1. UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN
Facultad de Ciencias Químicas
Microbiología de alimentos
PRACTICA Nº 5: “Análisis Microbiológico de enlatados y conservas”
Muestra: lenteja en lata
Analista: Leda Magali Torres Lomaquis.
Realizado el miércoles 03/10/12, Temperatura: 26ºC.
Objetivo del análisis:
Conocer el fundamento del Análisis Microbiológico de Enlatados y
Conservas.
Enumerar las bacterias contaminantes Enlatados y Conservas.
Establecer la importancia del control de las alteraciones microbianas
de Enlatados y Conservas.
Principio o fundamento:
Se llama conserva al resultado del proceso de manipulación de los alimentos de tal
forma que se evite o ralentice su deterioro (pérdida de calidad, comestibilidad o
valores nutricionales). Esto suele lograrse evitando el crecimiento de levaduras,
hongos y otros microorganismos, así como retrasando la oxidación de las grasas que
provocan su enranciamiento. Las conservas también incluyen procesos que inhiben la
decoloración natural que puede ocurrir durante la preparación de los alimentos, como
la reacción de dorado enzimático que sucede tras su corte.
Muchos métodos de elaboración de conservas incluyen diversas técnicas de
conservación de los alimentos. Las conservas de frutas, por ejemplo elaborando
mermeladas a partir de ellas, implican cocción (para reducir su humedad y matar
bacterias, hongos, etcétera), azucarado (para evitar que vuelvan a crecer) y envasado
en un tarro hermético (para evitar su contaminación).
Son aspectos importantes de las conservas mantener o mejorar los valores
nutricionales, la textura y el sabor, si bien históricamente algunos métodos han
alterado drásticamente el carácter de los alimentos conservados. En muchos casos
estos cambios han pasado a ser cualidades deseables, como es el caso de los quesos,
yogures y encurtidos,
Definición y características de la muestra:
Muestra: lenteja en lata
Definición: la lenteja es una planta de la familia de las papilionáceas, utilizada en la
alimentación por el valor alimenticio de las semillas encerradas dentro de las vainas. Es
una planta cultivada en muchos lugares del mundo que puede encontrarse
asilvestrada.
Vías de contaminación de la muestra.
Cuando la contaminación es anterior al tratamiento, es posible predecir el microorganismo
responsable si se conocen bien la naturaleza del alimento y las condiciones a las que se ha
sometido dicho alimento. Sin embargo, los microorganismos que se introducen por fugas
pueden ser muy variados al igual que la composición de los medios de enfriamiento.
Dado el tratamiento del alimento enlatado y su alto ph las bacterias contaminantes de
enlatados son bacterias esporuladas, bacterias no esporuladas, levaduras y mohos.
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Descripción de equipos, materiales, medios de cultivo, reactivos.
Equipos:
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Autoclave: es un recipiente metálico de paredes gruesas con un cierre
hermético que permite trabajar a alta presión para realizar una reacción
industrial, una cocción o una esterilización con vapor de agua. Su construcción
debe ser tal que resista la presión y temperatura desarrollada en su interior. La
presión elevada permite que el agua alcance temperaturas superiores a su
punto de ebullición. La acción conjunta de la temperatura y el vapor produce la
coagulación de las proteínas de los microorganismos, entre ellas las esenciales
para la vida y la reproducción de éstos, cosa que lleva a su destrucción. La
palabra autoclave no se limita a los equipos que funcionan con vapor de
agua ya que los equipos utilizados para esterilizar con óxido de etileno se
denominan de la misma forma.
• Stomacher: Homogeneizadores eficaces para la manipulación de polvos y
suspensiones semisólidas y líquidas. La muestra no entra en contacto con
ninguna parte del instrumento. Mediante el movimiento de las palas se
comprime el contenido de la bolsa estéril; el resultado es una homogenización
y un acabado pastoso del contenido de la bolsa que permite su distribución.
Higiénico, riesgo de infección mínimo
Mezcla/homogeneización en una bolsa de plástico transparente esterilizada
No se utilizan aerosoles durante la mezcla
Excelente recuperación de bacteria.
• Estufa: aparato eléctrico utilizado para la incubación de muestras microbianas:
bacterias, hongos, cultivos celulares, con el fin de dar las condiciones
necesarias de temperatura a las cuales crezcan satisfactoriamente
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Espátula drigalsky: es una varilla fina, acodada en ángulo recto en uno de sus
extremos, en forma de L o triangulo equilátero. Se utiliza para inoculación masiva
de placas (impregnación), aunque su uso es muy limitado.
Mechero: es un instrumento utilizado en laboratorios científicos para calentar o
esterilizar muestras o reactivos químicos.
Placas de Petri: Es un recipiente de cristal o de plástico , que consta de una base
circular, y las paredes son de una altura baja aproximadamente de (1 cm) ; y una
cubierta de la misma forma pero algo mas grande de diámetro para que encaje
como una tapa. Los hay de diferentes diámetros, los más utilizados en el
laboratorio son los de 10 cm de diámetro. Se utiliza en los laboratorios
principalmente para el cultivo de cristales ,en los laboratorios de biología se utilizan
para el cultivo de bacterias o microrganismo
Micropipetas: es un instrumento de laboratorio empleado para succionar y
transferir pequeños volúmenes de líquidos y permitir su manejo en las distintas
técnicas analíticas. Los volúmenes captables por estos instrumentos varían
según el modelo. Es de destacar que el uso de micropipetas permite emplear
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distintos líquidos sin tener que lavar el aparato: para ello, se emplean puntas
desechables, de plástico, que habitualmente son estériles.
•
Incubadora: En microbiología una incubadora es un equipo cerrado que
permite controlar la temperatura, humedad y otras condiciones necesarias
para el desarrollo de un cultivo microbiológico. Las incubadoras más simples
son cámaras aisladas con temperatura ajustable que típicamente va de 20º a
65º C, aunque pueden alcanzar temperaturas mayores, generalmente hasta
100º C. Los modelos más sofisticados incluyen la posibilidad de refrigerar el
contenido, controlar la humedad, y el nivel de dióxido de carbono. La mayoría
de los equipos incluye un temporizador programable, para realizar ciclos de
temperaturas variables al igual que de los otros factores ambientales.
•
Contador de colonias: Un contador de colonias es un instrumento utilizado para
contar colonias de bacterias o de otros microorganismos que crecen en una placa
de agar. Los primeros contadores sólo eran superficies iluminadas sobre las que se
colocaba la placa, con las colonias marcadas con un rotulador en la superficie
externa de la placa mientras el operador realizaba el recuento manual. Los
contadores más recientes intentan contar las colonias por vía electrónica, mediante
la identificación de áreas individuales de oscuridad y luz, de acuerdo a los umbrales
definidos por el usuario, contando los puntos en los que se aprecia contraste, o de
modo automático mediante registro electrónico tras presionar con cualquier tipo
de marcador.
Reactivos.
•
Agar P.C.A.: es un medio de cultivo utilizado para evaluar o monitorear "total"
o viable el crecimiento de bacterias de una muestra. PCA no es un medio
selectivo. La composición de la placa de agar recuento puede variar, pero
típicamente contiene :
0,5% de peptona
0,25% de extracto de levadura
0,1% de glucosa
1,5% de agar
pH ajustado a la posición neutra a 25 C.
• Agar SABOURAUD: Medio utilizado para el aislamiento, identificación y
conservación de hongos patógenos y saprófitos. También es útil para el cultivo de
levaduras.
Composicion(en gramos por litro):
Pluripeptona 10, glucosa 40, cloranfenicol 0.05, agar 15, con un pH final de 5,6
•
Agar PEPTONADA: Medio usado como diluyente y para enriquecimiento
bacteriano a partir de alimentos y otros materiales de interés sanitario. Medio
de enriquecimiento no selectivo, recomendado para ser utilizado en lugar de
solución fisiológica para recuperar células de enterobacterias dañadas por
procesos fisicoquímicos, a los que ha sido sometido el alimento. Si es utilizado
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•
•
como medio base para la fermentación de hidratos de carbono, se debe
adicionar el indicador de Andrade y el hidrato de carbono en cuestión.
Composición (en gramos por litro): peptona de carne 10, cloruro de sodio 5, pH
final 7.2.
Agar Bacillus Cereus: Medio diagnóstico selectivo utilizado para el aislamiento
y recuento de Bacillus cereus en alimentos. Bacillus cereus, ha sido implicado
en toxoinfecciones alimentarias, particularmente asociado al consumo de arroz
contaminado, y también en algunos procesos infecciosos en seres humanos y
animales. En el medio de cultivo, el contenido de peptona es bajo (0.1%), y la
adición de piruvato de sodio y emulsión de yema de huevo mejora el
aislamiento y esporulación de esta bacteria. Para verificar la utilización del
manitol, se usa un indicador de pH, azul de bromotimol. Este medio es
selectivo, por el agregado del suplemento para Bacillus cereus con el que se
obtiene una concentración final de 100 U de Polimixina B por ml de medio.
Agar Clostridium Sulfito Reductor: Medio utilizado para el cultivo y recuento
de colonias de Clostridios sulforreductores en alimentos. El medio de cultivo es
altamente nutritivo y permite un adecuado desarrollo bacteriano. El almidón
promueve la esporulación de la bacteria, la resazurina es el indicador redox que
vira al color rojo a altos potenciales de oxido-reducción, indicando condiciones
aeróbicas. La cisteína es el agente reductor y el sulfito de sodio y el citrato de
hierro se usan como sistema indicador de la reducción de sulfito por los
clostridios sulforreductores. Por reducción del sulfito se genera SH 2 , el cual
reacciona con los iones Fe3+ y se forma un precipitado de color negro
Descripción de la metodología de trabajo
1. Técnica de toma de muestra
Los envases deben estar perfectamente limpios, secos y estériles. Su tamaño guardara
relación con la muestra que se desea tomar. Serán herméticos e inaccesibles a
cualquier contaminación posterior a su esterilización.
2. Transporte de la muestra
Para el almacenamiento y el transporte de las unidades de muestras, se necesita un
envase estéril, que tenga capacidad suficiente. Transportar las muestras directamente
al laboratorio para realizar el proceso de dilución de ser necesario y posterior
incubación. Las muestras enlatadas o desecadas no necesitan refrigeración.
3. Preparación de la muestra:
Se pesan 10 gramos de la muestra que la misma sea de distintas partes de la
porción total de muestra, en una bolsa estéril, agregar 45 ml de agua peptonada y
llevar a la parte delantera del stomacher. Colocar en régimen normal durante 30
seg., colocar 45 ml más de agua peptonada y llevar a la parte trasera del stomacher
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en régimen normal durante 30 seg más. Se tiene así la dilución 1/10. Se utiliza solo
una dilución por dado la poca carga microbiana de los enlatados.
4. Análisis microbiológico
• Partiendo de la serie de diluciones decimales, se transfieren 0,1 ml de la dilucion a
las placas con los determinados medios de cultivo. Hacer esto por triplicado.
• El inoculo se disemina por toda la superficie del agar, sin romperlo con ayuda de un
extensor estéril.
• Después de que el inoculo sea absorbido, colocar las placas en estufa regulada a 36
ºC,y para los hongos y levaduras a 25 ºC; evitando que estén apiladas en exceso y
que entren en contacto con las paredes de la estufa. El periodo de incubación es de
24 a 48 hs.
• Trascurrido el tiempo de incubación, se hace el recuento de colonias en placa.
Cálculos.
La formula utilizada es:
UFC/gr= nº de colonias
v. i x fd
donde:
v. i.: volumen inoculado= 0,1 ml
fd: factor de dilución.
Agar
PCA
SAB
SPS
BC
fd
1.10-1
AUSENCIA
≤20 colonias
AUSENCIA
AUSENCIA
Agar SAB:
UFC/gr≤ 20/(0,1x0,1)≤ 2.103
Resultados de la práctica.
Nombre de la Bacteria
Criterio Microbiológico
Resultado
UFC/gr
ausencia
3
≤ 2.10
ausencia
ausencia
Aerobios mesofilos totales
Hongos y Levaduras
Bacillus Cereus
Clostridium Sulfito Reductores
Condición de la lata antes de su análisis
No se encontraba abollada, ligeramente oxidada en los bordes, no presentaba grietas. Solo
aparecía la fecha de vencimiento de la misma.
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Condición de la lata después de ser sometida a 37º durante 2 meses
La lata se encontraba en la misma condición que al principio, excepto que se encontraba
ligeramente mas oxidada que al principio. El ph medido fue de 5 y se realizo con papel
indicador.
Conclusión.
Mediante la práctica se pudieron identificar las bacterias contaminantes de los productos
enlatados y conservas. Era de esperarse la poca flora microbiana, dado el tratamiento
térmico antes y el proceso de pasteurización de la misma. Además la acidez alta de los
productos enlatados en general, inhibe el crecimiento de los microrganismos. La
estabilidad del envase conteniendo el alimento también se evidencia dado los cambios
mínimos sufridos mantenidos a 37º durante aproximadamente 2 meses.
Bibliografía.
• Frazier, W.C., Westhoff,D.C.. Microbiología de los Alimentos. Cuarta edición.
Editorial Acribia S.A. Año: 1993
•
Microbiología Alimentaria: Metodología Analítica para Alimentos y Bebidas.
María del Rosario Pascual Anderson,Vicente Calderón y Pascual.
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