12. Оценка способности нанокомпозитов
SiO2~pppN проникать в клетки методом
конфокальной микроскопии
В эксперименте используют клетки
MDCK. К клеткам добавляют
растворы pppUFlu, смесь pppUFlu с
исходными SiO2~NH2-наночастицами
и суспензию нанокомпозита
SiO2~pppUFlu
Видно, что флуоресцентная метка
более-менее равномерно
распределена внутри клетки. В
контрольных экспериментах
показано, что pppUFlu, не будучи в
составе нанокомпозита, не проникает
в клетки. 12
13. Оценка цитотоксичности наночастиц и
полученных нанокомпозитов
Для оценки цитотоксичности
нанокомпозитов применяют метод
окраски мертвых клеток с помощью
красителя трипанового синего.
Результаты представлены на графике,
где темные столбцы относятся к
наночастицам SiO2~NH2, светлые
столбцы – к нанокомпозитам
SiO2~pppC. Из графика видно, что
выживаемость клеток примерно
одинакова для всех исследуемых
образцов, причем образцы обладают
низкой токсичностью.
120
100
80
60
40
20
0
0 0,031 0,063 0,125 0,25 0,5 1
концентрация, мг/мл
живые клетки, %
13
14. Субстратные свойства нанокомпозита
SiO2~pppС
Смесь 1. 4 природных pppN
Смесь 2. 3 природных pppN (кроме
pppC) и SiO2~pppC
Дорожки 1 и 2 – продукты реакции
в смеси 1 и 2 соответственно; дорожки 3
и 4 – исходные матрица и праймер,
соответственно. Видно, что реакция
элонгации в обеих реакционных смесях
приводит к образованию ожидаемого
продукта (26-мерного олигонуклеотида,
дор.1 и 2), что свидетельствует о том,
что SiO2~pppC является полноценным
субстратом ДНК-полимеразы I из E.Coli.
14
15. Субстратные свойства нанокомпозита
SiO2~pppAZT*
5’dCTCCGAAGAAATAAGATCCp Матрица
dATTCTAGGp5’‑- Праймер
dbiotpppC
и pppT ДНК-полимераза
SiO2~pppAZT* и
dbiotpppC
5’CTCCGAAGAAATAAGATCCp Матрица
biotCTTTATTCTAGGp5’‑ Праймер
На ДНК-чипе № 1 проводят
реакцию элонгации праймера с
использованием природного
трифосфата тимидина (pppT) и
трифосфата цитидина, несущего
биотиновую метку (pppCbiot)
Аналогично проводят две
последовательные реакции на
ДНК-чипе № 2, причем в первой
реакции вместо pppT используют
образец SiO2~~pppAZT*
1 2 3
15
16. Выводы
Для осуществления предложенного способа получения
наноразмерной системы доставки нуклеозидтрифосфатов в клетки:
Был сконструирован и синтезирован алкин- содержащий линкер
со сложноэфирной группировкой для последующего отщепления
нуклеозидтрифосфата внутри клетки
Синтезированы различные алкиномодифицированные и
азидомодифицированные SiO2-наночастицы
Были синтезированы различные нанокомпозиты азидотимидина
Были получены флуоресцентномеченные нанокомпозиты
азидотимидина и контрольные модифицированные наночастицы
Результаты исследований дают основания полагать, что полученные
нанокомпозиты могут быть использованы в качестве
противовирусных и противораковых средств 16