1. UNIVERSIDAD AUTONOMA DE GUADALAJARA
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICO-BIOLÓGICAS
BIOTECNOLOGÍA
PRACTICA 2. AISLAMIENTO Y SELECCIÓN DE UN MICROORGANISMO
OBJETIVO. Aislar Aspergillus niger a partir de un fruto cítrico y seleccionar por la
cantidad de ácido cítrico que forma.
INTRODUCCION.
La obtención de ácido cítrico a través de un proceso de fermentación representa una de
las industrias más grandes dentro del ámbito biotecnológico. Esto se debe a la
importancia que tiene el ácido cítrico dentro de la industria alimentaria y farmacéutica, ya
que es un ácido con una alta solubilidad, sabor ácido agradable, muy baja toxicidad y es
asimilable. El ácido cítrico también se emplea en la preparación de algunos cosméticos,
limpieza de metales, recuperación secundaria del petróleo y otras industrias.
Inicialmente el ácido cítrico se obtuvo de frutas cítricas, la primera síntesis química se
desarrollo en el año de 1860. En 1863, Wehmer descubrió al ácido cítrico como un
metabolito microbiano. En 1917 se reporta la producción de ácido cítrico utilizando una
cepa de Aspergillus niger creciendo en sacarosa como sustrato. Actualmente, aunque la
síntesis química del ácido cítrico es posible por vía química, no es un proceso
competitivo comparado con el proceso desarrollado utilizando hongos, y en especial, con
el hongo filamentoso Aspergillus niger.
El mecanismo bioquímico por el cual Aspergillus niger acumula ácido cítrico ha
despertado interés, con miras a optimizar el proceso industrial de producción. Sin
embargo, no hay una sola explicación, ya que varios factores afectan la fermentación y la
excreción del ácido de la mitocondria. Por ejemplo, el ácido cítrico se acumula cuando
hay exceso de la concentración de azúcar, protones, u oxígeno disuelto; o con niveles
subóptimos de metales traza, nitrógeno y fosfato. Aspergillus niger posee una ruta
metabólica del metabolismo de la glucosa que está catalizada por la enzima glucosa
oxidasa, que es inducida a latas concentraciones de glucosa y aireación vigorosa.
Aspergillus niger utiliza 1 mol de dióxido de carbono, el cual proviene de la formación
del acetil-CoA y 1 mol de piruvato para formar 1 mol de oxaloacetato. Esta reacción es
acompañada por la pérdida de 2 moles de dióxido de carbono, por lo que sólo posterceras
partes del carbono de la glucosa se convierte en ácido cítrico.
En la presente práctica se busca aislar cepas de Aspergillus niger productoras de ácido
cítrico, para su posterior selección. Para analizar la producción de ácido cítrico los
aislados son propagados en medio Czapek-Dox agar conteniendo verde de bromocresol
como indicador. Las colonias fúngicas formadoras producen zonas amarillas (0.5 – 1.5
cm) debido a la formación de ácido. Para el aislamiento de Aspergillus niger se utiliza un
medio de cultivo a base de extracto de malta donde crece rápidamente. El micelio es de
color amarillo brillante y produce cabezas de conidios de color café oscuro. Las cabezas
de los conidios tienen forma de globos. Ver figura abajo.

2. Morfología microscópica de Aspergillus.
MATERIAL.
Matraz erlenmeyer de 500 mL
Probeta de 100 mL
Tapones de algodón
Tijeras
Papel aluminio
Autoclave
Cajas petri estériles
Asa
Pipetas de 1 mL estériles
Tubos con rosca o con tapón de algodón
Extracto de malta
Agar
Agua destilada
Solución de HCl 0.1 N
Solución de NaOH 0.1 N
Agar papa dextrosa (PDA)
Sacarosa
NaNO3
K2HPO4
MgSO4·7H2O
KCl
FeSO4
Verde de bromocresol
Azul de lactofenol
METODOLOGIA.
1.- Preparación del medio sólido de Extracto de Malta (EM). Disolver 2 g de extracto
de malta en aproximadamente 85 mL de agua destilada. Ajustar el pH a 4.8 con una
solución de HCl 0.1 N o de NaOH 0.1 N, según sea el caso. Agregar 2 g de agar y
acompletar volumen a 100 mL con agua destilada. Calentar el medio para fundir el agar,
homogenizar el medio moviendo suavemente. Esterilizar 15 minutos a 121ºC. Vaciar 5
cajas petri con el agar EM preparado.
2.- Preparación del medio Agar Papa Dextrosa (PDA). Disolver 1.9 g de PDA en 50
mL de agua destilada. Ajustar el pH a 5.6 con una solución de HCL 0.1 N o de NaOH 0.1

3. N, según sea el caso. Fundir el agar y repartir en 10 tubos, colocando 5 mL de medio en
cada tubo. Esterilizar a 121ºC durante 15 minutos. Sacar de la autoclave y colocarlos en
posición inclinada para generar una amplia superficie cuando el agar se solidifique.
3.- Preparación del medio Czapek-Dox. Disolver los siguientes componentes en las
cantidades indicadas en 80 mL de agua destilada: sacarosa 3 g, NaNO3 0.2 g, K2HPO4
0.1 g, MgSO4.7H2O 0.05 g, KCl 0.05 g, FeSO4 0.001 g, 4 mL de verde de bromocresol
al 1% P/V. Ajustar el pH a 6. Adicionar el agar y ajustar el volumen a 100 mL con agua
destilada. Fundir el agar y esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121ºC. Vaciar en
cajas de Petri.
4.- Preparación azul de lactofenol. Medir agua destilada 20 mL, cristales de fenol 20 g,
acido láctico 20 mL, glicerina 20 mL, azul de algodón 0.05 g. Enseguida disolver el fenol
en el agua, agregar el ácido láctico y la glicerina, calentar a 70 °C, adicionar el azul de
algodón. Guardar en frasco de vidrio perfectamente etiquetado.
5.- Tinción con azul de lactofenol. Colocar el material a observar en un portaobjetos y
añadir de 1 a 2 gotas de solución de azul de lactofenol, colocar el cubreobjetos y después
de 2 minutos observar al microscopio.
AISLAMIENTO.
1.- Tomar con un asa al hongo que está visible en la superficie de un limón picado y
colocado en la oscuridad por una semana. Aspergillus niger forma esporas de color
oscuro.
2.- Sembrar colocando el hongo en el centro de una caja Petri que contenga medio sólido
de Extracto de Malta.
3.- Incubar las cajas de petri inoculadas a 30ºC durante un periodo de 4 a 6 días, para
permitir el crecimiento del hongo.
4.- Preparar frotis de las colonias fúngicas, adicionar 2 gotas de azul de lactofenol,
esperar os minutos y observar la microscopio.
5.- Las colonias jóvenes de Aspergillus niger son transferidas con un asa a tubos con agar
PDA inclinado.
6.- Incubar los tubos con agar inclinado inoculados a 30ºC por un periodo de 4 a 6 días
para lograr una esporulación abundante. Los conidios de Aspergillus niger son de color
oscuro.
7.- Conservar los tubos esporulados a 4ºC, como cultivos de trabajo.
SELECCIÓN DE CEPAS.
1.- Transferir asépticamente 0.5 mL de una suspensión de esporas de los tubos de
mantenimiento a las placas con medio Czapek-Dox. Rotar las placas para que el líquido
se incorpore en su superficie.
2.- Incubar las placas a 30ºC durante 5 días. La formación de zonas amarillas indica la
formación de ácido cítrico.
3.- Medir la zona amarilla en cada colonia.
4.- Seleccionar las mejores colonias, sembrándolas en tubos inclinados con PDA.
5.- Incubar tubos con PDA a 30ºC durante un periodo de 4 a 6 días, hasta obtener una
esporulación abundante.
6.- Conservar en refrigeración a 4ºC.

4. REPORTE PRACTICA.
Realice un reporte por equipo que contenga: Titulo de la práctica, objetivo, introducción
breve, metodología, resultados, discusión, conclusión, bibliografía. Como guía puede
utilizar el formato de cualquier artículo científico.
CUESTIONARIO
1.- ¿Para qué sirve el verde de bromocresol?
2.- El cambio de la coloración del medio de cultivo alrededor de la colonia de Aspergillus
niger es suficiente para saber que se está formando ácido cítrico. Explique.
3.- ¿Cuál es el objetivo de mantener cepas fúngicas en PDA inclinado?
4.- ¿Qué efecto tiene un medio con una alta concentración de iones amonio?
5.- ¿Qué puede suceder si al hongo Aspergillus niger se le somete a altas concentraciones
de oxígeno disuelto en presencia de altas concentraciones de glucosa?
6.- El colorante de azul de lactofenol tiene tres funciones en la tinción de hongos, ¿cuáles
son?
7.- ¿Qué técnica sugiere para aumentar la productividad del hongo?
8.- ¿Qué sistema de cultivo propone para tener altos rendimientos de ácido cítrico
utilizando Aspergillus niger?