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2009 年 第 6 期研究报告                                                            中                                             ...
2009 No. 6     84      S e ria l No. 207                  C h ina B rew ing                                               ...
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  1. 1. 2009 年 第 6 期研究报告 中      国 酿 造 总第 207 期   83 雀稗麦角菌原生质体诱变育种及发酵条件研究 3 韩增飞 ,刘志国 ,曾丽娟 ,房国梁 ,付云洁 (武汉工业学院 生物与制药工程学院 ,湖北 武汉 430023) 摘   : 为获得麦角碱高产菌株 ,提高雀稗麦角菌 ( C laviceps paspa li stra in 3103 )发酵的产碱率 ,用溶壁酶水解处理菌丝体 、 要 不同浓度 的亚硝基胍诱变处理制备的原生质体 ,经再生培养获得诱变菌株 ,再经紫外初筛后进行发酵复筛 ,采用 Van2 rk 方法测定产碱量 。 U 筛选得到的高产菌株进行二级发酵并优化其发酵条件 。实验结果表明 ,经亚硝基胍诱变处理 ,麦角总碱的产率由 90mg /L 提高到了 1600mg/L,增加了约 16 倍 ;单位产碱率由 221 5mg /L / g提高到了 400mg /L / g,增加了约 17 倍 ; 连续传代培养可以得到稳定的高产菌 株 ,接种量为 20% 时可有效缩短发酵周期 。结果表明 ,用亚硝基胍对原生质体进行诱变处理可有效提高 C 1papspa li的产碱率 。 关     : 雀稗麦角菌 ; 原生质体 ; 亚硝基胍 ; 诱变育种 ; 发酵 键 词 中图分类号 : Q 933; TS201 1     3 文献标识码 : A    文章编号 : 0254 - 5071 (2009 ) 06 - 0083 - 04 Protopla st m utagenesis of C la viceps paspa li and opti iza tion of ferm en ta tion cond ition s m 3 HAN Zengfei, L I Zhiguo , ZEN G L ijuan, FAN G Guo liang, FU Yunjie U ( S chool of B iology and Pha r aceu tica l Eng ineering, W uhan Poly techn ic U n iversity, W uhan 430023, Ch ina ) mAbstract: The strain of C laviceps paspa li p roducing higher yield of ergot alkaloids was obtained through p rotop last mutagensis, in which the myceliumof C laviceps paspa li was first treated by lywallzyme and the different concentrations of the nitrosoguanidine, and the stable mutants was obtained afterthe p ri ary screen of UV and second screen of fer m mentation. The p roductivity of ergot alkaloids was measured by the method of Van 2 rk. The results Ushowed that the p roductivity of ergot alkaloids was increased by 16 folds ( from 90mg /L to 1600mg /L) and the unit p roductivity of ergot alkaloids wasincreased by 17 folds ( from 221 5mg /L / g to 400mg/L / g) . Inoculum of 20% could short the period of fer mentation. These results indicated that thep rotop last nitrosoguanidine mutagenesis was a feasible app roach to increase the p roductivity of lysergic am ide by the C. papspa li strain.Key words: C laviceps paspa li; p ro top lasts; nitro soguanidine; m utagenesis; fer entation m  雀稗麦角菌 ( C. paspa li) 属麦角菌属 , 其主要产生结构 集 , 本实验室保藏 ; 原生质体高渗液 : KCl 01 7mol /L; 溶壁简单的棒状麦角衍生物 (如麦角酰胺 ) , 此类药物在临床 酶 : 广东微生物研究所生产 ; VAN 2 URK 试剂 : 35mL H2 O ,上用于治疗神经内分泌 、 脑血管系统的疾病 (如老年性痴 65mL 浓 H2 SO4 , 01 15mL 10% ( w / v) FeCl3 , 200mg对二甲氨 [1 ]呆 ) 以及产后止血或作为原料用于合成其他重要药物 。 基苯甲醛 。因野生麦角产量不足 , 并受到自然条件的限制 , 麦角碱主 斜面培养基 : 去皮马铃薯 200g, 切块煮沸 01 后过 5h要依赖发酵生产 。近几十年来 ,国外科研人员在菌种的选 滤 ,加琼脂 20g, 葡萄糖 20g, 加水至 1000mL , 用浓氨水调 pH 值为 51 。 [2 ]育、 发酵技术及培养条件等方面进行了研究 。国内也有 2 : 豌豆汁 01 , 琥珀酸 1% , 甘 [3 ]利用麦角菌发酵生产麦角酰胺 、 麦角新碱和麦角隐亭的报 液体菌丝体培养基 3%道 。由于雀稗麦角菌是多核细胞 ,一般培养条件下不易产 露醇 4% , KH2 PO4 1% , MgSO4 ・ 2 O 01 7H 03% 。双蒸水配生分生孢子 ,发酵周期长 、 麦角碱产率低 、 生产成本高 , 因 制 ,用浓氨水调 pH 值为 51 。 2此难以大规模应用于工业生产 。至今国内的麦角碱类药 黄豆汁再生培养基 : 黄豆粉 01 , 葡萄糖 1% , 甘露 5%物仍然依赖进口 。 醇 10% , ,琼脂 2% 。双蒸水配制 ,浓氨水调 pH 值为 51 。 2 本实验前期采用原生质体紫外诱变的方法对麦角 [4 ] 初筛 培 养 基 : 甘 露 醇 5% , 琥 珀 酸 3% , KH2 PO4菌进行改造 , 麦角碱产率显著提高 , 从 20m g /L 提高为 01 , 琼脂 2% , M gSO4・ 2 O 01 1% 7H 03% , 双蒸水配制 , 用浓 氨水调 pH 值为 51 。 [3 ]90m g /L 。为进一步提高产碱率 , 在前期紫外诱变改 2造的基础上 , 研究了亚硝基胍诱变方法 , 并对发酵条件 MYG培养 基 : 麦 芽糖 01 , 酵母 膏 01 , 葡 萄 糖 5% 5%进行优化 , 为发酵生产麦角碱类药物奠定基础 。 1% ,甘露醇 01 6mol /L。1 材料和方法 CY 培 养 基 : 蛋 白 胨 01 , 酵 母 膏 01 , 甘 露 醇 M 2% 5%11 材料与仪器 1 01 6mol /L。 雀稗麦角菌 ( C lavice paspa li strain 3101 ) : 由 国 外收 PDA 培养基 : 土豆提取液 20% , 葡萄糖 20% , 蔗糖      收搞日期 : 2009 2 2 02 26     作者简介 : 韩增飞 ( 1984 2) ,男 ,山东临沂人 ,硕士研究生 ,研究方向为微生物生物技术 ; 刘志国 3 ,教授 ,通讯作者 。
  2. 2. 2009 No. 6   84   S e ria l No. 207 C h ina B rew ing Research Report01 6mol /L。 离心 5m in, 取上清液 1mL ,加 2mL Van 2 rk 试剂 ,室温静置 U 发酵复筛培养基 : 初筛固体培养基去掉琼脂 。 4h 后 ,于波长 550nm 处测定吸光度值 ,以麦角酰胺标准物 RMYG、 M、 RCY RPDA 分别 为 M YG、 M、 CY PDA 加上 配制标准系列按上述同样方法检测并绘制标准曲线 , 得到2%琼脂 。 标准曲线方程为 y = 01 0082x + 01 001, y为波长 550nm 处的 高速离心机 : 上海安亭科学仪器厂 ; 高速离心机 吸光度值 , x 为麦角酰胺浓度 μg /mL ) , 此法测定的是胞 (( CF 215R ) : 日本日立 ; 紫外可见分光光度计 ( WV8500 ) : 外的麦角碱含量 。上海精密仪器科学有限公司 ; 三用紫外分析仪 ( ZF 2 ) : 1 菌丝体用 4%酒石酸与丙酮 ( 1 ∶ ) 的混和液浸提 , 用 1江苏海门其林医用仪器厂 ; 多用途微量检测仪 ( DNA Ex2 匀浆机高速匀浆 , 4000 r/m im 离心 5m in, 取上清液同上测pert) : Austria GmbH。 [7] 定 (细胞内麦角碱 ) 。11 方法 2 11 1 菌株的发酵研究 2511 1 菌丝体培养 21 将雀稗麦角菌种接种到新鲜斜面培养基中 , 于 25 ℃~ 取适量于 27 ℃培养的菌种斜面幼嫩菌苔于研钵中研 26 ℃活化培养 7d。斜面培养后 , 用接种针挑取幼嫩菌丝磨 ,并接入菌丝体培养基中 , 27 ℃静置培养 3d ~4d, 用滤 于研磨器中 ,加水研磨至看不到菌丝块为止 ,用吸管接入盛网过滤收集菌丝体 。 有 100mL 液体种子培养基的三角瓶 (体积为 250mL ) 中 , 在11 1 原生质体的制备 22 27 ℃、160r/m in ~180 r/m in 避光振荡条件下培养 4d ~5d, 作 菌体培养液 4000r/m in 离心 5m in,收集菌丝体 ,先用无 为一级种子。将一级种子以 20%接种量转接到新鲜液体培菌水离心冲洗 1 次 ,再用 01 mol /L KCl离心冲洗 2 ~3 次 , 7 养基中培养 3d ~4d 作为二级种子 [8 ] 。按 01 ∶ (菌丝体 ∶ )的比例加入含 10mg/mL 溶壁酶 2g 1mg 酶液 将原始菌株和诱变菌株的二级种子以 20%接种量接的高渗液中 ,在 28 ℃恒温水浴酶解 2h,每隔 15m in 振荡 1 次 入发酵培养基中 , 26 ℃ 28 ℃、 r/m in ~180 r/m in 避光振 ~ 160以利于细胞壁消化及原生质体的释放。酶解结束后 , 用无 荡条件下培养 14d ~15d。每 24h 取发酵上清液测其产碱菌脱脂棉柱过滤 , 离心收集沉淀并用 01 7mol /L KCl 洗涤离 量 ,确定原始菌株和诱变株的产碱规律 。心 ( 4000 r/m in、 in ) 2 ~3 次 ,最后得到的原生质体溶液在 5m 将诱变菌株的二级种子分别以 10% 、 、 、 、 15% 20% 25% [5 ]血球计数板上进行计数 , 4 ℃冷藏待用 。 30%的接种量接入发酵培养基中 , 25 ℃~28 ℃、 r/m in ~ 16011 1 原生质体的诱变与再生 23 180 r/m in 避光振荡条件下培养 14d ~15d。每 24h 取发酵 在通风橱中用 pH61 的 PBS 将亚硝基胍的四氢呋喃 0 上清液测其产碱量 。饱和液稀释成 1 ∶ 、 ∶ 、 ∶ 、 ∶ 10 1 20 1 200 1 2000 的 4 个不同浓 2 结果与讨论度 。向盛有 01 5mL 原生质体悬浮液的 EP 管中加入 01 1mL 21 液体菌丝体培养基对菌丝体生长及原生质体形成的影响 1不同浓度的亚硝基胍溶液 ,于 27 ℃避光反应 30m in。各管 在探索 C laviceps paspa li strain 3101 的菌丝体培养条分别加入 01 5mL 01 7mol /L 的 KCl 溶液混匀 , 4000 r/m in 离 件及在该条件下产生的菌丝体对原生质体形成的影响时 ,心 5m in,洗涤终止诱变 ,弃上清 , 重复洗涤 2 次后用 01 5mL 使用了豌豆汁 、 MYG、 M、 CY PDA 4 种培养基 ,结果见表 1。01 7mol /L 的 KCl溶液悬浮原生质体 。 表 1 液体培养基对菌丝体生长及原生质体形成的影响 分别取未诱变和诱变后的原生质体 01 1mL 涂布到黄  Ta b le 1 1 Effe c t o f liqu id m e d ium o n m yce lia g row th a nd p ro top la s t豆汁再生平板上 , 用黑布包裹平板在恒温培养箱中 27 ℃ fo rm a tio n静置培养 5d ~7d 后观察结果 。 项目 豌豆汁液体培养基 MYG CYM PDA 菌丝体生长状况11 1 高产菌株的筛选 ++++ ++ ++ ++ 24 原生质体数量 ++++ ++++ ++ + 将再生的单菌落接种到初筛培养平板上 , 于 27 ℃培 正常 , 正常 , 原生质体形态 正常 ,圆球形 小 ,畸形养 10d ~13d。根据麦角碱类物质具有荧光反应的特性 , 圆球形 圆球形    :“ + ” 注 的多少表示生长状态或数量的多少 。将菌株置于紫外灯下观察荧光 ,根据荧光强度差异筛选高产菌株 ,如此反复筛选 2 ~4 次 。将初筛选出的菌株于盛 从表 1 可见 ,用豌豆汁液体培养基培养的菌丝体长势有 50mL 发酵培养基的试管中发酵培养 , 27 ℃、 r/m in 180 最好 ,用其制备的原生质体数量最多 ,形态最好 ,故选用豌振摇培养 11d ~15d 后 , 取发酵上清液进行总碱测定 。取 豆汁液体培养基培养菌丝体 。发酵复筛得到的高产菌株进行连续传代培养 ,选取稳定的 21 再生培养基对原生质体再生的影响 2高产菌株 [6 ] 。 原生质体失去了细胞壁的保护 , 极其脆弱 , 因而其再 用 Van2 法测定总碱含量 , 取发酵菌液经 4000r/mim Urk 生条件十分苛刻 。其中再生培养基是一个重要的方面 。
  3. 3. 2009 年 第 6 期研究报告 中      国 酿 造 总第 207 期   85在实验中 ,将原生质体接种到 RMYG、 M、 RCY RPDA、 黄豆 21 发酵筛选结果 4汁培养基中 ,结果见表 2。 液体菌丝体培养基制备的原生质体悬浮液 (数量级为 8 表 2 原生质体在不同再生培养基上的再生情况 10 )用不同浓度的亚硝基胍处理 ,将诱变后的原生质体涂布 Ta b le 2 1 The re ge ne ra tio n o f p ro top la s ts o n d iffe re n t m e d ium s 到黄豆汁培养基上再生后 ,初筛选取荧光反应强的菌株进行 RMYG RCYM RPDA 黄豆汁培养基 发酵复筛 ,结果 (表 3)可见 ,亚硝基胍浓度为 1 ∶ 时 ,经过多 10 + - - ++++   :“ + ” 注 的多少表示生长状态或数量的多少 ,“ - ” 表示没有再生菌 轮诱变处理其高产菌株 A22 的产碱率达到 12001 5 244mg /L。落生成 。 经过连续传代培养 ,其麦角碱的产率较稳定 。 从表 2 可见 ,由豌豆汁液体培养基制备的原生质体在 表 3 亚硝基胍对麦角酰胺产生菌原生质体的诱变黄豆汁培养基上再生数量最多 , 再生效果最好 , 故再生培 Ta b le 3 1 Effe c t o f N TG o n m u ta tio n o f C. p a sp a li p ro top la s t p ro duc ing lyse rg ic a c id am ide养基应选用黄豆汁培养基 。 处理时间 / 诱变存活率 / 产碱率 /21 不同浓度的亚硝基胍处理后的再生情况 3 NTG浓度 m in % 菌株数 突变株 (mg L - 1 ) ・ 1∶ 2000 30 201 8 400 D1 22 6671 073 1∶ 200 30 151 6 400 C1 23 7511 22 1∶ 20 30 121 8 400 B2 24 7751 61 1∶ 10 30 101 5 400 A2 25 12001 244 将得到的高产菌株 A2 2 和原始菌株 B10 的胞内 、 5 胞 外和总碱产量变化进行比较 ,结果见图 3。A、 、 、 分别为用磷酸缓冲液将亚硝基胍的四氢呋喃饱和溶液按 B C D1∶ 、 ∶ 、 ∶ 、 ∶ 10 1 20 1 200 1 2000 梯度稀释诱变后在再生培养基上生长情况 图 1 原生质体在不同浓度的亚硝基胍处理后再生结果F igu re 1. Effe c ts o f the d iffe re n t co nce n tra tio n N TG o n the re ge ne ra 2 tio n o f p ro tap la s ts 1 为原始菌株 ; 2 为高产菌株 实验用 4 个浓度梯度亚硝基胍进行诱变 , 由图 1 可以 图 3 原始菌株和诱变菌株胞内 、 胞外总碱产量比较看出 ,随着浓度的增加 ,再生的菌落急剧减少 ,表明亚硝基 F igu re 3. Com p a riso no f in tra ce llu la r a nd e xtra ce llu la r e rgo t a lka lo id胍对原生质体具有杀伤作用 ,取浓度为 21 × 个 /mL 的 8 5 10 co nce n tra tio n be tw e e n o rig ina l s tra in a nd m u ta ge n s is s tra in原生质体悬浮液 01 1mL 涂布平板 ,不同浓度的平板再生菌 由图 3 可见 ,诱变后得到的高产菌株胞外的麦角碱产落数量见图 2。 率比原始菌株提高了约 19 倍 , 胞内的产碱率提高了约 12 倍 ,麦角总碱产率为 11 6g/L 左右 。 21 原始菌株 B10 与诱变菌株 A2 2 发酵曲线比较 5 5 用亚硝基胍对雀稗麦角菌的原生质体进行诱变筛选 得到的高产菌株胞外总产碱量和单位产碱量都比原始菌 株有了明显的提高 ,结果见图 4。 21 不同接种量对诱变菌株 A2 2 胞外产碱率的影响 6 5 麦角菌发酵周期较长 ,合适的接种量可以在提高产量 的前提下有效地缩短发酵周期 。在实验室前期工作确定 [3 ] A、 、 、 分别为用磷酸缓冲液将亚硝基胍的四氢呋喃饱和 B C D 的最佳发酵条件 基础上 ,着重对接种量进行了研究 。由 溶液按 1 ∶ 、 ∶ 、 ∶ 、 ∶ 进行梯度稀释后的浓度 2000 1 200 1 20 1 10 图 5 可以看出 , 接种量为 20% 、 发酵第 12d 时产碱率达到 图 2 原生质体在不同浓度的亚硝基胍处理后再生数量比较 最大值且发酵周期最短 ,在保证产碱率前提下可以缩短发 F igu re 2. Com p a riso n o f p ro tap la s ts re ge ne ra tio n qua n tity a fte r tre a te d by d iffe re n t co nce n tra tio n N TG 酵时间 。
  4. 4. 2009 No. 6   86   S e ria l No. 207 C h ina B rew ing Research Report 影响原生质体形成的因素很多 ,如培养基成分会直接 影响菌丝细胞壁的构成 ,从而使细胞壁对酶的敏感性发生 相应的变化 ,影响原生质体的释放 。此外菌丝体的菌龄 、 渗透压稳定剂的种类 、 值 、 pH 酶解温度和酶解时间等因素 及渗透压稳定剂的种类和 pH 值也是影响原生质体释放 [9 ] 的重要因素 。 影响原生质体诱变后再生的因素主要是再生培养基 的成分 ,有些研究表明用 RMYG 培养基本再生可得到大 量再生菌落 , 但实验用 RMYG 培养基未得到再生菌落 。 在探索再生 培养 基 的条 件 时 , 尝试 了几 种 再生 培 养基 ( RCY 、 M RPDA、 黄豆汁再生培养基 ) , 发现原生质体在黄 豆汁再生培养基上再生效果最好 。 接种量的选择对缩短麦角菌的发酵周期非常重要 , 即 在不影响产碱量的前提下如何使菌体密度在最短时间内 达到最大 ,从而缩短麦角菌的发酵周期 。本实验表明 , 当 接种量为 20%时 ,麦角碱达到最大产量所用的时间最短 , 且产碱量最高 。因此本实验选择 20%的接种量 。 图 4 原始菌株与诱变菌株胞外 (A ) 胞外单位产碱量 (B ) 产碱量 不同浓度的 NTG进行诱变处理均能得到稳定的高产F igu re 4. C u rve s o f (A ) 、 xtra ce llu la r(B ) e rgo t a lka lo id p ro duc tio n by e o rig ina l s tra in a nd m u ta ge n s is s tra in 菌株 ,国内用麦角菌的原生质体进行诱变育种的报道较 少 ,通过上述研究 , 找到了一条快速 、 有效提高麦角酰胺产 率的途径 。在对得到的高产菌株的发酵条件进行优化后 , 麦角碱的总产碱量达到 11 /L 左右 , 为工业发酵生产麦 6g 角碱类药物奠定了基础 。 参考文献 : [ 1 ] 刘志国 ,王亚林 ,赵静国 , 等 . 雀稗麦角菌产麦角碱发酵条件的优化 [ J ]. 化学与生物工程 , 2004 ( 2) : 18 2 1 21 [ 2 ] 朱   ,王   ,朱慧新 , 等 . 50mL 管摇床培养暨 24 孔板法筛选麦 平 全 角菌突变株 [ J ]. 微生物通报 , 2000, 27 ( 3) : 192 2 1 194 1 为 25%接种量 , 2 为 30%接种量 , 3 为 10%接种量 , [ 3 ] 陈江源 ,代江红 ,刘志国 ,等 . 麦角酰胺产生菌原生质体的紫外诱变 4 为 15%接种量 , 5 为 20%接种量 。 育种 [ J ]. 化学与生物工程 , 2005 ( 7) : 33 2 1 35 图 5 不同接种量对菌株 A2 - 5 产碱率的影响  F igu re 5. Effe c ts o f d iffe re n t ino cu lum s o n p ro duc tivity o f e rgo t [ 4 ] SR IKRA I S, ROBBERS JE. Methods for mutation and selection of the a lka lo id s by s tra in A2 2 5 Ergot Fungus [ J ]. App l Environ M icrob, 1983, 45 ( 4) : 1165 21169. [ 5 ] BO ICHENKO LV , ZELENKOVA NF, AR I BASAROV MU , et a l Op 2 N .3 讨论 tim ization of Conditions for Storage and Cultivation of the Fungus C lavi2 雀稗麦角菌细胞是多核的 ,一般培养条件下不易产生 ceps sp. , a p roducer of the Ergot A lkaloid A g roclavine [ J ]. App l B iochem分生孢子 ,本文用溶壁酶处理菌丝体制备原生质体 , 然后 M icrob, 2003, 39 ( 3) : 294 2299. [ 6 ] 何惠霞 , 朱  平 , 李焕娄 . α2 角隐亭产生菌的原生质体诱变育种 麦以不同浓度的亚硝基胍对原生质体进行诱变处理 ,通过初 [ J ]. 真菌学报 , 1996, 15 ( 3) : 215 2 1 219筛和复筛选出高产碱量的菌株 。 [ 7 ] 袁   ,杨庆尧 . 麦角隐亭产生菌的营养条件 [ J ]. 南京师范大学学 萍 进行菌丝体培养时 ,雀稗麦角菌在豌豆汁培养基中菌 报 , 1996, 19 ( 3) : 63 2 1 68 [ 8 ] 王亚林 ,赵静国 ,熊万斌 . 产碱麦角菌发酵培养基的研究 [ J ]. 武汉工丝体生长情况较好 。实验以豌豆汁培养基在 27 ℃、 r / 180 业学院学报 , 2003, 22 ( 2) : 1 23.m in 摇床避光振荡培养菌丝体 7 d ~8d, 将其作为一级种 [ 9 ] 龚淑俐 ,邓放明 ,陈力力 . 金针菇原生质体制备的研究 [ J ]. 现代食品子转接到新鲜豌豆汁培养基中继续培养 2d ~3d, 发现菌 科技 , 2006, 23 ( 4) : 54 2 1 57丝体连在一起呈放射状 、 长势好 , 由其制备的原生质体呈 [ 10 ] 钱秀萍 ,冯慧琴 ,杨庆尧 . 用琼脂柱筛选麦角隐亭产碱菌株 [ J ]. 微 生物学报 , 1997, 37 ( 1) : 76 2 1 78圆球形 、 体积大 、 数量多 , 在黄豆汁培养基上再生效果好 , [ 11 ] DAN IEL G PANACC I NE, CHR ISTI E MC. Abundant Resp irable . O N故实验菌丝体的培养选取豌豆汁液体培养基 ,以其培养的 Ergot A lkaloids fron the common A irborne Fungus A spergillus fum igatus二级种子作为原生质体制备的材料 。 [ J ]. App l Environ M icrob, 2005, 71 ( 6) : 3106 23111.

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