas para a detecção de pequenas diferenças no tamanho do genoma e para a conseqüente discriminação entre plantas euplóides e aneuplóides.
19. Hibridização in situ Baseia-se no fato do DNA ser formado por duas fitas complementares, as quais podem ser facilmente desnaturadas e posteriormente voltar ao estado de fita dupla. Se no momento da renaturação das fitas de DNA houver fragmentos de DNA marcados (sonda) disponíveis, os mesmos hibridizarão na região de homologia dentro da célula, permitindo a sua localização precisa, tanto em cromossomos, como em núcleos interfásicos.
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21. (A) Marcação da sonda via direta ou indireta. (B) Fragmentação do DNA bloqueio. (C) Preparação das lâminas. (D) Desnaturação do DNA da sonda e do bloqueio, ambos em uma mistura de hibridização. (E) Adição da mistura de hibridização contendo sonda e DNA bloqueio à preparação. (F) Desnaturação do DNA cromossomal. (G) Hibridização in situ da sonda e do bloqueio nos locais de complementaridade de bases nos cromossomos. (H) Detecção da sonda no DNA cromossomal de um dos parentais, caso a marcação tenha sido indireta. (I) Molécula de DNA cromossomal do segundo parental associada ao DNA bloqueio não marcado. (J) Visualização dos sinais de hibridização em microscopia de fluorescência nos cromossomos associados à sonda (verde). Os cromossomos não marcados são visualizados com o contra-corante (azul). (Fonte: Santelmo Vasconcelos & Ana Christina Brasileiro-Vidal, adaptado de Guerra, 2004).
22. Sendo assim, a citogenética reúne informações obtidas sobre o material genético, estampada em uma simples foto, a uma estética própria da área, capaz de impressionar iniciantes e profissionais experientes (Guerra &Souza, 2002).
