2. Introducción El silenciamiento por RNA es un mecanismo altamente conservado en la naturaleza en el que moléculas de RNA de doble cadena (dsRNA) regulan la expresión de genes. El fenómeno fue inicialmente descubierto en 1990, cuando botánicos que se encontraban trabajando con petunias intentaron sobre-expresar a la enzima que produce el color púrpura (llamada chalconasintasa). Para ello introdujeron varias copias del gen que codifica para esta enzima esperando encontrar que las plantas que sobre-expresaran a la chalconasintasa fueran púrpuras.
3. Sin embargo descubrieron que se generaban flores sin color o con parches blancos. Al analizar los niveles de la enzima encontraron que eran 50 veces menores a los de las plantas originales. Esta observación implicaba que los genes que introdujeron no se estaban expresando, pero también que el gen natural de la planta dejaba de expresarse, por esta razón al fenómeno se le llamó co-supresión. Un fenómeno equivalente fue descrito dos años después en el hongo Neurospora crassa; a este fenómeno le llamaron quelling (“detener abruptamente”).
4. En 1998 descubrieron que tras la inyección de dsRNA dentro del nemátodo Caenorhabditis elegans se producía un silenciamiento de la expresión de genes que era específico de secuencia, es decir, que la expresión del gen que presenta la misma secuencia que el dsRNA se inhibía. Este fenómeno explicaba tanto la co-supresión como el “quelling” y fue denominado RNA de interferencia (RNAi).
5. El mecanismo de la RNAi fue descrito in vitro utilizando extractos de la mosca de la fruta Drosophila melanogaster. Estos estudios revelaron que moléculas largas de dsRNA eran cortadas en fragmentos pequeños con una estructura específica: dos cadenas de 21 a 25 nucleótidos interaccionado en forma de dúplex, donde 19 nucleótidos se encuentran formando RNA de doble cadena y dos nucleótidos sin aparearse en los extremos. Estas moléculas fueron denominadas pequeños RNA de interferencia (siRNA) y se demostró que son las mediadoras del proceso de interferencia.
6. Hasta el año 2000, la RNAi fue una herramienta que se utilizó para apagar la expresión de genes en varios organismos, pero no en mamíferos. Esto era debido a que las moléculas grandes de dsRNA (de más de 30 pares de bases) inducen en células de mamífero una respuesta que generalmente desencadena la muerte de la célula.
7. Sin embargo, ese año el grupo de Tom Tuschl describió que cuando se utilizan directamente los siRNA, es posible inducir el proceso de interferencia en células de mamífero sin que despierte la respuesta que conduce a la muerte celular. Este descubrimiento abrió la posibilidad de utilizar la interferencia de RNA como una herramienta en la investigación enfocada a células de mamíferos.
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9. Para qué utilizan las células el RNAi El mecanismo de interferencia está presente en todos los eucariotes en los que se ha buscado; esto sugiere que es un mecanismo muy antiguo que apareció temprano en la evolución y que tiene un papel importante en el mantenimiento del funcionamiento celular. Una de las ideas más aceptadas que explican su persistencia es que funciona como un sistema inmune a nivel celular. Es decir, que le permite a la célula distinguir información genética que le es propia, de la que no lo es, la cual actuaría como un parásito molecular, aprovechando la maquinaria celular para reproducirse y causando daño a la célula.
10. La información genética que puede estar en la célula y que pudiera actuar como un parásito molecular tiene dos fuentes, los llamados elementos transponibles y los virus. La mayor parte de las familias de virus conocidos generan estructuras de dsRNA durante su replicación, las cuales pueden disparar el proceso de interferencia de RNA, que la célula utilizaría para destruir al RNA invasor.
11. Si la interferencia de RNA funcionara como un mecanismo de protección contra la infección por virus, se esperaría que se cumplieran tres condiciones. La primera es que el virus indujera la aparición de moléculas de siRNA dirigidas contra la secuencia del propio virus. La segunda condición es que cualquier bloqueo del mecanismo de interferencia favorecería la replicación del virus. Finalmente, sería de esperar que, si la interferencia de RNA fuera un mecanismo antiviral, los virus, a su vez, adquirieran durante la evolución mecanismos para combatir esta interferencia.
12. Las tres condiciones mencionadas con anterioridad se cumplen para el caso de plantas y de invertebrados. Sin embargo, en mamíferos no es claro el papel de la interferencia de RNA como un sistema de defensa antiviral que opere naturalmente. A pesar de esto, se ha demostrado ampliamente que la maquinaria de la interferencia persiste en células de mamífero y puede ser utilizada como un mecanismo antiviral inducido exógenamente utilizando siRNA.
13. La segunda función importante que se reconoce al sistema de interferencia es la de regular la expresión de genes durante el desarrollo. Algunos de los ejemplos mejor estudiados fueron descubiertos estudiando Arabidopsisthaliana. En esta planta, cuando se pierde parcialmente el gen dcl1 (el cual codifica para una de las proteínas dicer), se generan alteraciones en el desarrollo, que incluyen un florecimiento tardío, pérdida de sus meristemos y desregulación en sus células madres meristemáticas. La pérdida completa de este mismo gen en C. elegans, genera un defecto en el cambio de fase celular durante el desarrollo post-embriónico, generando un arresto embrionario, por lo que el nemátodo no puede completar su desarrollo. En ratones, al anular el gen que codifica para dicer se generan embriones sin células madre o troncales.
14. El número de genes que codifican para microRNA encontrados en diferentes animales varía de 0.5 a 1% del número total de genes en sus genomas. En el genoma del nematodo Caenorhabditiselegansy en el de la mosca de fruta Drosophilamelanogasterse calcula que hay entre 100 y 140 genes para microRNA, Los humanos tienen entre 200 y 255 genes. Al menos 0.2% de los genes en Arabidopsisthalianacodifican para microRNA.
15. La representación relativa de los genes de microRnA (0.2-1%) es comparable a las familias de otros genes reguladores, tales como factores transcripcionales (el grupo de proteínas que se encarga de regular la transcripción de los genes). Casi el 30% de los microRnA son altamente conservados y tienen sus equivalentes en genomas de vertebrados e invertebrados. Esto pudiera sugerir que una fracción significativa posee funciones biológicas evolutivamente conservadas.
16. Genes Knockdown La función del RNAi se estudia a menudo en cultivos celulares o in vivo en organismos modelos. ARN de doble cadena se sintetiza y se introduce en una célula u organismo. El dsRNA es reconocida como material genético exógeno y activa la ruta del RNAi. El estudio de los efectos en la disminución resultante en la función del gen objetivo puede mostrar el papel fisiológico del producto génico. Cuando el RNAi no anula del todo la expresión del gen se dice que hay una “caída” (knockdown), como en un “knockout” donde la expresión es anulada por completo. Se llegan a obtener efectos secundarios cuando se introduce una secuencia de RNA que se puede aparear y reducir la expresión de múltiples genes a la vez. Se estima que alrededor de un diez por ciento de siRNAs darán lugar a importantes efectos genéticos en C. elegans.
17. Genómica funcional C. eleganses particularmente útil para la investigación de RNAi por dos razones principales. La primera de ellas es que los efectos del silenciamiento de genes son generalmente hereditarios. En segundo lugar, por que la introducción del dsRNA es extremadamente simple. Las E. colique llevan el dsRNA de interés pueden usarse para alimentar a las C. elegans, y este transferirá su carga de RNA a C. elegansa través del tracto intestinal. Esta "entrega por la alimentación" es mucho más fácil que otros métodos como la inmersión, o la inyección de los gusanos con el RNA.
18. Medicina El descubrimiento del ARNi en células humanas ha conducido a numerosos avances en la campo de la medicina. La aplicación del RNAi podría ser utilizada para luchar contra casi cualquier enfermedad imaginable, incluyendo trastornos cerebrales como la corea de Huntington y Alzheimer, mortales infecciones virales y cáncer. Deteniendo de inicio la enfermedad o su progreso.
19. Degeneración macular La degeneración macular, una enfermedad ocular debilitante, ha visto la primera terapia RNAi en los ensayos clínicos. El RNAi “medicamento” ha sido introducido en los tejidos enfermos por medio de una inyección en el ojo. Esta forma de liberación del RNA garantiza que los medicamentos desnudos de RNAi, o cadenas cortas de ARN que no estén envasados y protegidos en las membranas y se degradan rápidamente en el torrente sanguíneo, puede alcanzar su meta intactos. La enfermedad es causada por una proteína llamada VEGF.
20. Degeneración macular Esta proteína conduce a la producción excesiva de vasos sanguíneos, detrás de la retina, sin embargo, como estos vasos conducen a u aumento en la opacidad de la visión, pueden derivar en pérdida total de la visión. Estos nuevos fármacos RNAi apagar los genes que producen la proteína VEGF. Un cuarto de los pacientes que recibieron la tratamiento clínico de RNAi tenía una visión mucho más clara después de dos meses. La visión del otro paciente se había estabilizado.
21. ARTÍCULOS UTILIZADOS Tomás López, Daniela Silva, Susana López y Carlos Arias, RNA de interferencia: el silencio de los genes. Chris Yeisley, C.L. Criscuolo. RNA Interference and Gene Silencing in Medicine and Biotechnology, 2009.
