7. PRUEBA DE CATALASA
Enzima que descompone el peroxido de
hidrogeno en oxigeno y agua.
H2 O 2
H2O + O2 (Burbuja
de gas)
Catalasa
Técnica:
Colocar una gota de H2O2 en un porta
objeto y añadir con asa una colonia de la
bacteria en estudio.
“Nota” La tecnica no se puede hacer con
colonia aislada de Agar Sangre ya que
pueden dar falsos positivos porque los
eritrocitos tienen actividad de catalasa.
Resultados:
POSITIVO: Formación de burbujas
(desprendimiento de O2)
NEGATIVO: No formación de burbujas.
8. PRODUCCION DE COAGULASA
Enzima que transforma el fibrinogeno en fibrina, provocando la
formación de un coagulo visible.
Técnica:
Hacer una suspensión en plasma con colonias de Staphylococcus
en un tubo estéril.
Incubar a 35ºc de 2 a 24h
Resultados:
PRUEBA POSITIVA: Formación de Coagulo
PRUEBA NEGATIVA: No formación de coagulo
9. PRODUCCION DE LA DNASA
(Desoxirribonucleasa)
Enzima que desdobla al ácido
desoxirribonucleico en sus
nucleótidos.
Técnica:
Sembrar una estría en la placa de Agar
DNASA. Incubar a 35ºc x 24h
Revelar agregando a la placa HCL al
10%.
Resultados:
REACCION POSITIVA: Formación de un
halo transparente alrededor de la
estría.
REACCION NEGATIVA: No formación
de halo.
10. PRUEBA DE SENSIBILIDAD A LA
NOVOBIOCINA
Es un ATB que inhibe el crecimiento de Staphylococcus
epidermides.
Técnica:
Efectuar una siembra masiva en Agar Mueller Hinton colocar el
disco de Novobiocina de 5 ug.
Incubar 35ºC x 24h.
Resultados:
SENSIBLE:
RESISTENTE:
≥ 16
<16
11. PRUEBA DE SENSIBILIDAD A LA
OPTOQUINA
La Optoquina inhibe selectivamente al
desarrollo del Streptococcus
Pneumoniae.
Técnica:
Hacer un inoculo equivalente al tubo
0.5 de la escala de MC. Farland
Hisopar el inoculo en Agar MH sangre
al 5% colocar el disco de optoquina
Incubar a 35º C de 20 – 24h en lata
con vela para proporcinar 5% de CO2
Resultados:
SENSIBLE: Mayor 14 mm
Halos entre 9 – 14 deben ser
Confirmado con la prueba de
Solubilidad en Bilis
12. PRUEBA DE SENSIBILIDAD A LA
BACITRACINA
Es un ATB que inhibe el desarrollo
del Estreptococos pyogenes a bajas
concentraciones 0.02 a 0.04 unidades.
Técnica:
Hacer una siembra masiva en placa de
Agar sangre, colocar el disco de
Bacitracina.
Incubar a 35ºC por 24h.
Resultados:
SENSIBLE: Cualquier halo de
inhibición.
13. PRUEBA DE CAMP
La actividad hemolítica de la beta lisina,
Estafilococica sobre los eritrocitos se ven
intensificados por un factor extracelular
producido por el estreptococos del grupo B
llamado factor Camp.
Técnica:
En una placa de Agar sangre realizar una estría
de estreptococos en forma perpendicular a otra
estría de Staphylococcus aureus, incubar a 35ºC
x 24h.
Resultados:
CAMP POSITIVO: Formación de una flecha
entre la estría del estreptococo y la estría de
Staphylococcus aureus.
CAMP NEGATIVO: No formación de flecha.
14. DESARROLLO EN
NaCl al 6.5%
Los Enterococcus tienen la capacidad
de crecer a altas concentraciones de
NaCl.
Técnica:
Hacer una suspensión en caldo NaCl al
6.5% con colonias de Enterococcus.
Incubar a 35ºC x 24h
Resultados:
POSITIVO: Crecimiento en NaCl al
6.5% (Turbio)
NEGATIVO: No crecimiento.
(Transparente)
15. PRUEBA DE LA BILIS
ESCULINA
Se basa en la capacidad que tienen
algunas bacterias de hidrolizar la
Esculina en presencia de la bilis al
40% .
Técnica:
Sembrar con asa en punta en el medio
B.E.
Incubar a 35º C x 24h.
Resultados:
B.E POSITIVA: Ennegrecimiento del
medio.
B.E NEGATIVA: No ennegrecimiento
del medio
16. Prueba de la Hidrólisis del PYR
(Producción de Pirrolidonil-beta-Naftilamida
Consiste en la capacidad de ciertas bacterias de hidrolizar la Pirrolidonil-beta
naftilamida liberándose el grupo pirrolidico que se determina con el reactivo
revelador. (N-N dimetilamino cinamaldehido).
Técnica:
Preparar una suspensión de la bacteria en estudio en solución fisiológica
estéril se le agrega el disco impregnado con el reactivo se incuba 30 minutos
a 35ºC, luego de la incubación se agregan 2 gotas del reactivo revelador.
Resultados:
POSITIVO: Disco color Rosado a Rojo
NEGATIVO: Disco y/o solución color Amarillo a Incoloro.
17. QUE ENSAYAR Y QUE
INFORMAR EN EL ATB DE
COCOS GRAM POSITIVOS
DE IMPORTANCIA
CLINICA
18. Staphylococcus spp
Informar
Antibióticos
Ensayar
Orina
Otros
LCR
A
I
Ampicilina 10 µg
X
X
X
Ampicilina/sulbactama 10/10 µg
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
CXM
X
X
X
X
Oxacilina 1µg
X
Cefoxitina 30 µg
X
Cefalotina 30 µg
Gentamicina 10 µg
X
Eritromicina 15 µg
X
X
Clindamicina 2 µg
X
X
Rifampicina 5 µg
X
X
X
Trimetropina/sulfametoxazol 1,25/23,75 µg
X
X
X
Minociclina 30 µg
X
Vancomicina 30 µg
X
Ciprofloxacina 5 µg
X
Norfloxacina 10 µg
Nitrofurantoinas 300 µg
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
La resistencia del Staphylococcus a la oxacilina predice igual resistencia a todos los ATB
Beta-lactamicos, incluyendo cefalosporina de primera, segunda, tercera y cuarta generación,
inhibidores de beta-lactamasas y carbapenemes.
Frente al aislamiento de staphylococcus multi-resistente deberá ensayarse: Linezolid,
Quinupristina/Dalfopristina y nuevas fluorquinolonas.
X
19. Enterococcus spp
Antibióticos
Informar
Ensayar
Orina
Otros Sitios
X
Ampicilina (10 µg)
X
X
Gentamicina (120 µg)
X
X
Estreptomicina (300 µg)
X
X
Vancomicina (30 µg)
X
X
Teicoplanina ( 30 µg)
X
Ciprofloxacina (5 µg)
X
X
Nitrofurantoina (300 µg)
X
X
En los enterococos, la sensibilidad a ampicilina predice sensibilidad a las penicilina
asociadas a los inhibidores de beta-lactamasa (ampicilina/sulbactama,
amoxicilina/Clavulánico y peperacilina /tazobactama).
Frente al aislamiento de Enterococcus vancomicino-resistente deberá ensayarse:
Tetraciclina,
Cloranfenicol, Rifampicina, Linezolid, Quinupristina/dalfopristina y nuevas Fluorquinolonas.
Los discos de alta carga (Gentamicina 120 µg y estreptomicina 300 µg) se utilizan para
predecir sinergia entre Penicilina, ampicilina o Vancomicina y un aminoglucósido.
20. Streptococcus pyogenes
(grupo A)
Antibióticos
Ensayar
Informar
Fauces
Eritromicina
X
X
Clindamicina
X
Otras Localizaciones
X
X
En Streptococcus pyogenes el CLSI no recomienda ensayar penicilina ni ningún otro antibiótico betaLactamico, ni Vancomicina, ya que no se encontraron, hasta la presente cepas resistente.
La resistencia a eritromicina predice resistencia a roxitromicina, Claritromicina y azitromicina.
En pacientes con fascitis necrotizante se debe informar clindamicina a demás de penicilina , ya que en
estas situaciones deben utilizarse ambos antibióticos simultáneamente, dado que en esta infección los
microorganismos se presentan en un alto inóculo y en fase estacionaria.
21. Streptococcus pneumoniae
Antibiótico
Ensayar
Informar
Meningitis
Neumonía
Otitis
PEN, CRO/CTX
(CIM)
PEN
(CIM)
AMX/PEN
(CIM)
Oxacilina 1 ųg
X
Eritromicina 15 ųg
X
X
X
Clindamicina 2 ųg
X
X
X
Trimetoprima/sulfametoxazol 1.25/23.75 ųg
X
X
X
Tetraciclina 30 ųg
X
X
Rifampicina 5 ųg
X
X
Vancomicina 30 ųg
X
X
Oxacilina es el único antibiótico beta-lactámico que se debe ensayar en la prueba de sensibilidad por el
método de difusión en Agar.
Frente al aislamiento de cepas resistente a Oxacilina (halo ≤ 19) se debe realizar CIM a Penicilina para
determinar el nivel de resistencia.
•
La sensibilidad a Oxacilina predice sensibilidad a: penicilina, ampicilina, amoxicilina, cefotaxima, ceftriaxona,
cefepima, Cefixima, cefuroxima, imipemen y meropenem.
22. PROBLEMAS PLANTEADOS POR
LOS COCOS GRAM POSITIVOS
La resistencia bacteriana a los ATB esta relacionada:
A la calidad de las practicas higiénicas hospitalarias
(Staphylococos meticilino-resistente).
Al uso intensivo de ciertos ATB
(Enterococos glucopeptido resistente).
Al hacinamiento de pacientes
(Neumococo con sensibilidad disminuida a penicilina).
23. STAPHYLOCOCCUS
METILICINA RESISTENTE
Los SMR presentan en su membrana una PBP adicional
(PBP 2a) Gen mecA.
De Baja afinidad a los ATB beta-lactamico
Los SMR requieren mayor cantidad de cualquier ATB betalactamico para saturar las PBP.
Por ello son resistente a todos los beta lactamicos incluido los
carbapenemes.
24. Staphylococcus aureus
Meticilina Resistente (MRSA)
Incidencia incrementando en hospitales especialmente en UCI o
en pacientes con quimioterapia
Están comenzando a aparecer cepas Vancomicina Intermedia y
Resistente
Esta Emergiendo MRSA adquirido en la comunidad (CA-MRSA)
que aparece susceptible a muchos agentes orales
26. Propiedades Distintivas CA-MRSA
Resistente solamente a Meticilina con Resistencia cruzada
solamente a otros ß-lactamicos
Asoc. con Síndromes semejando a los causados por MSSA
Puede causar Infecciones Serias (fatales)
28. CA-MRSA Opciones de
Tratamiento
Clindamicina - Oral es el agente que se ha redescubierto para
Infecciones por CA-MRSA
CA-MRSA la prueba es usualmente susceptible a Clindamicina
El problema es cuando el microorganismos tiene una prueba de
susceptibilidad: Eritromicina-R y Clindamicina-S
Algunas cepas pueden tener Resistencia Inducible
29. DETECCION DE OXACILINA
RESISTENTE EN
STAPHYLOCOCCUS AUREUS
Método: Oxacillin Screening Agar
Agar Mueller Hinton con 4% de NaCl y 6µg/ml de Oxacilina.
Suspension bacteriana 0.5 McFarland
Sembrar sobre el agar 10 µl de la suspensión.
Incubar 24h a 35º C.
Crecimiento > 1 Colonia es positivo para Staphylococcus resistente a
Oxacilina.
La resistencia a la Oxacilina indica resistencia a todos los ATB ß
Lactamicos y ß-lactamicos asociados a los inhibidores de ß
lactamasas independientemente de su sensibilidad “In Vitro”
30. Punto de Corte establecido
por el CLSI para Oxicilina
DD (mm):
R
I
≤ 10
≤ 17
S.aureus
CoNS
S
11-12
-
≥13
≥18
MIC (µg/ml):
S
S.aureus
CoNS
≤2
I
-
≤ 0.25
R
≥4
-
≥0.5
31. Screen – Difusion de Disco para
Resistencia mediada por gen
mecA en Staphylococcus
Reemplazar disco de Oxacilina por disco de Cefoxitina.
Realizar método Estándar de Difusión de Disco con Disco de
Cefoxitina (30 ųg).
Incubar por 24 h. Los resultados pueden ser reportados despues de
18 h, si son resistentes.
Reportar el resultado para OXACILINA, no para Cefoxitina.
32. Staphylococcus spp.
“Los resultados de la prueba de Difusion de
Disco con Cefoxitina de 30 µg debe ser
usados para predecir la Resistencia
mediada por gen mecA en Staphylococcus”.
33. Punto de Corte establecido por
el CLSI para Cefoxitina (30µg)
Cefoxitina Zona (mm)
S.Aureus
R
≤ 21
S
≥ 22
CoNS
≤ 24
≥ 25
34. Staphylococcus spp.
Eritromicina / Clindamicina
Mecanismo
Eflujo
Alteración
Ribosomal
inducible
Alteración
Ribosomal
constitutiva
GEN
Eritro
Clinda
msrA
R
S
erm
R
S*
erm
R
R
35. “Test D” – Reacción Positiva
Resistencia Inducible
a Clindamicina
(mediada-erm)
Antibiograma por Difusión
de Disco:
Colocar discos de 2 µg
Clindamicina y 15 µg
Eritromicina a una
distancia de borde a
borde de 15 mm a 26 mm.
15 - 26 mm
36. “Test D” – Reacción Negativa
NO hay Inducción
(Resistencia a
Eritromicina:
Mediada por gen
msrA)
37. Staphylococcus Aureus con sensibilidad
Intermedia y Resistencia a
Vancomicina
Un Problema - Crítico
•
•
Vancomicina sigue siendo una droga
importante por no sólo tratar Infecciones por
Staphylococcus aureus, Staphylococcus
Coagulasa-negativa, Neumococos, y una
variedad de otros organismos Gram
Positivos.
Es muy importante descubrir la Resistencia
Emergente a Vancomicina.
38. VISA Fenotipo vs. VRSA Genotipo
Las cepas VISA representan un fenotipo que probablemente resulta de
mutaciones en varias vías genéticas, que bajo larga presión con
Vancomicina produce:
- Paredes celulares alteradas,
- Cambios en las vías metabólicas,
- Lento crecimiento.
En las cepas VRSA hay un cambio en el genotipo donde las cepas
adquieren el gen de resistencia vanA, muestra una pequeña perdida de
amplitud, y pueden transferir la resistencia de Vancomicina a otros
organismos
39. Criterios de Interpretación de la CLSI
Vancomicina y Staphylococcus spp.
Vancomicina
Disco (30 µg)
MIC (µg/ml)
Sensible
Intermedio
Resistente
≥ 15 mm
ND
ND
≤2
4-8
≥ 16
40. Metodo de Screening para
detectar mecanismo de
Resistencia a Vancomicina
Usar Placas de agar preparado comercialmente
Preparar una suspensión con 4 a 5 colonias en caldo o solución
salina a 0.5 McFarland, mezclar en vortex.
Usar asa calibrada de 1 o 10-µl o pipeta para inocular en la placa
(hasta 6 cepas/placa)
Dejar que el inóculo se absorba.
41. Metodo de Screening para
detectar mecanismos de
Resistencia a Vancomicina
Invertir las placas e incubar a 35ºC en ambiente aeróbico.
Examinar después de 16-18 hrs. de incubación; si no hay crecimiento,
re-incubar y examinar 24 horas después.
Crecimiento >1 colonia es positivo para VISA/VRSA
Confirmar identificación; no realizar MIC automatizado
42. Resistencia a Vancomicina –
Enterococcus spp.
Fenotipos más comunes:
Resistencia Adquirida
Van A:
Fenotipo de alto nivel de
resistencia a Vancomicina y
E. faecium
Teicoplanina.
Van B:
Bajo a alto nivel de resistencia
E. faecalis
solo a Vancomicina.
Resistencia Intrínseca
Van C:
Fenotipo asociado a bajo nivel de
E.gallinarum
resistencia a Vancomicina.
43. Criterios de Interpretación de la
CLSI para Enterococcus spp.
Agente
antimicrobiano
Resistente
Menor o =
Intermedio
Sensible
Mayor o =
Vancomicina 30μg
14
15 – 16
17
Ampicilina 10μg
16
-
17
Gentamicina 120 μg
6
7-9
10
Estreptomicina 300 μg
6
7-9
10
44. Streptococcus pneumoniae con
Sensibilidad disminuida a
Penicilina
La resistencia a la penicilina se debe a la alteración
de los PBP (gen en mosaico) y no por la producción
de beta – lactamasa.
45. Screen Difusión de Disco para
detectar Resistencia a la
penicilina en S.pneumoniae
Realizar método Estándar de Difusión de Disco en Agar MH sangre al 5%
con disco de Oxacilina (1µg).
Incubar a 35º C de 20-24 h.
En presencia de CO2 5%
Reportar los resultados para Penicilina, no para Oxacilina.
Punto de Corte: S ≥ 20 mm
Halos < 19mm
realizar CIM
46. RECORDEMOS
Que Lavarse las manos y utilizar
Correctamente los ATB reduce la
resistencia bacteriana.
Muchas Gracias !!!
Robafi30@hotmail.com
47. AUTOEVALUACION
Se reciben tres muestras de Hemocultivos: a las 48 hs son positivas, observándose en la coloración de Gram.:
cocos Gram. (+) en racimos y cortas cadenas.
¿Qué medios de cultivo elegiría?
EMB
Agar Tripteína soya
Agar sangre
Agar chocolate
Después de 24 hs de incubación a 35ºC, se observan colonias con iguales características y tinción de Gram.
coincidente con la anterior.
¿Cuál de las siguientes pruebas realizaría primero?
Dnasa
Coagulasa
Oxidasa
Catalasa
¿De cual de los medios de cultivo anteriores se puede realizar?
Se obtienen los siguientes resultados en las pruebas bioquímicas.
Dnasa (-)
Coagulasa (-)
Resistencias a Novobiocina (-)
Catalasa (+)
De que microorganismos se trata?
En este caso provienen de un paciente con catéter implantable sometido hace un año a transplante de medula
ósea
Informa:
Positivo
Se solicitan mas muestras
Negativo
Contaminado
48. Tipo de Muestra = Hueso
Microorganismo = Staphylococcus epidermides.
Eritromicina
Oxacilina
Vancomicina
Clindamicina
R 6mm
R 6mm
S 21mm
R 6mm
Gentamicina
S
Rifampicina
R
Trimeto/sulfametoxazol R
17mm
6mm
6mm
¿Cómo informaría cefalotina, con respecto al resultado de Oxacilina?.
49. Tipo de Muestra = Sangre
Microorganismo = Staphylococcus aureus
Ciprofloxacina
Eritromicina
Oxacilina
Vancomicina
R
R
R
S
6mm
6mm
6mm
19mm
Clindamicina
Gentamicina
Rifampicina
Trimeto/sulfametoxazol
R 6mm
R 6mm
S 34mm
S 27mm
¿Qué método utilizaron para predecir la resistencia a Oxacilina?
50. Tipo de Muestra = Sangre
Microorganismo = Streptococcus pneumoniae
Cloramfenicol
S 30mm
Eritromicina
Oxacilina
Tetraciclina
Vancomicina
S 22mm
S 23mm
S 25mm
Rifampicina
S 30mm
Trimeto/sulfametoxazol S 25mm
¿Se informaría Oxacilina?
S 32mm
51. Tipo de Muestra = Ulcera Externa
Microorganismo = Enterococcus faecalis
Ampicilina
Gentamici-Alta Carga
S 36mm
S 19mm
Eritromicina S
Vancomicina S
15mm
19mm
¿A que otros ATB es sensible este Enterococcus con relación al resultado de
ampicilina?
