2. Osnova
Úvod
Příprava vzorků
Jednočásticová EM
Rozlišení v jednočásticových analýzách
Nejnovější poznatky v jednočásticové EM
Flexibilita velkých proteinových komplexů
Analýzy prováděné bez čisticích kroků
3. Úvod
EM je široce aplikovatelnou technikou ve studiu
proteinových a membránových struktur
přestože je méně vhodná než RTG difrakce (získání vhodných
krystalů řešením 3D proteinových struktur), má ve srovnání s
ní 2 výhody:
• silnější interakce elektronů s materiálem (10 000x) – vhodná
technika pro zobrazování jednovrstevných 2D krystalů a
jednotlivých proteinových molekul (v RTG difrakci silnější vzorky -
µm)
• poskytuje přímé informace ve formě obrázků
4. Úvod
potíže se zobrazováním biologických molekul – vysoký šum
v elektronových mikrofotografiích
vynalezení technik obrázkové analýzy - zdokonalení poměru
signál-šum se provádí průměrováním stovek nebo tisíců 2D
projekcí – 2 základní metody:
• krystalografická - založena na filtrování obrázků dobře
uspořádaných velkých 2D krystalů (µm) – obtížné pěstování
• jednočásticová (nekrystalografická) – řeší náhodně orientované
jednotlivé molekuly velkých proteinů, virů a proteinů, které obtížně
krystalizují, také ale proteiny malých velikostí, i proteiny s nízkou
čistotou
5. Příprava vzorků
negativní barvení
• kontrast zesílen ukotvením biomolekul v roztoku soli těžkého kovu
• sušením sůl kovu vyplní dutiny a prostor kolem molekuly, ale
nepronikne dovnitř – velmi dobrý kontrast proteinových obálek
kryo-EM
• chlazením tenké vrstvy vodného roztoku makromolekul na mřížce
EM se vytvoří vrstva ledu, ve které jsou objekty viditelné bez
barvicího činidla
• kontrast je způsoben rozdílem hustoty mezi ledem a proteinem –
nižší ve srovnání s negativním barvením
• vhodná pro velké symetrické molekuly virů a průhledné vzorky
kryo-negativní barvení
• ukotvení vzorku v plně zledovatělé vrstvě barviva dává zřetelnější
signál
6. Jednočásticová EM
cílem jednočásticové EM je stanovení struktur makromolekul
z jednotlivých částic nebo z jednočásticových projekcí
izolované makromolekuly vykazují širokou škálu orientací a
rozdíly ve výsledných projekcích, aby bylo možné projekce
průměrovat, je nezbytné je nejprve uspořádat do
odpovídajících si pozic – rotační a translační posuny
• se zvyšujícím se počtem
projekcí dochází ke snížení šumu
superkomplex trimerického PSI cyanobakterie
Synechococcus obklopený anténním proteinem IsiA (kruh
18-ti kopií) poskytuje sadu 5000 jednočásticových projekcí
– negativně barvený vzorek
7. Jednočásticová EM
sčítání projekcí je však bezvýznamné v případě, že se
objevují v odlišných orientacích k rovině – data musí být
zpracována multivariační statistickou analýzou spolu s
automatizovanou klasifikací
po těchto krocích jsou nejvíce si podobné obrázky seskupeny
dohromady – výsledkem jsou třídy skupin homogenních
projekcí
z velkého množství sad projekcí pod různými úhly lze získat
3D rekonstrukce (v případě PSI-IsiA nebylo možné rozlišit
větší detaily – zploštělý objekt)
3D informace je významnější pro sférické objekty (ribozomy
a molekuly virů)
8. Jednočásticová EM
v letech 1980 a 1990 bylo provádění jednočásticových analýz
náročně, v současné době dochází k velkému vývoji ve směru
automatizace všech kroků – např. CCD kamery mohou být
programovány k záznamu stovek obrázků semi-
automatizovanou cestou
v blízké budoucnosti se očekává, že CCD kamery budou
nahrazeny přímými čítači elektronů, a že stanovení struktur
bude prováděno během několika hodin
Zernike fázový kontrastní mikroskop umožní získání vyššího
kontrastu nebarvených vzorků
speciální vydání časopisu strukturní biologie v r. 2007 se
věnovalo softwarovým nástrojům v makromolekulární EM,
zejména softwarovým balíčkům EMAN a SPIDER
9. Rozlišení v jednočásticových analýzách
v současné době je možné získat vysoké rozlišení pro velké,
stabilní, ve vodě rozpustné proteinové komplexy
bylo navrhnuto, že pro řešení vysokého rozlišení
nesymetrických objektů je potřeba více než 1000 000 částic –
ještě neprovedeno – u vysoce symetrických částic bylo takové
rozlišení již získáno
první řešený protein – protein viru (rotavir DLP) – k analýze
potřeba 8400 projekcí
méně symetrický protein GroEL – rozlišení 4 Å - rozlišen Cα
AK řetězce přímo z kryo-EM rekonstrukce
při středním rozlišení (pod 10 Å) byly stanoveny sekundární
struktury, např. α-helixy
10. Rozlišení v jednočásticových analýzách
metodou kryo-EM lze dosáhnout lepšího rozlišení než
metodou negativního barvení, nevýhodou však je nízký
kontrast, který vede ke snížené viditelnosti částic
jaderný ribonukleoprotein (snRNP) o velikosti 240kDa,
stanovený při 10 Å, je jednou z nejmenších částic určených
bez kontrastního činidla
vzhledem k vysokému kontrastu není metoda negativního
barvení ještě překonána – v krystalu katalázy zachovává
strukturní informace při rozlišení 4 Å (široce přijatý názor, že
tato metoda umožňuje rozlišení jen kolem 20-25 Å)
kryo-EM bylo u tohoto krystalu dosaženo rozlišení 2,8 Å
11. Rozlišení v jednočásticových analýzách
ve 2D mapách a 3D rekonstrukcích bylo dosaženo metodou
negativního barvení rozlišení 8-9 Å
kryo-negativně barvené struktury pod 10 Å byly získány z
GroEL a SF3b
ne všechny proteinové komplexy jsou vhodné pro stanovení
vysokého rozlišení – nevýhodou je, že udržují monodisperzi v
roztoku detergentu, který způsobuje, že projekce jsou na
okrajích nejasné
12. Rozlišení v jednočásticových analýzách
příklad jednočásticové
analýzy velkého, ve vodě
rozpustného proteinu
žížaly Lumbricus Terrestris
skládajícího se ze 180
podjednotek hemoglobinu
b) 11 Å, negativní barvení,
sečtení 1024 častic
c,d) 13 Å, 3D rekonstrukce
e,f) model vysoce rozlišené
RTG struktury – 3,5 Å
13. Nejnovější poznatky v jednočásticové EM
jednočásticová EM je nejúčinnější při řešení velkých, mnoho-
podjednotkových struktur, které nemohou snadno
krystalizovat, buď v 3D (RTG krystalografie) nebo ve 2D
(elektronová krystalografie)
v oblasti fotosyntézy jsou velmi důležité 2D mapy
fotosyntetických membránových proteinů, které jsou užitečné
v analýzách obvodových anténních komplexů, přestože
mnoho komplexů nebylo analyzováno pod 10-15 Å
velmi užitečné jsou zde aplikace při středním rozlišení, které
jsou kombinací EM a RTG struktur
14. Nejnovější poznatky v jednočásticové EM
použití rapidního zmrazování v kryo-EM umožňuje studovat
konformační změny v proteinových komplexech během
katalýzy v řádu milisekund (nejlépe prostudováno u
ribosomu)
dalším příkladem použití kombinace EM a RTG struktur je
hemoglobin žížaly, který byl krystalizován před více než 60
lety, v době, kdy krystalizace byla pouze metodou k čištění
proteinů
EM má schopnost pracovat s částečně čištěnými nebo vůbec
nečištěnými částicemi z rozpuštěných membrán – pro
konečné určení jsou nezbytné biochemické techniky a
hmotnostní spektrofotometrické analýzy
15. Flexibilita velkých proteinových komplexů
jednočásticová EM umožňuje získat představu o flexibilitě
mnoho-podjednotkových komplexů
zkoumána na příkladu superkomplexu PSI-IsiA, který se v
cyanobakteriích vytváří jako odpověď na stresové podmínky
přes velké množství zpracovaných projekcí bylo v
projekčních mapách PSI-IsiA rozlišeno relativně málo detailů
a) superkomplex skládající se z
trimerického PSI a kruhu z 18 kopií IsiA
b,c) monomerické PSI s kruhy ze 14 a 21
kopií IsiA, neostrost je způsobena
rotační flexibilitou (v průměru 2-3 ) mezi
kruhy
d,e) monomerické PSI s nekompletním
vnitřním a vnějším kruhem, vnitřní kruh
se skládá z 6 (1/3), vnější z 6-7 kopií
IsiA
f) monomerické PSI s nekompletním
vnitřním a vnějším kruhem s velkým
množstvím IsiA kopií - neostré
16. Flexibilita velkých proteinových komplexů
dalším studovaným komplexem je superkomplex C2S2M2 z
PSII, který se skládá z dimerického C2 jádra a dvou LHCII S-
trimerů a M-trimerů
projekční mapy (13 Å) ukazují, že M-trimer je v pozici hůře
fixován než S-trimer
• při pokusu o zaostření
středu komplexu a S-
trimeru byly značně
rozostřeny okraje
komplexu, což jasně
indikuje, že komplex
není vůbec rigidní
17. Analýzy prováděné bez čisticích kroků
izolované fotosyntetické membrány mohou být rozpuštěny a
kompletní sady proteinů mohou být použity pro EM
po jednočásticové analýze mohou být větší membránové
proteinové projekce setříděny a průměrovány
některé získané projekce mohou být jednoduše určeny podle
tvaru a velikosti (PSI, PSII a ATP syntáza)
galerie 2D projekčních map rozpuštěných membránových
komplexů cyanobakterií Thermosynechoccus elongatus a
Synechocystis PCC 6803 je na následujícím slidu
strategie „nečištění“ byla také úspěšně aplikována na
superkomplex PSI-LHCII Arabidopsis thaliana, který je
obtížné čistit
18. Analýzy prováděné bez čisticích kroků
a) NDH-1 z T. elongatus, boční pohled, extra
hustota na hydrofóbním rameni
b) NDH-1 z T. elongatus, horní pohled
c) čištěné NDH-1 z Synechocystis, detergent
dodecyl maltoside – ztráta specifické
podjednotky
d) dimerický komplex PSII z Synechocystis
e) dvojitý dimerický komplex PSII z
Synechocystis
f) tyčinkovitý proteinový komplex neznámého
původu a funkce z T. elongatus
g,h) ve vodě rozpustné šestiúhelníkové částice
i) cyanobakteriální fragment s trimerickou
symetrií
j) trimerický PSI komplex
k) proton komplexu ATP syntázy
l) GroEL-GroES superkomplex
19. Použitá literatura
BOEKEMA, E. J., FOLEA, M., KOUŘIL, R., 2009:
Single particle electron microscopy, In Photosynthesis
Research: s. 189 – 196.
