aaa

1. Cromatografie Repere istorice
 1906 : Mikhail Tswett separa pigmenti vegetali
colorati din frunze pe o coloana umpluta cu carbonat
de calciu pulbere, pigmentii fiind antrenati cu eter de
petrol
 1940 : Martin si Synge dezvolta practica si teoria
cromatografica, obtinand premiul Nobel in 1952
 1952: punerea la punct a cromatografiei in faza
gazoasa (GC)
 1968 : punerea la punct a cromatografiei de lichide de
inalta performanta (HPLC)
 1979 : prima separare chirala prin HPLC
Prezentul material este folosit în scop didactic și se adresează în numai studentilor inscriși la acest curs.

2. Descrierea generala a metodei
Intr-o separare cromatografica, diferiti componenti ai unei probe
sunt transportati cu o faza mobila (gazoasa, lichida, sau fluide
supercritice). Faza mobila (eluent) trece printr-o faza stationara.
Solutii din proba se partitioneaza diferit datorita interactiilor cu
fazele mobila si stationara. Solutii care prezinta interactii mai
puternice cu faza stationara se vor deplasa mai lent prin aceasta, iar
cei care nu interactioneaza cu faza stationara se vor deplasa foarte
rapid.
eluent
Banda initiala ce
contine
componentii de
separat A et B
FS + FM
disc poros
eluat
B A

3. Termeni utilizati in cromatografie
• Faza stationara (FS) : imobilizata in coloana sau fixata pe un
suport plan
• Faza mobila (FM) : se deplaseaza in permanent contact cu faza
stationara
• Elutie : procesul prin care un component este antrenat prin
deplasarea fazei mobile care traverseaza faza stationara
• Viteza FM prin coloana este exprimata: prin debitul D-volumul
de solvent care traverseaza coloana in unitate de timp (mL/min)
sau prin viteza liniara u-distanta parcursa prin coloana in unitate
de timp (cm/min)

4. Cromatograma : reprezentarea variatiei compozitiei eluatului
in timp
semnal
Timp (min)

5. Clasificarea metodelor cromatografice
 In functie de fenomenele fizice care stau la baza proceselor de
schimb intre FM si FS:
 adsorbtie
 partitie
 schimb ionic
 excludere sterica
 afinitate biochimica
 In functie de natura fazei mobile:
 lichida
 gazoasa
 In functie de scop:
 cromatografie analitica
 cromatografie preparativa

6. Schema generala a instrumentelor
cromatografice
coloana (FS)
injector
debimetru detector
signal
temps
Traitement
du signal
Interpretare
semnal
temps
Intrare proba
de analizat
eluent lichid sau gazos (FM)
Iesire eluat

7. Marimi de retentie in cromatografie
• Timpul de retentie
• Volumul de retentie
• Coeficientul de distributie
• Factorul de retentie

8. Marimi de retentie in cromatografie
Timpi de retentie: tR
Timpul scurs intre momentul injectarii si acela al
aparitiei maximului picului cromatografic

9. Marimi de retentie in cromatografie
Timpi de retentie corectati : tR’
tR’= tR – tM
tM ou t0 : timp mort : timpul necesar unui component
neretinut sa traverseze coloana cromatografica

10. Marimi de retentie in cromatografie
Volumul de retentie VR sau volumul de elutie :
Volumul de faza mobila necesar pentru migrarea unui
component prin coloana:
VR = tR . D
D: debitul fazei mobile (constant)

11. Marimi de retentie in cromatografie
Coeficientul de distributie: KA
retentie
APM APS
elutie
KA
 raportul intre concentratia compusului in FS si
concentratia compusului in FM
 reflecta importanta relativa a fortelor intermoleculare
dintre compusul de analizat si cele doua faze
 
 PM
PS
A
A
A
K 

12. Marimi de retentie in cromatografie
Factorul de retentie k’ sau k
(sau de capacitate):
 Reflecta afinitatea coloanei pentru un component
 Este independent de debitul FM si de dimensiunile
coloanei
 k’ se poate determina din cromatograma
M
R
t
t
k'
'


13. Marimi de retentie in cromatografie
 tR = tM + tR’
 Pentru un compus neretinut pe FS:
tR = tM= tFM : timpul petrecut in FM
 tR’= tFS: timpul petrecut in FS
daca mT = mFM + mFS
 k’ este independent de mT
 
 
 
  PM
PS
A
PM
PM
PS
PS
PM
A
PS
A
M
R
V
V
.
K
.V
A
.V
A
m
m
t
t
k'
A




'

14. Marimi de retentie in cromatografie
Factorul de retentie k’ si tR :
tR = tM ( 1 + k’ )
tR = tM( 1 + K / β)
⇒ permite calculul coeficientului de distributie
In practica, k’ nu are valori mai mari decat 10
k’ < 1: compusul iese prea repede
k’ ≈ 2-5

15. Marimi de retentie in cromatografie
 permite precizarea pozitiilor relative ale doua picuri
consecutive:
 α este intotdeauna > 1
 α indica capacitatea unui sistem cromatografic de a
separa componentii
A
B
K
K
α 
A
B
k'
k'
α 
A
R
B
R
)
(t'
)
(t'
α 
Factorul de separare sau de selectivitate α

16. Marimi de retentie in cromatografie
Rezolutia
Rezolutia reflecta buna separare a picurilor consecutive.
Pentru doua molecule A et B :
W b = 4 
(A))
w
(B)
(w
2
1
(A)
t
(B)
t
R
b
b
R
R
S



timp
semnal
tR
Wb (A) Wb (B)
tR(A) tR (B)

17. Marimi de retentie in cromatografie
Rezolutia
RS = 1 daca tR = 4σ
O rezolutie de 1.5 este nécesara in analiza cantitativa ( tR = 6σ)
signal
temps
signal
2σ
3σ
4σ 6σ
Résolution = 1.5
Résolution = 0.50 Résolution = 0.75
Résolution = 1
temps

18. Efectul factorilor de capacitate si a
selectivitatii asupra rezolutiei
k’= factorul de capacitate mediu al celor doi compusi de separat
Cand α tinde spre 1
k'
1
k'
*
α
1
α
*
H
L
4
1
R



k'
1
k'
*
1)
-
(α
*
4
N
R



19. Calitatea unei separari
Doi factori contribuie la o buna separare
cromatografica:
 diferenta intre timpii de retentie
 largimea picurilor

20. Cum se optimizeaza o separare
cromatografica pe coloana ?
Scop: obtinerea gradului de separare dorit in timpul cel
mai scurt
 Cresterea lui N
 Modificarea lui k’
 cresterea lui α
k'
1
k'
*
α
1
α
*
N
4
1
R




21. Cum se optimizeaza o analiza cromatografica
pe coloana?
Scop : obtinerea rezolutiei dorite intr-un minim de timp
 Cresterea lui N:
 ↗ L : daca L se dubleaza, atunci R creste cu √2
dar durata separarii creste
 ↘ H :
• ↘∅ particule suport (↘termenul A )
• ↘∅ coloanei (↘ termenul C)
• ↘T°(GC) (↘ termenul B)
• ↘ grosimea filmului lichid(GC) (↘ termenul C)
• ↘ viscozitatea FM ( HPLC) (↘ termenul C)
• optimizarea lui u ( viteza liniara a FM)

22. Cum se optimizeaza o analiza cromatografica
pe coloana?
 Modificarea lui k’:
 k’B optim: 1-5
 evitarea k’B >10 (durata de elutie mare)
 Modificarea lui T° (GC)
 Modificarea compozitiei FM (HPLC)
 Diminuarea grosimii filmului lichid si cresterea diametrului intern al
coloanei (modificarea lui  in GC)
 Cresterea lui α cat mai aproape 1 (mentinerea 1< k’< 10)
 modificarea T° coloanei
 modificarea compozitiei FS
 modificarea compozitiei FM (HPLC)

23. Cum se optimizeaza o analiza cromatografica
pe coloana?
Modificarea k’ in cursul elutiei :
 Cu un gradient de compozitie sau raportul de combinare al solventilor:
cresterea gradata sau continua a tariei eluentului in cursul elutiei (HPLC)
 Modificarea lui k’, α si H
 Reducerea lui N si R
 Prin programarea temperaturii:
cresterea gradata sau continua a temperaturii coloanei pe durata elutiei
(GC)
 Modificarea lui k’, α si H
 Reducerea lui N si R

24. Picuri asimetrice?
pic gausian ↔ K = CS/CM independent de
concentratia compusului in coloana
pic asimetric daca K variaza in functie de concentratia
in solutie

25. Picuri asimetrice
Asimetria picului este reflectata de
doi parametri:
 factorul de trena sau de tailing
(Ft sau TF)

26. Picuri asimetrice
 factorul de asimetrie
(Fa sau As)
Valori normale: intre 1.0 si 1.5
Pentru o coloana noua
valorile sunt usor mai mari decat
in conditii reale

27. Picuri asimetrice ?
 Fronting sau difuzia
frontala:
Ft <1
Fa<1
 Tailing sau efectul de
trena:
Ft >1
Fa>1

28. Degradarea fazei stationare
Performantele unei coloane sunt evaluate prin:
 Factorul de retentie al unui standard (k’)
 Numarul de talere (N)
 Asimetria picurilor

29. 29
Relatii de baza in cromatografie

30. Analiza calitativa
In general timpul de retentie al solutului este un
indicator calitativ al analitului respectiv, fiind in
general comparat cu acela al standardului.
Daca atat standardul cat si analitul au acelasi timp de
retentie, acest lucru reprezinta o indicatie ca pot fi
identici.

31. Analiza cantitativa
Separarile cromatografice ofera informatii extrem de
precise din punct de vedere cantitativ, in acest scop
putand fi utilizate atat ariile, cat si inaltimile
picurilor.
In general ariile picurilor sunt mai mult utilizate in
analiza cantitativa, deoarece integrarea ariilor ofera
informatii mai exacte referitoare la concentratii.

32. Metoda standardului intern
Incertitudinile legate de injectarea probelor pot fi
evitate prin utilizarea standardelor interne.
In aceasta metoda, o cantitate cunoscuta de standard
intern se adauga atat in solutia etalon, cat si in proba
de analizat, masurandu-se raportul semnalului
analitului fata de semnalul standardului.

33. Proprietatile unui compus ce poate fi utilizat ca standard
intern includ:
Timpii de retentie ai standardului intern si ai analitului
trebuie sa fie diferiti, iar cele doua picuri trebuie sa
fie bine separate, R >1.25
Factorul de raspuns al detectorului pentru analit si
pentru standardul intern trebuie sa fie acelasi.
Utilizarea standardelor interne imbunatateste precizia
masuratorii cu cel putin 1%.

34. Metoda normalizarii ariei
Aceasta tehnica elimina incertitudinile asociate injectarii
probelor. In aceasta metoda este necesara elutia completa
a tuturor componentilor, ariile acestora fiind integrate si
calculate in functie de raspunsul detectorului.
Concentratia analitului reprezinta raportul dintre aria
corectata a picului si suma ariilor celorlalte picuri.
Metoda este mai putin versatila fata de metoda
standardului intern, fiind foarte importanta definirea
factorului de raspuns si modul de calcul al acestuia.

35. Se pot utiliza doua modalitati de calcul:
Factorul de raspuns de masa = %wt(standard)/Aria
(standard)
In acest caz, factorul de raspuns trebuie multiplicat cu
aria compusului necunoscut.
Sau:
Factorul de raspuns al detectorului = Aria (standard)/wt
(standard)
In acest caz factorul de raspuns trebuie impartit la aria
compusului necunoscut.

36. Referinte bibliografice:
"Quantitative Chemical Analysis", D.C. Harris, Freeman, 6th Edition, 2003.
" Practical problem solving in HPLC" , S. Kromidas, WILEY-VCH, 2005
« Analiza instrumentala - Aplicatii», Ion Ion, Alina Catrinel Ion, Dragos
Stefan Nicolae, Editura Printech, Bucuresti, 2007
« Metode de separare si analiza cromatografica », Victor David, Andrei
Medvedovici , Editura Universitatii din Bucuresti, 2007