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  • 1. Página 1Biotecnología de proteínasProteínas usadas en la salud humanaPreparaciones hormonales Insulina, glucagon, hGHProductos de la sangre Factores de coagulación, hSACitokinasInterleukinas, interferonesEnzimas Urokinasa, asparaginasa, tPAVacunas HBsA, HVAnticuerpos monoclonales Contra varios antígenos.Proteínas de usos industrialesENZIMA APLICACIÓN INDUSTRIAL Proteasas Detergentes Fabricación de quesos Industria de la cerveza Industria del cuero y carne Digestivos para consumo humano y animalAMILASAS Industrias de procesamiento de almidón Celulasas/hemicelulasas Industria de la cerveza Producción de jugos Aditivos para la alimentación animalPECTINASAS Industrias procesadoras de frutas Producción de jugosLIPASAS Industria Láctea Industria de aceites vegetalesGLUCOSA ISOMERASA Producción de jarabes de alta fructosaLACTASA Hidrólisis de lactosa de lecheCICLODEXTRINGLICOSILTRANSFERASA Producción de ciclodextrinaPENICILINACILASA Producción de penicilinas semisintéticasDownstreamprecessingRecuperación y producción del productoEl downstreamprocessing no solo involucra la recuperación y purificación del producto sino también la evaluación del control de lacalidad, estabilización del producto final y ajuste de potencia.NUNCA SE PURIFICA MAS DE LO NECESARIO Reducen la estabilidad biológica Disminuyen el rendimientoCaracterísticas del producto Costo razonable Rendimiento máximo Pureza adecuadaConstrucción de unorganismorecombinante.INGENIERIAGENÉTICAObtención delproducto.FERMENTACIÓN.Recuperación ypurificación delproducto.PURIFICACIÓN.Eliminacion dedesperdicios.TRATAMIENTO DEEFLUENTES
  • 2. Página 2 Propiedades físico químicas y biológicas deseadasLas proteínas se clasifican en dos grandes grupos Terapéuticas y diagnostico  alto grado de pureza y pequeñas produccionesEnzimas para alimentación y bebidas  baja purezaEscalado del proceso de purificaciónSe inicia de acuerdo con las necesidades del mercado. Protocolo escala laboratorio Estudios en planta piloto Proceso en escalaTécnicas de recuperación y producción de productosRecuperación Comprende la remoción de los componentes gruesos, como las células de un medio de cultivo en el caso de un productoextracelular o de las proteínas contaminantes que están en mayor proporción. Son bastante generales y se aplican en casi todos los casos. Una vez que el producto ha sido recuperado, a veces es necesario purificarlo. Recuperación es sinónimo de aislamiento o enriquecimiento.PurificaciónLos métodos utilizados son muy dependientes del producto en particular y de su uso: Van ser distintos si se quiere purificar una pequeña molécula orgánica soluble ensolventes orgánicos que una enzima solubleen agua. Además, también serán diferentessegún que el producto sea para uso industrial o farmacológico inyectable. Las técnicas de purificación son más sofisticadas por naturaleza, más lentas, y procesanmenores volúmenes de material. Algunas técnicas de recuperación pueden ser usadas en operaciones de purificación.Técnica de separación Recuperación PurificaciónCentrifugación XFiltración XUltrafiltración X XPrecipitación X XPartición X Xcromatografía XParámetros de evaluación de la purificaciónRendimiento oPureza yFactor de purificaciónCosto
  • 3. Página 3Separación sólido-liquido (Sedimentación ycentrifugación)En los biorreactoes los microorganismos están suspendidos como células simples, fóculos o micelios. Un proceso de separación sólido-líquido consta:PretratamientoPara facilitar la operación, reducir la viscosidad y romper las estructuras gelatinosas. Ayudan a incrementar el tamaño de lapartícula a través de diferentes efectos como puede ser la neutralización de cargas o la generación de redes 3D a través de iones Ca.Al, Fe o polímeros naturales o sintéticos. También se usa el cambio de pHFísicos: Térmicoo Floculacióno EsterilizaciónQuímicos: Floculanteso Iones inorgánicos / pHo polielectrolitos Ayuda filtroso Tierra diatomeaso Perlas de vidrioSistemas mecánicos de separación solido-liquidoSedimentacionSe basa en el movimiento de una partícula sólida en un líquido por la gravedad. Si las partículas tienen entre 5 a 50 µm puedenusarse decantadores, si son mas pequeñas se necesitarán separadores centrífugos u otros. Hay que tener en cuenta la diferencia dedensidad ente el sólido y el líquido.CentrifugaciónSepara sustancias de diferente peso específico. Aplicaciones: Separación de biomasa Eliminación de desechos celulares Separación de proteínas Separación de matrices cromatograficas en batch Recuperación de cuerpos de inclusiónPretratamiento Concentración SeparaciónPost-tratamiento
  • 4. Página 4Filtración centrífugaSepara por filtración donde la fuerza impulsora en lugar de ser una diferencia de presión es la centrífuga.Centrífuga canasta Puede manejar un caldo con 1 – 5 % de sóldios Trabaja en el rango de 5000 – 9000 gSedimentación centrífuga Centrífuga tubular Centrífuga de cámara múltiple Centrífuga de tazón sólido Centrífuga de tornillo o decantadora Centrífuga de discosCentrífuga tubular Mas eficiente y sencilla Contenido de sólidos < 0,5% Aceleración 12000 – 62000 g / alimentación 100 1/hr – 3500 1/hrCentrífuga de cámara multipleAumenta la superficie del rotor por el agregado de rotores concéntricos. La velocidad de rotación es menor pero se compensa enparte con el aumento del radio. 2 a 6 cámaras Contenido de sólidos 1 – 5% 5000 – 9000 gCentrpifuga de razón sólidoLos sólidos son eliminados continuamente a través de un tubo ubicado sobre la superficie interna de la cámara. Sin embargo paraque los sólidos puedan ser removidos continuamente deben tener una proporción de líquido. Permite trabajar de forma continua Contenido de solidos entre 1 – 5 %Centrífuga decantadoraIdeal para suspensiones con alto contenido de sólidos Descarga de sólidos entre 30 kg/hr – 60000 kg/hr Contenido de sólidos entre 2 – 60% Aplicación principal: tratamiento de aguas residualesCentrífuga de discosSe aumenta de manera muy importante la superficie de sedimentación. Es la ms usada en bioseparaciónes Flujo entre 0,5 – 1500 1/hr Contenido de sólidos:o 1% centrífuga de retencióno <10% centrífuga de descarga intermitente y continua 5000 – 15000 g
  • 5. Página 5ResumenTipo decentrífugaTamañopartículaContenido desólidos (%)Prueba desedimentaciónPrueba deconsistencia desólidosFlujo dealimentación(L/min)Fuerza g. maxTubular 0,1 – 200 ≤ 0,5 2 – 20 Torta firme 8 – 120 12000 – 16000Cámara simple 0,5 – 5000 1 – 5 2- 20 Torta firme 1,5 – 335 5000 – 9000Discos yboquillas0,5 – 200 2 – 20 1 – 10 Lodo 30 – 3780 5000 – 8500Discos de tazónabierto0,5 – 200 ≤ 10 1 – 10 Lodo 3,8 – 1500 5000 – 7000Discos yboquillas0,5 – 200 ≤ 10 1 – 10 Lodo 3,8 – 570 1400 – 1500Discosintermitente0,25 – 200 ≤ 1 1 – 10 Torta firme 0,4 – 1500 500 – 800Tazón solido 2 – 5000 1 – 5 0 – 3 Torta firme 1,5 – 250 500 – 800decantadora 2 – 5000 2 – 60 0 – 3 Lodo – torta 3,8 – 1900 2000 – 3200Fundamentos de la sedimentación y centrifugaciónEl número de Reynolds relaciona las fuerzas inerciales y de fricción. Los sitemas que vamos a analizar están entre la condición deRe<1 por lo tanto corresponden a la zona conocida como de resistencia viscosa y la fuerza de fricción se puede calcular a través de laley de Strokes (solo para partículas esféricas) y teniendo en cuenta que_ Las partículas están en una suspensión muy diluida La sedimentación no es influenciada por otras partículas Re<1Encontramos que la velocidad de sedimentación es:Y la velocidad de centrifugación es: Donde = velocidad angular de la centrífuga R= radio del rotor de la centrífuga Dp= diámetro de partícula µ= viscosidad ρ= peso específico de la partículaLa viscosidad para la mayoría de los caldos bacterianos esta entre 1 y 2 cP dependiendo de la composición del medio. Cuando hayácidos nucleicos aumenta. La diferencia de peso específico en general es muy pequeña ya que las bacterias están constituidas por un70-80% de agua. µ≤1. El diámetro de partícula es el principal factor que controla la eficiencia de la centrifugación. Al centrifugarcosas de menor tamaño, hay que aumentar para mejorar la centrifugación.El tiempo de sedimentación se puede calcular usando la siguiente ecuación:
  • 6. Página 6Si se conoce el radios inicialR0 y el radio final R1de la centrífuga.Factor GEl factor G permite relacionar la velocidad de sedimentación con respecto a la gravedad:Se usa para calcular el tiempo equivalente de centrifugación para producir una sedimentación aceptable.Como determinar el flujo óptimo de alimentación de una centrífuga tubularEl tiempo que permanece la suspensión dentro de la centrífuga (tiempo de residencia) debe ser mayor o igual al tiempo desedimentación de la/s particula/s que deseamos sedimentar. Tiempo de Residencia > sedimentaciónEl cauldal depende del caldo de cultivo y de los parámetros de la centrífugaVELOCIDAD DE SEDIMENTACIÓN: depende del caldo de cultivoPARÁMETROS DE LA CENTRÍFUGA: depende de la centrífuga (Σ) que depende de la geometría de la centrífuga.Σ= área equivalente de sedimentaciónTodos los parámetros excepto g dependen de las características geométricas de la centrífugaHay que sedimentar una partícula hasta el 50% del volumen de una partícula determinadaEscaladoLa velocidad de sedimentación es constante e independiente de la escala de trabajo. Y como no hay correspondencia entre lascentrífugas, la velocidad de sedimentación es:Operación de centrífugas continuasHay que tener 3 factores en cuenta, la generación de calor, de aerosoles y de ruido.
  • 7. Página 7FiltraciónSepara un sólido de un fluido por acción de un medio filtrante y una diferencia de presiónMétodos tradicionalesFiltración en lecho profundoLos sólidos se depositan en el interior del filtroFiltración convencionalLos sólidos se depositan en la superficie del filtro formando una torta. Se puede clasificar según:La fuerza impulsora Gravedad Vacío Fuerza centrífugaEl mecanismo Formación de una torta De profundidadEl producto Retentato (torta) Filtrado (clarificado)El modo de operación En batch En continuoTipos de equiposFiltro prensa Simplicidad de operación Bajo costoOpera bajo presión positiva donde los sólidos se acumulan en el filtro mientras el permeato fluye a través de las placas filtrantes ysale a una cañería colectora de los canales de flujo. Los sólidos son posteriormente recuperados separando las placas y lavandomanual o semiautomáticamente cada placa. Las placas deben ser limpiadas en ciclos.Filtro de cámaraPosee una mayor superficie de filtración y se los utiliza en el caso de que los filtro prensa tengan un bajo flujo de operación.Filtro de tambor rotatorioLa fuerza impulsora es el vacío (presión negativa de filtración) que se produce en el interior de un tambor hueco. El tambor rota yparte de éste está sumergido en un contenedor donde se encuentra la suspensión a filtrar. Es un equipo de filtración continua y máscomplejo de operar.Métodos modernosLa retención ocurre solo en la superficie.Sistemas de filtración de membranaLas membranas filtrantes son de 3 materiales distintos: Celulosa modificada (acetatos, nitratos, etc)
  • 8. Página 8 Polímeros sintéticos (polisulfona, polipropileno,polietileno, etc) Minerales (óxidos de Al y/o Zr)Microfiltración (MF) Rango de partículas 0,1 – 10 µm No retiene macromoléculas disueltas Se utiliza para esterilizar líquidos o gases Presión de operación: <2 barUltrafiltración (UF) Discriminan macromoléculas disueltas en soluciónque se clasifican de acuerdo al PM minimo de unamolécula globular que puede retener (MWCO) Rango de poros 5 – 300 kDa Son usados para concentrar, diafiltrary fraccionarproteínas Reemplaza a la diálisis en el escalado Presión de operación: 1-10 barNanofiltración Las membranas retienen iones divalentes y pequeñasmoléculas orgánicas Se usa para la purificación de agua para usofarmacéutico y biotecnológico Presión de operación: 5-35 barOsmosis reversa Las membranas son capaces de retener iones ypequeñas moléculas orgánicas. Se usan para purificar el agua para uso farmacéuticoy biotecnológico Se usan presiones más altas porque hay que vencesla fuerza osmótica Presión de operación: 15-150 barElectrodiálisis Se emplean membrana intercambiadoras de ionespero impermeables al agua. La separación es forzadapor un campo eléctrico a diferencia de la filtraciónque es conducida por la presión. Se usa para eliminar NH3 y lactatoMWCOSe refiere al menor PM que es retenido por la membrana¿Cómo se mejora el flujo de filtración? En UFAumentar la PTM o aumentar el área del filtroParámetros importantes en filtración con membranas
  • 9. Página 9La PRESIÓN OSMÓTICA depende del MW y de la concentración del componente.TEST DEL PUNTO BURBUJA: se usa para caracterizar una membrana y monitorear la consistencia y calidad, se basa en la determinaciónde la presión mínima en el cual el líquido es eliminado por presión formando una burbuja.TAPONAMIENTO: deposición de sustancias sólidas sobre la superfice de la membrana lo que produce la disminución del filtrado y sucalidad.THROUGHPUT: evalúa la capacidad de filtración durante la vida de un filtro.El flujo es proporcional a la presión transmembránica e inversamente proporcional a las resistencias al pasaje del líquido RM = resistencia de la membrana RPB = resistencia de la bloqueo del poro (importante en MF)
  • 10. Página 10 RAds = resistencia por adsorción (importante en UF) RKP = resistencia de un gradiente de concentración (importante en MF) Rgel = resistencia de la formación de gel (importante en UF)Nuevos sistemas reducir el taponamiento Sistema de fibras huecas helicoidales MembranasvibrantesNuevas técnicas para mejorar la separaciónHPTFF (High Performance Tangencial FlowFiltration)Agrega la interacción electrostática al efecto estérico: Modificando el pH y la fuerza iónica de la solución se modifica el tamaño real de las proteínas. Membranas de UF con carga electrostáticaDiferencias con la centrifugación Evita la formación de aerosoles por ser sistema cerrado La mayor limitación es el taponamiento que puede ocurrir por ciertas proteínas que se absorben en la membrana o desechoscelulares que forman una capa fina sobre la membrana o compuestos químicos usados como antiespumantes que bloqueanlos porosTamaño de partícula a separar A medida que aumenta el diámetro de la partícula a separar, el costo de separación por centrifugación cae, mientras quepara la filtración no se ven afectados. La UF no tiene competencia con la centrifugación ya que esta última no permite separar componentes solubles.
  • 11. Página 11Ruptura celularObjetivos de esta etapa: Maximizar la liberación del producto Evitar la desnaturalización y/o inactivación, la degradación térmica, alteraciones secundarias como oxidación,proteólisis Maximizar la velocidad de liberaciónMétodos FísicosMecánicos Agitación con abrasivos Homogenización a alta presión Extrusión por presiónNo mecánicos Shock osmótico Congelamiento- descongelamiento Sonicado SecadoMétodos químicos Tratamiento con álcali Tratamiento con solventes Tratamiento con detergentes Tratamiento con ácidos Tratamiento con sustancias caotrópicasMétodos biológicos Lisis enzimática Inhibición de la síntesis de pared celular Fagos VirusFactores a tener en cuenta al seleccionar una técnica de disrupción celularMicroorganismoMedio de cultivo en el quecrecióEl medio complejo muestrauna mayor resistencia a ladisrupciónTipo de microoganismoLas Gram + son masresistentes a la disrupcionque las gram -Estado fisiológicolas células en faseestacionaria tienden a sermas dificiles de desintegrarTamañolas células mas grandes sonmás fáciles de romperFormalos microorganismosesféricos son másresistentes a la ruptura
  • 12. Página 12Métodos FísicosMolino de bolillasUna suspensión celular es agitada a alta velocidad dentro de una cámara en presencia de una alta proporción de bolillas. Laeficiencia de ruptura se ve afectada por la concentración de células.se usan especialmente para microorganismos filamentosos.BOLILLAS PARA LEVADURAS: >0,5 MMBOLILLAS PARA BACTERIAS: < 0,5 MM Rm: ruptura máxima R: rupturaProductosensibilidad al calorEl calor causa degradación térmica odesnaturalización de proteínasSensibilidad al shearLocalización dentro de la célulalas proteínas periplasmáticas pueden serliberadas por un tratamiento moderadomientras que las citoplasmáticasrequeiren un tratamiento mas vigorosoFactoresvelocidad a la que ha crecidolas altas velocidades específicasde crecimiento permiten unamás facil ruptura de las células.
  • 13. Página 13Si Rm es 100% (quiero romper todo)El tiempo de residencia es: a mayor k, menor tr para logar el mismo % de liberación. (línea verde abajo)K representa la eficiencia de la ruptura y es función de: Velocidad de agitación Concentración de células (30-60% de sólidos) Concentración de bolillas de vidrio (70-90 % respecto al volumen de la cámara) Diámetro de las bolillas (>0,5 levaduras, <0,5 bacterias) temperatura diseño del molino de bolillasHomogeneizador a alta presiónEl efecto de la presión de operación sobre la liberación de proteína es exponencial y se ha demostrado que el exponente de presión apara levaduras es 3 y para bacterias entre 1,5 y 3 No recomendada para organismos filamentosos Mas usada a gran escala El calor es por descompresión adiabática Presión de trabajo: 300 – 600 atm Rm: cantidad máxima de proteína soluble que puedeser liberada R: cantidad de proteínas liberada K: constante de velocidad temperatura dependiente N: numero de pasajes de la suspensión celular por elhomogeneizador P: presión de operación del homogenizador A: exponente de presión que depende delmicrooganismo y del estado metabólicoSi Rm es 100% Número de pasajes:
  • 14. Página 14MicrofluidizadoresFuncionan por el choque de un chorro de líquido (caldo) de alta velocidad de una suspensión (jet) sobre una placa. De choque: un chorro de 80 µm de diámetro contra una placa metálica enfriada Microfluidizador: dos corrientes de líquido de 2x100µm se encuentran en una cruz De choque contra corritente: dos chorros de líquido de 180µm se chocan entre sí de frente.Ventajas Dejan residuos de mayor tamaño (facilitan la separación solido-líquido) Son eficientes a bajo contenido de biomasa Major enfriamiento Permiten trabajar a bajos flujos Se pueden usar volúmentes pequeños Son compactosUltrasonidoMecanismo de ruptura: cavitación: generación de microburbujas que al colapsar generan una onda expansiva que se propaga por elmedio variando la presión. No se usa a escala industrial porque la energía se transforma en calor.Métodos QuímicosTratamiento con álcaliVentajas Económico Fácil escalado No quedan microorganismo viables Inactivación de proteasas Reduce contaminación con piretógenosDesventajas Posible desnaturalización Posible degradaciónTratamiento con solventesVentajas Económico Fácil escalado No quedan microorganismo viables Estabiliza proteínas Inhibe el crecimiento de microorganismoscontaminantesDesventajas Desnturalizacion Solventes inflamables Liberación de proteasasMecanismo Extracción del componente liídico de las membranas autólisisAutólisis y extracción químicaVentajas Económico Fácil escaladoDesventajas (autolisis) Tiempos largos de reacción Bajos rendimientosLas condiciones óptimas deben ser determinadasempíricamente Temperatura pH tiempo de incubación molaridad del buffer estado metabólico de las células
  • 15. Página 15Permeabilización con detergentesDesorganizan la membrana plasmática solubilizando las proteínas haciendo la membrana permeable al pasaje de ciertas proteínasmediante el uso de agentes caotrópicos.Ventajas Evita la extensiva fragmentación de la pared celular hay pocos residuos de pared celular Evita la liberación de DNA Fácil escaladoDesventajas No es económico Es un contaminante en la posterior purificación Inactivan proteínas con estructura cuaternaria La regulación de la temperatura y el pH son críticasMecanismo Solubilización de membranas Permeabilización celularMétodos biológicosMétodos enzimáticosLos sustratos para la disrupción enzimática son las paredes celulares:Gram + Peptidoglicano Membrana citoplasmáticaGram – Pared externa Peptidoglicano Membrana citoplasmáticaLevaduras Mananos parcialmente entrecruzadas por puentesfosfodiester Glucanos y proteínas Membrana citoplasmáticaHongos filamentosos Α y β glucanos Capa de glicoproteínas Microfibras de quitinaTipos de enzimas bacteriolíticas GLICOSIDASAS: cortan cadenas de polisacáridos ACETILMURANIL-L-ALANINAAMIDASAS:clivan la uniónentre proteínas y polisacáridos ENDOPEPTIDASES:clivan cadenas polipeptidicasLisis de levaduras Β(1-3) GLUCANASA: degrada la capa interna de glucano PROTEASA: especifica para la pared celular, degrada la capa externa de proteína-manano Β(1-6) glucanasa Mananasa KitinasaEllas actúan sinérgicamente en la lisis de la pared celular pero solo 2 son esenciales para la ruptura de la célulaMétodo para la liberación de proteínas por lisis selectiva PASO 1: Eliminación de la pared celular, enzimas líticas en medio osmótico (1,2M sorbitol) y un estabilizador de membrana(15mM sulfato de zinc) PASO 2: ruptura del protplasto con DEAD-Dextram y glucosa PASO 3: ruptura de organelas con Triston X-100 a 0°C
  • 16. Página 16
  • 17. Página 17PrecipitaciónLa precipitación es una operación que convierte a un producto solubilizado en un producto solido por acción de algún precipitante.Los agentes precipitantes no deberían producir desnaturalización del producto y deben proveer una mayor estabilidad delprecipitado. Operación fácilmente escalable Requiere poco equipamiento Los precipitantes son económicosDesnaturalización selectivaSe desean producir cambios en la conformación de las proteínas contaminantes (desnaturalizacion) y mantener la proteína de interéssoluble.Precipitación por afinidadSe forman complejos proteína-ligando donde uno o ambos componentes deben tener mas de un sitio de interaccion para poderformar una red macromolecular que se insolubilice. (inmunoprecipitacion)SaltingoutAdicion de sales a la solución que contiene la proteína de interés, estas afectan el balance entre las fuerzas electroestáticas (quemantienen la proteína en solución) y las fuerzas hidrofóbicas (que precipitan la proteína en un medio acuoso). La cada de hidrataciónrecubre la superficie de la proteína y previene las interacciones proteína-porteína, las altas concentraciones de iones salinos eliminanesta agua porque la usan para hidratarse y permiten las interacciones proteína-proteína llevando a la precipitación. S= solubilidad de la proteína S0= solubilidad extrapolada de la proteína a concetracion cero de sal. Depende de la temperatura y el pH. K= disminución de la solubilidad de la proteína por unidad de sal agregada. Depende de la proteína y la sal usada C= concentración de sal.Curva típica del saltingout:
  • 18. Página 18Las sales con mayor carácter precipitante son las que mas estructuran el agua (poco carácter caótropo) y las de menor poderprecipitante son las que interfieren con la estructura del agua (interfieren en los puente de H como el SCN) la concentración salinatambién puede expresarse como fuerza ionica.El sulfato de amonioEs usado a baja escala por su alta solubilidad a bajas temperaturas. Aunque es barato, su uso a gran escala esta restringido porproblemas de eliminación de residuos. La mayor parte de la sal queda en el sobrenadante pero una cantidad residual siemprecontamina el precipitado, pudiendo ser eliminada resolviendo el precipitado y realizando una UF o cromatografía de exclusiónmolecular.Ventajas: Alta solubilidad 4M entre 0 y 30°C Barato Conserva la integridad de proteínas termolábiles Previene proteólisis y contaminaciones bacterianas Densidad de solución saturada: 1,235 g/lDesventajas Contamina el precipitado Corroe el metal y el cemento Problemas de eliminación No se puede usar por encima de pH 8El sulfato de sodioDebe ser usado a 35 – 40 °C para asegurar la solubilidad adecuada. La sal puede recuperarse del sobrenadante de la precipitacióndisminuyendo la temperaturaVentajas RecuperableDesventajas Caro Equipamiento termostatizado Problemas de degradación enzimáticaPrecipitación con solventes orgánicosEl solvente orgánico debe ser totalmente miscible con agua y de carácter hidrofilico para evitar desnaturalización de la proteína deinterés. La adicion de un solvente orgánico reduce la constante dieléctrica de la solución lo que aumenta las interacciones proteína-proteína con lo que se llega a la agregación y ulterior precipitación S: solubilidad de la proteína en la mezcla solvente orgánico- agua D: constante dieléctrica de la mezcla K: constante que depende del solvente usando, de la proteína, del pH y la temperatura S0: solubilidad de la proteína en la solución acuosa originalUn problema es la tendencia general de los solventes orgánicos a desnaturalizar irreversiblemente las proteínas. Cuando se reduce laconstante dieléctrica del solvente, la proteína puede responder plegándose a una forma inactiva en la que lso residuos hidrofóbicosestén expuestos en el exterior. Por eso se debe realizar a bajar temperaturas (<10°C) para tener una buena recuperación.Solventes orgánicos: Metanol Etanol posee el mejor efectro entre la solubilidad de las proteínas y el carácter hidrofilico adecuado que minimiza ladesnaturalización. Dificultades: sustancia controlada Isopropanol es mashidrofóbico y puede llegar a desnaturalizar las proteínas en mayor grado. Acetona
  • 19. Página 19DESVENTAJAS: hay que diseñar todo el proceso a prueba de incendios debido a la inflamabilidad de los solventes usados. Requiere uncontrol estricto ya que hay que mantenerlo a bajas temperaturas y hay que contrarrestar el calor generado cuando se mezclansolventes orgánicos con agua.VENTAJAS: su efecto bactericida y su fácil rescuperacion (destilación)Precipitación isoeléctricaLas proteínas exhiben menor solubilidad en su punto isoeléctrico pI es el valor de pH en que la molécula tiene carga neta cero. En estepunto, el grado de hidratación de la molécula es mínimo. Esto aumenta las interacciones hidrofóbicas proteína-proteína y causa laprecipitación. Además disminuyen los fenómenos de repulsión. La primera dificultad es su rango limitado de pH en que las proteínasson estables. Se requiere un control estricto y un buen mezclado para no sobrepasar el pH crítico y no causar con esto serias pérdidasdel producto.Precipitación con polímeros no ionicos (PEG)Las operaciones se efectúan a temperatura ambiente ya que el PEG no interactúa significativamente con la proteína como lo hacíanlos solventes orgánicos y tiene bajo calor de disolución. PEG es un polímero tóxico con viscosidad moderada. A gran escala aparecendificultades para reciclar el polímero que es caro. PEG es difícil de eliminar de la fracción protéica: si junto con las proteínasprecipitadas se arrastra una cantidad significativa de PEG pueden producirse serios problemas en etapas posteriores de purificacióndel producto. El pH mas cercano al pI requerirá menor concentración de PEG.Precipitación por polielectrolitosCon carga negativa Acidopolacrílico Polisacáridos acídicos polifosfatosCon carga positiva Polietilenimina QuitosanoEl mecanismo de precipitación está relacionado a la cancelación de cargas ya que en general un determinado polielectrolitopreciítaproteínas de cargas contrarias. Se requieren bajas concentraciones de polielectrolitos para producir la precipitación de proteínas,normalmente 0,05 a 0,1 %. Los precipitados se forman bien y sedimentan rápido. Las operaciones a gran escala son económicas yaque la recupración del polielectrolito puede llegar a 90%. La mayor desventaja es el costo inicial del polielectrolito y al igual que elPEG se deberá evaluar posibles dificultades posteriores por contaminación de la muestra.CrioprecipitacionLas proteínas precipitan solo por el hecho de disminuir la temperatura. Ej. Factor VIII de coagulación del plasma humano.Precipitación por desnaturalización selectivaAumento de la temperaturaLa combinación con otros agentes precipitantes hace que estos tratamientos se realicen a menor temperatura mejorando la calidadde las proteínas precipitadas. Con el agregado de citrato se puede disminuir de manera importante la tempratura para logra un 70%de precipitación y además lograr una precipitación diferencial con BSA. El aumento del poder precipitante en este caso esta asociadoal poder quelante del calcio del citrato que extrae dicho metal desestabilizando la proteína.Cinética de precipitación
  • 20. Página 20El tamaño de las partículas es uno de los determinantes de la eficiencia de las separaciones solido-liquido.NucleaciónPara concentraciones de proteína por encima de 2mg/ml toda la proteína desaparece de la fase soluble en un segudo formándosepartículas submicrónicas que se mueven muy rápido y colisionan entre sí.Crecimiento limitado por difusiónEstas partículas se van uniendo formando otras mas grandes. La eficiencia de la colisón para formar agregados disminuye con eltamaño de las partículas. El crecimiento puede verse entonces como la adición de pequeñas unidades a los agregados en crecimiento.La falla en las colisiones entre los agregados mas grandes para formar aglomerados finales, reduce el proceso de crecimiento dondesólo las partículas primarias y lo pequeños agregados pueden servir como unidades de crecimiento, actuando éstos últimos comocolectores.Crecimiento influenciado por el flujoEl mezclado favorece el crecimiento del agregado formándose particuals del rango 1 – 100 µmFloculaciónLos agregados se juntan formando los grandes flóculos.EscaladoEl escalado puede realizarse en: Batch intermitente Tubular continuo Tanque agitado continuo CTRSPuede suponerse que las proteínas precipitan rápidamente, entonces la velocidad de agitación afectará el tamaño inicial de laspartículas y las características del crecimiento posterior.Problemas:Problemas de escalado en Batch Tiempos largos de mezclado Coprecipitación (precipitan proteínas con contaminantes) Desnaturalización térmica del producto.
  • 21. Página 21Partición en dos fases acuosasSistemas de dos fases acuosasTipo polímero-polímero PEG-Dextran PEG- hidroxipropil almidón (El dextran es caro y a nivel industrial se usa este polímero)Tipo polímero-sal PEG-fosfato PEG-sulfato PEG-citratoComposición global del sistemaTodos sistemas de dos fases acuosas cuya composición de cada fase sean iguales pertenecen a la misma tie-line. Entonces para dossistemas de “FA de diferente composición global pertenecientes a la misma tie-line es necesario que la relación de volúmenesde los dos sistemas sea la misma. El punto crítico (teórico) es donde la composición de las fases es igual y el volumen también. Parados sistemas en 2FA pertenecientes a la misma tie-line, el volumen de las fases respecto del volumen total del sistema esta dado porla longitud relativa de la tie-line. Entonces se puede calcular el volumen relativo de cada fase de un sistema X con la siguienteecuación:Y la composición de cada una de las fases será la misma para todos los sistemas pertenecientes a la tie-line definida por A B.
  • 22. Página 22Comportamiento de una proteína en un sistema de 2FACuando se introducen proteínas en este sistema, éstas se repartirán en forma diferente en ambas fases según sus característicasmoleculares. Entonces el coeficiente de partición para una proteína P:Las características moleculares que hacen que las proteínas se repartan distinto en las dos fases son: Peso molecular Cargas electroestáticas superficiales Hidrofobicidad superficialDe esta manera puede extraerse selectivamente algunas proteínas buscando condiciones que hagan que se dirijan hacia la fasesuperior K>1 mientras que las otras proteínas y restos celulares van a la fase inferior K<1. Que los contaminantes queden en la faseinferior es una ventaja para la economía del proceso.La ruptura de los microorganismos genera problemas: Los restos celulares poseen un tamaño pequeño del orden de los 0,5µm Junto con las proteínas se liberan ácidos nucleicos que aumentan la viscosidad del medio.Para la purificación de una proteína de interés por métodos convencionales, es necesaria una clarificación previa por lo que hay querecurrir a la centrifugación o ultrafiltración. En la centrifugación como los restos celulares son del orden de 0,5 µm habría que aplicarmucha energía y tiempo y en cuanto a la UF, como con la lisis se aumenta la viscosidad del medio, este método se hace menosefectivo. En el sistema de 2FA no se necesita clarificación previa.¿Cómo cambiar la KP? Tipos de polímeros Concentración de polímeros Peso molecular de los polímeros (+PM  la proteína sale de esta fase) pH es efectivo slo en sistemas polímero/polímero Temperatura. Es efectivo solamente con algunos polímeros termosensibles especiales donde la separación ocurre adeterminada temperatura. Tipo de sales en cuya presencia se realiza la extracción (modifican K) Fuerza ionica Unión de ligandos de afinidad a los polímeros¿Cómo comparar dos sistemas de2FA para la purificación de una proteína?Una manera es determinando la K de la proteínas de interés y compararla con la K de las contaminantes. En un sistema ideal KP<KC.Las comparaciones deben hacerse para sistemas con tie-lines equivalentes. La manera más fácil de tener estas es trabajar consistemas de 2FA con composición global muy cercanas a la curva binodial.Ventajas Económico, solo si los polímeros se pueden reciclar Condiciones de extracción muy suaves, por lo que puede usarse para proteínas poco estables como las enzimas El scale-up es simple Rendimientos altos
  • 23. Página 23 Capacidad concentradora, solo cuando K es muy grande o muy chico de manera que la reducción del volumen de fase endonde se encuentra es posible sin afectar la recuperación La mayoría de los polímeros usados poseen propiedades estabilizantes de las proteínasCalcular el porcentaje de proteína extraído:Si la proteína de interés tiene propiedades que se acercan al promedio de las proteínas contaminantes, su constante de partición noserá muy distinta al del resto de las proteínas de la mezcla y no se logrará una purificación muy importante. En estos cados quedandos cosas por hacer: usar la partición en 2FA como primer paso de un proceso de purificación (como extracción) y luego aplicar otrosmétodos de alta resolución o usar la partición en 2FA por afinidad para tratar de mejorar la K usando polímeros con ligandos deafinidad.Eliminación de los polímerosEl agregado de sal al PEG genera otro sistema de dos fases que extraiga la enzima. Las sales luego se sacan por diálisis o UF. Si el PEGes de bajo PM y la proteína de alto PM se puede diafiltrar (previamente diluir la muestra para disminuir la viscosidad). También sepuede precipitar la muestra con solventes o sales pero los precipitados siempre van a tener polímero contaminante. Otra alternativaes hacer una extracción con intercambiadores iónicos previo ajuste del pH y fuerza iónica.Precipitación vs sistema 2FAEl PEG además de ser usado para formar sistemas de 2FA también se usa para precipitar proteínas. Entonces ¿CÓMO SABER QUEFENÓMENO ESTÁ OCURRIENDO?Para diferenciarlos aplicamos concentraciones distintas de extracto a una solución de PEG. Si la concentración de la proteína seinterés se encuentra en el sobrenadante, se mantiene la constante entonces hay equilibrio entre la precipitación y la solubilidad. Si laactividad enzimática responde linealmente con la concentración del extracto entonces se está formando un sistema de 2FA
  • 24. Página 24¿Cómo mido ruptura? DO(turbidez) Recuento en microscopio Actividad  Bradford Abs 280Métodos cuantitativos para determinar proteínas Folinphenol Bradford LowryMétodos para estimar proteínas Absorbancia a 280 pero puede detectar otras cosas q abs a esta longitud de onda.