La tinción de Gram, desarrollada en 1884, permite evaluar rápida y económicamente la morfología y complejidad de bacterias mediante la diferenciación de bacterias Gram positivas, que retienen la coloración violeta, de las Gram negativas, que se tiñen de rosa. El procedimiento involucra el uso sucesivo de cristal violeta, lugol, alcohol y un colorante de contraste como la safranina.
1. •Desarrollada por el bacteriólogo Christian
Gram en 1884
•Permite la rápida evaluación de morfología y
complejidad bacteriana
•Tinción rápida y Económica
•Puede variar según el protocolo usado
(necesidad de estandarizar el protocolo)
2. Portaobjetos
Agua destilada
Pipetas Pasteur, haza, Mechero.
Cristal Violeta
Lugol
Alcohol acetona
Safranina (u otra tinción de contraste)
3. Colocar una pequeña gota de Agua destilada
en el portaobjetos (con pipeta por ejemplo)
Re-suspender muestra en el portaobjetos.
Secar al mechero.
La gota de agua debe Se debe calentar por 5
ser pequeña min aprox, hasta que
toda el agua se seque.
4. Se debe colocar Cristal Violeta cubriendo toda
la muestra por 1min (variable según lab.)
Se lava con agua corriente
Puede hacerse con
gotario o pizeta
5. Luego debe agregarse el lugol. Este debe
aplicarse como el cristal violeta y también
debe cubrir la muestra por 1 min. Luego se
lava con agua corriente.
6. El cubrir la muestra con alcohol acetona para
decolorarla es el paso más critico del
procedimiento. Este debe cubrir la muestra
por el tiempo que puede ir de 15s a 30s
según corresponda y la reacción debe ser
detenida con el lavado con agua corriente. El
tiempo debe ser el mismo para todas las
muestras.
Al ser tiempos por lo
general muy cortos, se
recomienda agregar el
alcohol mientras ya se tiene
la llave del agua corriendo,
listo para el lavado.
7. El último paso consiste en agregar una
tinción de contraste, para teñir las bacterias
que pierden el cristal violeta. Para esto se
agrega safranina cubriendo la muestra por
15s o por 1min, dependiendo. Luego se lava
con agua corriente y se deja secar.
8. Bacterias Gram positivas:
◦ Corresponden a las bacterias que mantienen la
coloración del cristal violeta después del alcohol
acetona, lo que les da un color violeta/morado.
Streptococcus
pneumoniae
Bacteria Gram positiva,
desde cultivo
bacteriano en agar
sangre.
9. Bacterias Gram negativas:
◦ Corresponden a las bacterias que pierden la
coloración del cristal violeta después del alcohol
acetona y se tiñen con el colorante de contraste
(safranina), lo que les da un color rosáceo/rojizo.
Escherichia coli
Bacteria Gram Negativa,
cultivo desde agar
Macconkey
10. Es conveniente estandarizar los tiempos de tinción
para cada laboratorio, ya que la calidad y
concentraciones de reactivos pueden variar bastante.
Lo más recomendable es realizar el gram de los
cultivos de agares enriquecidos y de colonias aisladas
y en crecimiento.
Los gram directos de una muestra solo son útiles en
ciertos casos.
Las bacterias anaerobias son más difíciles de teñir,
esto puede mejorar si se agrega bicarbonato
mezclado a las tinciones.
La muestra no debe ser excesiva para poder
determinar las otras características de la bacteria,
como forma y agrupación.
11. Se presentan las imágenes sin modificaciones
usadas en la presentación
Reencuadre
Brillo -27
Contraste -50
Reencuadre
