1. Reattivi e attrezzature
TRIzol Reagente, o reagente TRI DEPC (RNase gratuito) l'acqua o lo 0,5% SDS DEPC soluzione in acqua
trattata
Cloroformio (Fisher)
Alcole isopropilico (2-propanolo) (Fisher)
Etanolo 75% (in DEPC acqua trattata) pipette sterili trattate con reagenti che inibiscono le RNAsi,
microcentrifuga, tubi e pestelli
1. Omogeneizzazione per Sospensioni cellulari
a. 1 ml di sospensione cellulare tubi sterili liberi dalle RNAsi.
b. Centrifugare per 1 minuto.
c. Versare il surnatante.
d. Aggiungere 1 ml di reagente TRI o TRIzol.
e. lyse cellule ripetitive pipettatura.
f. Centrifugare l’omogenato a 12000 xg per 10 minuti a 4 ° C.
g. Trasferire l’omogenato in una provetta sterile per microcentrifuga.
h. Se questo RNA dovrà essere utilizzato anche per la RT-PCR, ripetere i passaggi da f e g due
volte.
Modifica per i tessuti
a. Aggiungere 1 ml di TRIzol per ogni 50-100 mg di tessuto. Il volume del campione non deve
superare i 100 microlitri.
b. Omogeneizzare i campioni utilizzando una provetta libera da RNAsi.
Fase di separazione
a. Incubare campioni (da 1g) per 5 minuti a temperatura ambiente.
b. 0,2 ml di cloroformio per ciascuna provetta. Agitare vigorosamente campioni a mano per 15
secondi.
c. Incubare i campioni per 5 minuti a temperatura ambiente.
°
d. Centrifugare i campioni per 15 minuti a 12000 xg a 4 C.
3. RNA Precipitazioni
a. Trasferire la fase acquosa in un nuovo tubo.
b. Aggiungere 0,5 ml di alcool isopropilico per precipitare l'RNA. Se questo RNA dovrà essere
utilizzato per la RT-PCR, aggiungere 50 microlitri di alcol isopropilico, mescolare, incubare i
campioni a temperatura ambiente per 5 minuti e centrifugare a 12000 xg per 10 minuti a 4 ° C.
Trasferire il campione in un nuovo tubo.
c. Incubare per 5-10 minuti a temperatura ambiente.
°
d. Centrifugare per 10 minuti a 12000 xg a 4 C. L'RNA sarà un pellet.
4. RNA Wash
a. Scartare il sopranatante.
b. Lavare il pellet con 1 ml di etanolo al 75%.
c. Mix campione vortexing. Il pellet di RNA possono galleggiare.
d. Centrifugare a 12000 xg per 5 minuti a 4 ° C. Se questo RNA sarà utilizzato per la RT-PCR,
ripetere i punti a, b, c due volte.
°
e. Il pellet di RNA può essere stoccato in etanolo a -70 C per mesi.
5. Redissolving l'RNA
a. Rimuovere il surnatante.
b. asciugare il pellet per 5-10 minuti. Non rendere completamente asciutto il pellet.
c. sciogliere in pellet da 30 a 60 microlitri RNase acqua libera o 0,5% passando da SDS la
soluzione attraverso una pipetta di punta e incubare per 10 minuti a 55-60 ° C.
6. Determinazione della concentrazione e della purezza dell’RNA
a. Prendere da 2 a 5 microlitri di RNA dal campione iniziale di magazzino, diluito con 998 o 995
microlitri di acqua libera da RNAsi in un tubo da microcentrifuga da 1,5 ml.

2. b. RNAse Pipettare 1 ml di acqua prelevata da un ambiente pulito e privo di RNAsi e leggere
l'assorbanza della cuvetta in bianco. leggere l'assorbanza a 260 nm e 280 nm.
d. Usa la formula seguente per determinare la concentrazione di RNA del campione originale:
[RNA μg / microlitri] = A 260 x 33 x fattore di diluizione / 1000
e. Per determinare la purezza del campione di RNA, il calcolo del rapporto A260/A280. Rapporti tra 1,7 a 2
rappresentano una buona RNA)
Preparazione di acqua RNase-free
a. Misura acqua RNase-free in bottiglie di vetro.
b. Aggiungere 1 ml di 0,1% (v / v) diethylpyrocarbonate (DEPC) a 1000 ml di acqua.
c. Lasciare riposare durante la notte.
d. Autoclave.