Practica 2 aislamiento microorganismo

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Practica 2 aislamiento microorganismo

  1. 1. UNIVERSIDAD AUTONOMA DE GUADALAJARA FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICO-BIOLÓGICAS BIOTECNOLOGÍA PRACTICA 2. AISLAMIENTO Y SELECCIÓN DE UN MICROORGANISMOOBJETIVO. Aislar Aspergillus niger a partir de un fruto cítrico y seleccionar por lacantidad de ácido cítrico que forma.INTRODUCCION.La obtención de ácido cítrico a través de un proceso de fermentación representa una delas industrias más grandes dentro del ámbito biotecnológico. Esto se debe a laimportancia que tiene el ácido cítrico dentro de la industria alimentaria y farmacéutica, yaque es un ácido con una alta solubilidad, sabor ácido agradable, muy baja toxicidad y esasimilable. El ácido cítrico también se emplea en la preparación de algunos cosméticos,limpieza de metales, recuperación secundaria del petróleo y otras industrias.Inicialmente el ácido cítrico se obtuvo de frutas cítricas, la primera síntesis química sedesarrollo en el año de 1860. En 1863, Wehmer descubrió al ácido cítrico como unmetabolito microbiano. En 1917 se reporta la producción de ácido cítrico utilizando unacepa de Aspergillus niger creciendo en sacarosa como sustrato. Actualmente, aunque lasíntesis química del ácido cítrico es posible por vía química, no es un procesocompetitivo comparado con el proceso desarrollado utilizando hongos, y en especial, conel hongo filamentoso Aspergillus niger.El mecanismo bioquímico por el cual Aspergillus niger acumula ácido cítrico hadespertado interés, con miras a optimizar el proceso industrial de producción. Sinembargo, no hay una sola explicación, ya que varios factores afectan la fermentación y laexcreción del ácido de la mitocondria. Por ejemplo, el ácido cítrico se acumula cuandohay exceso de la concentración de azúcar, protones, u oxígeno disuelto; o con nivelessubóptimos de metales traza, nitrógeno y fosfato. Aspergillus niger posee una rutametabólica del metabolismo de la glucosa que está catalizada por la enzima glucosaoxidasa, que es inducida a latas concentraciones de glucosa y aireación vigorosa.Aspergillus niger utiliza 1 mol de dióxido de carbono, el cual proviene de la formacióndel acetil-CoA y 1 mol de piruvato para formar 1 mol de oxaloacetato. Esta reacción esacompañada por la pérdida de 2 moles de dióxido de carbono, por lo que sólo posterceraspartes del carbono de la glucosa se convierte en ácido cítrico.En la presente práctica se busca aislar cepas de Aspergillus niger productoras de ácidocítrico, para su posterior selección. Para analizar la producción de ácido cítrico losaislados son propagados en medio Czapek-Dox agar conteniendo verde de bromocresolcomo indicador. Las colonias fúngicas formadoras producen zonas amarillas (0.5 – 1.5cm) debido a la formación de ácido. Para el aislamiento de Aspergillus niger se utiliza unmedio de cultivo a base de extracto de malta donde crece rápidamente. El micelio es decolor amarillo brillante y produce cabezas de conidios de color café oscuro. Las cabezasde los conidios tienen forma de globos. Ver figura abajo.
  2. 2. Morfología microscópica de Aspergillus.MATERIAL.Matraz erlenmeyer de 500 mLProbeta de 100 mLTapones de algodónTijerasPapel aluminioAutoclaveCajas petri estérilesAsaPipetas de 1 mL estérilesTubos con rosca o con tapón de algodónExtracto de maltaAgarAgua destiladaSolución de HCl 0.1 NSolución de NaOH 0.1 NAgar papa dextrosa (PDA)SacarosaNaNO3K2HPO4MgSO4·7H2OKClFeSO4Verde de bromocresolAzul de lactofenolMETODOLOGIA.1.- Preparación del medio sólido de Extracto de Malta (EM). Disolver 2 g de extractode malta en aproximadamente 85 mL de agua destilada. Ajustar el pH a 4.8 con unasolución de HCl 0.1 N o de NaOH 0.1 N, según sea el caso. Agregar 2 g de agar yacompletar volumen a 100 mL con agua destilada. Calentar el medio para fundir el agar,homogenizar el medio moviendo suavemente. Esterilizar 15 minutos a 121ºC. Vaciar 5cajas petri con el agar EM preparado.2.- Preparación del medio Agar Papa Dextrosa (PDA). Disolver 1.9 g de PDA en 50mL de agua destilada. Ajustar el pH a 5.6 con una solución de HCL 0.1 N o de NaOH 0.1
  3. 3. N, según sea el caso. Fundir el agar y repartir en 10 tubos, colocando 5 mL de medio encada tubo. Esterilizar a 121ºC durante 15 minutos. Sacar de la autoclave y colocarlos enposición inclinada para generar una amplia superficie cuando el agar se solidifique.3.- Preparación del medio Czapek-Dox. Disolver los siguientes componentes en lascantidades indicadas en 80 mL de agua destilada: sacarosa 3 g, NaNO3 0.2 g, K2HPO40.1 g, MgSO4.7H2O 0.05 g, KCl 0.05 g, FeSO4 0.001 g, 4 mL de verde de bromocresolal 1% P/V. Ajustar el pH a 6. Adicionar el agar y ajustar el volumen a 100 mL con aguadestilada. Fundir el agar y esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121ºC. Vaciar encajas de Petri.4.- Preparación azul de lactofenol. Medir agua destilada 20 mL, cristales de fenol 20 g,acido láctico 20 mL, glicerina 20 mL, azul de algodón 0.05 g. Enseguida disolver el fenolen el agua, agregar el ácido láctico y la glicerina, calentar a 70 °C, adicionar el azul dealgodón. Guardar en frasco de vidrio perfectamente etiquetado.5.- Tinción con azul de lactofenol. Colocar el material a observar en un portaobjetos yañadir de 1 a 2 gotas de solución de azul de lactofenol, colocar el cubreobjetos y despuésde 2 minutos observar al microscopio.AISLAMIENTO.1.- Tomar con un asa al hongo que está visible en la superficie de un limón picado ycolocado en la oscuridad por una semana. Aspergillus niger forma esporas de coloroscuro.2.- Sembrar colocando el hongo en el centro de una caja Petri que contenga medio sólidode Extracto de Malta.3.- Incubar las cajas de petri inoculadas a 30ºC durante un periodo de 4 a 6 días, parapermitir el crecimiento del hongo.4.- Preparar frotis de las colonias fúngicas, adicionar 2 gotas de azul de lactofenol,esperar os minutos y observar la microscopio.5.- Las colonias jóvenes de Aspergillus niger son transferidas con un asa a tubos con agarPDA inclinado.6.- Incubar los tubos con agar inclinado inoculados a 30ºC por un periodo de 4 a 6 díaspara lograr una esporulación abundante. Los conidios de Aspergillus niger son de coloroscuro.7.- Conservar los tubos esporulados a 4ºC, como cultivos de trabajo.SELECCIÓN DE CEPAS.1.- Transferir asépticamente 0.5 mL de una suspensión de esporas de los tubos demantenimiento a las placas con medio Czapek-Dox. Rotar las placas para que el líquidose incorpore en su superficie.2.- Incubar las placas a 30ºC durante 5 días. La formación de zonas amarillas indica laformación de ácido cítrico.3.- Medir la zona amarilla en cada colonia.4.- Seleccionar las mejores colonias, sembrándolas en tubos inclinados con PDA.5.- Incubar tubos con PDA a 30ºC durante un periodo de 4 a 6 días, hasta obtener unaesporulación abundante.6.- Conservar en refrigeración a 4ºC.
  4. 4. REPORTE PRACTICA.Realice un reporte por equipo que contenga: Titulo de la práctica, objetivo, introducciónbreve, metodología, resultados, discusión, conclusión, bibliografía. Como guía puedeutilizar el formato de cualquier artículo científico.CUESTIONARIO1.- ¿Para qué sirve el verde de bromocresol?2.- El cambio de la coloración del medio de cultivo alrededor de la colonia de Aspergillusniger es suficiente para saber que se está formando ácido cítrico. Explique.3.- ¿Cuál es el objetivo de mantener cepas fúngicas en PDA inclinado?4.- ¿Qué efecto tiene un medio con una alta concentración de iones amonio?5.- ¿Qué puede suceder si al hongo Aspergillus niger se le somete a altas concentracionesde oxígeno disuelto en presencia de altas concentraciones de glucosa?6.- El colorante de azul de lactofenol tiene tres funciones en la tinción de hongos, ¿cuálesson?7.- ¿Qué técnica sugiere para aumentar la productividad del hongo?8.- ¿Qué sistema de cultivo propone para tener altos rendimientos de ácido cítricoutilizando Aspergillus niger?

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