干旱胁迫下开花期玉米消减文库的构建及分析

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干旱胁迫下开花期玉米消减文库的构建及分析

  1. 1. zycnzj.com/ www.zycnzj.com  41 卷   4 期 第 第 山            ( 理     ) 东 大 学 学 报 学 版 2006 年 8 月    Vol. 41   No. 4                     Aug. 2006   JOURNAL OF SHANDONG UNIVERSITY 文章编号 :167129352 (2006) 0420168205 干旱胁迫下开花期玉米消减文库的构建及分析 1 2 1 13 岳桂东 ,胡孝瑞 ,庄云龙 ,张举仁 (1. 山东大学生命科学学院 , 山东 济南 250100 ;2. 山东大学国防科学技术研究院 , 山东 济南 250100) 摘要 : 分别以 1 d 干旱和 7 d 干旱处理的开花期玉米顶叶 cDNA 为 tester ,正常生长的玉米顶叶 cDNA 为 driver ,利用 抑制性差减杂交技术构建了两个干旱胁迫下开花期玉米消减文库 . 两个文库的重组率均高于 95 % ,插入片段集中 在 300~600 bp 之间 . 对两个文库部分克隆进行测序发现 ,文库中含有脱水素 、 蔗糖合成酶 、 甜菜碱醛脱氢酶 , DRE 结合因子等大量的抗旱相关基因 , 说明两个干旱胁迫下开花期玉米抑制性消减文库已经构建成功 , 且具有重要 意义 . 关键词 : 玉米 ; 抗旱 ; 抑制性消减杂交 中图分类号 :Q786    文献标识码 :A Construction and analysis of suppression subtractive hybridization library from the leaves of maize flowering plants under Drought Stress YUE Gui2dong1 , HU Xiao2rui2 , ZHUANG Yun2long1 and ZHANGJu2ren1 3 (1. School of Life Science , Shandong Univ. , Jinan 250100 , Shandong , China ; 2. National Defence Technology Institute , Shandong Univ. , Jinan 250100 , Shandong , China) Abstract : In order to identify genes induced during the drought stress response in flowering maize ( Zea mays) , suppression sub2 tractive hybridization ( SSH) was performed using cDNAs prepared from flowering maize leaves treated with drought stress for one 2 day and 7days as testers and cDNAs from unstressed flowering maize leaves as drivers. T subtractive cDNA libraries were con wo structed , in which the rate of recombination was 95 % and the size of inserts ranged from 300 bp to 600 bp. Analysis of sequences from the positive clones picked randomly revealed that many drought stress associated genes , including dehydrin , sucrose synthase 2 3 , betaine aldehyde dehydrogenase and DRE binding factor 1 , etc. , were obtained. The successful construction of the two subtract ed cDNA libraries enables us to identify new different expressed genes involved in the resistance mechanism of flowering maize . Key words : maize ; drought stress ; suppression subtractive hybridization   据统计 ,在世界范围内 ,干旱缺水对农业和社会 隆开花期玉米干旱胁迫诱导表达的基因 、 鉴定其功造成的损失相当于其他各类自然灾害造成的损失之 能、明确其在植物抗旱性方面的作用 ,是开展玉米抗 [1 ]和 . 玉米是全球第一大作物 、 我国第二大作物 , 干 旱基因工程研究的重要内容 .旱是影响其产量的重要限制因素 , 一般可使玉米减 抑制差减杂交 ( SSH) 是近年发展起来的一种简 [5 ]产 20 %~30 %. 玉米对干旱的反应取决于新陈代谢 便而高效的差异表达基因筛选技术 , 该技术通过 [2 ]能力 、 形态结构和发育阶段 ,开花期是玉米需水临 两轮差减杂交和两次抑制性 PCR , 使差异表达基因界期 , 对干旱胁迫反应最敏感 , 此时逢遇干旱会使 得到有效的富集并得以克隆 , 在分离克隆差异表达 [3 ,4 ] [6 ]产量下降幅度最大 . 利用分子生物学方法分离克 基因的应用上表现出了独特的优越性 . 目前 ,采用收稿日期 :2005212223基金项目 : 国家 863 项目 (20022AA2212071) 资助作者简介 : 岳桂东 (19792   男 ,博士生 ,研究方向 : 玉米基因组学 . )3 通讯作者 zycnzj.com/http://www.zycnzj.com/ © 1994-2007 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
  2. 2. zycnzj.com/ www.zycnzj.com  4期 第 岳桂东 ,等 : 干旱胁迫下开花期玉米消减文库的构建及分析   169  SSH 技术研究植物抗逆基因已成为植物生物学研究 primer1和 nested primer2R 进行第一次 PCR 扩增和第 [7 ]的热点之一 . 二次 PCR 扩增 .  本工作利用 SSH 技术构建了 1 d 干旱和 7 d 干 以未 消 减 组 的 PCR 结 果 作 对 照 . 将 tester2旱胁迫下开花期玉米抑制性消减文库 , 对文库部分 1cDNA和 tester22RcDNA 混合制备成 12C 作为 PCR 反克隆进行了测序和应用生物信息学工具进行分析 , 应模板 ,同样以引物 primer1 及巢式 PCR 引物 nested发现了一批抗旱相关基因 , 为获得玉米全长抗旱基 primer1 和 nested primer2R 进行第一次 PCR 扩增和第因和开展抗旱基因工程研究是有意义的 . 二次 PCR 扩增 . 1. 2. 4  cDNA 文库的构建1 材料与方法 从上述的差减杂交 cDNA 的二次 PCR 产物 ( 共 μ ) 中 取 出 3 μ , 与 1 μ p GEM T2Easy Vector 25 L L L1. 1  实验材料 ( 50 ng) 在 4 ℃下连接过夜 . 从连接体系 10μ 中取 L 实验所用植物材料为玉米骨干自交系 DH4866. 2μ 用反应液转化 DH5a 感受态细胞 , 于 X2galΠ L IPTG ○ α R大肠杆菌 DH5 由实验室自己保存 ,Oligotex mRNA Amp 琼脂平板上挑取白色菌落 ,点种于盛有液体 LBKit 购自 QIAGEN 公司 , PCR2select 培养基的 96 孔板中 ,37 ℃培养过夜后 , 加 15 % 甘 Tm cDNA SubtractionKit 购自 Clontech 公司 ,HotStart Taq 酶和 DNA Marker 油 ,液氮速冻 , - 70 ℃ 保种 .购自 Takara 公司 ,TΠA 克隆载体 p GEM2T easy Kit 购 1. 2. 5  DNA 测序与序列分析自 PROMEG 公司 . A 挑取文库阳性克隆在 37 ℃,220 rΠ 振荡下过 min1. 2  方法 夜培养 ,用碱裂解法提取质粒 ,测序工作由山东大学1. 2. 1  材料的处理 生命科学学院核酸测序中心完成 . 序列经去除载体 挑选大小均一饱满的种子种在花盆中 , 待玉米 序列和引物序列后 ,将所得的 EST 用 BLAST 软件搜雄穗抽出顶叶时分两组 ,一组正常浇水作为对照 ,另 索 GeneBank 进行同源性分析 .一组进行干旱处理 ,在胁迫处理后第 1 、、、 d 早晨 3 5 7和下午从顶叶下第 3 片叶剪取小块用于渗透势测 2 结果与分析定 ,并根据测定值确定浇水量以维持植株处于干旱胁迫状态 . 在干旱胁迫处理过程中 , 分别取干旱处 2. 1  干旱处理的鉴定理 1 d 和 7 d 植株的顶叶和同期对照植株的顶叶用 本实验中 ,在不同时间段剪取干旱胁迫处理的于构建抑制性消减文库 . 顶叶离体后迅速用液氮速 和未干旱处理的叶片用于渗透势测定 ,结果见图 1.冻 , - 70 ℃保存 . 由结果可见干旱处理材料的叶片渗透势持续低于对1. 2. 2   RNA 的提取及 mRNA 纯化 总 照. 液氮研磨玉米叶片至粉末 , 采用酸酚 - 异硫氰 ○ R酸胍法提取总 RNA. 按照 Oligotex mRNA Kit 操作手册分离 mRNA.1. 2. 3  抑制性减法杂交 分别以干旱处理 1 d 和 7 d 的植株顶叶 cDNA 为tester ,以未处理植株顶叶的 cDNA 为 driver 进行抑制性减法杂交 ,具体操作依照 CLONTECH 试剂盒 PCR2 Tmselect cDNA Subtraction Kit 进行 . 即从总 RNA 中分离纯化出 mRNA 反转录合成 cDNA ,再将 tester cDNA 图1  叶片的渗透势 ( Ψ ) π用限制性内切酶 RsaI 酶切后分为两份 ,分别与接头 横坐标1 ,3 ,5 ,7 :在干旱处理的第 2 ,4 ,6 ,8 d 早晨 8 :00 测定叶1 、 (Adaptor 1 、 ) 连接 ,制成 tester21cDNA 和 tester2 2R 2R 片渗透势 ; 横坐标2 ,4 ,6 ,8 :在干旱处理的第 2 ,4 ,6 ,8 d 下午 15 :30 测定2RcDNA ,16 ℃连接过夜 . 然后将它们分别与 driver 叶片渗透势 .cDNA 进行第一次杂交 ,68 ℃ 杂交 8 h ,再将两组第一 Fig. 1  Osmolarity of leaves 1 ,3 ,5 ,7 : Osmolarity measured at 8 :00 AM. on the 2nd , 4th , 6th次消减杂交体系混合 , 再加入过量的变性 driver 进 and 8th day respectively ;行第 2 次杂交 ,68 ℃过夜 . 杂交产物稀释后 ,以第 1 2 ,4 ,6 ,8 : Osmolarity measured at 15 :30 PM. on the 2nd , 4th , 6th轮的 PCR 引 物 primer1 及 巢 式zycnzj.com/http://www.zycnzj.com/respectively. PCR 引 物 nested and 8th day © 1994-2007 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
  3. 3. zycnzj.com/ www.zycnzj.com   170 山            ( 理     ) 东 大 学 学 报 学 版 第 41 卷  2. 2  RNA 的提取和 mRNA 的分离 减基因得到了富集 . 消减产物经过两轮的消减杂交 紫外分光光度计检测总 RNA 在波长 230 nm 、 和两次抑制 PCR 后扩增出了弥散的条带 ,而未消减260 nm 、 nm 处的吸收值 , 得出 A 260Π 280 在 1. 9 280 A 的扩增条带亮度大 , 说明玉米干旱诱导基因得到了与 2. 0 之间 ,说明所提取的总 RNA 纯度较高 . 1. 0 % 很好的均一化和差减 .琼脂糖凝胶电泳检测 ,总 RNA 的 28SrRNA 、 18SrRNA两条带清晰锐利 , 亮度比基本上呈 2 ∶ 的关系 ( 图 12) ,表明 RNA 未出现降解 ,完整性比较好 . 图4  两轮 PCR 产物电泳图 M 为分子量 Marker DL2000 ; 1~4 为阴性对照 、 阳性对照 、 未差减对照 、 差减杂交产物的 第一次 PCR 产物 ; 5~8 为差减杂交产物 、 未差减对照 、 阳性对照 、 阴性对照的 第二次 PCR 产物 . Fig. 4   electrophoresis of the first and second PCR products The M. DL2000 ; 图2  玉米顶叶总 RNA 电泳图 Lane1~4. The first PCR products of negative control , positive con2 Fig. 2   otal RNA electrophoresis of maize leaves T trol , unsubtracted control and subtracted samples ; Lane5~8. The second PCR products of subtracted samples , unsub22. 3  双链 cD NA 的合成 tracted control , positive control and negative control. 用起始量为 2 μ 的 mRNA 反转录合成 cDNA , g 2. 5  SSH 文库的质量分析对反转录产物进行电泳 , 以确认 cDNA 的质量 . 从 蓝白斑检测显示干旱处理 1 d 和 7 d 两个玉米图 3 看出与试剂盒所提供的对照 mRNA 反转录合成 顶叶消减文库的重组率均高于 95 %. 从两个文库中的 cDNA ( 泳道 3) 相比较 ,用于建库的 cDNA ( 泳道 1 、 随机挑取 22 个白色克隆 ( 重组克隆) 进行菌落 PCR ,2) 同样在 300~3 000 bp 之间呈现出弥散条带 , 这表 观察到插入片段的大小分布在 250~850 bp 范围内 ,明 mRNA 和 cDNA 的质量都比较好 , 可以满足下一 主要集中在 350~600 bp 之间 ( 图 5) ,插入片段大小步实验的要求 . 符合要求 . 图5  消减文库部分克隆的 PCR 扩增结果 M 为分子量 Marker DL2000 ;1~22 为重组质粒 PCR 产物 . Fig. 5  PCR analysis of partial clones from the subtracted library M. DL2000 marker ; lane 1~ 22. PCR products from different clones. 图3  mRNA 反转录产物电泳图 2. 6  EST 序列分析 M 为分子量 Marker Π λ Hind Ⅲ; 对两个文库部分克隆进行测序分析 . EST 序列 1. 驱动 cDNA ;2. 检测 cDNA ; 3. 对照 cDNA. Fig. 3   The mRNA reverse transcript electrophoresis 检索发现 , 在这两个消减文库中含有脱水素 ( de2 Π Mindicatesλ Hind Ⅲ marker ; hydrin) 、 蔗糖合成酶 ( Sucrose synthase 3) 、 甜菜碱醛脱 1. driver cDNA ;2. tester cDNA ; 3. control cDNA. 氢酶 ( betaine aldehyde dehydrogenase) , DRE 结合因子2. 4  消减杂交后两次 PCR 的结果分析 (DRE binding factor 1) 等一批抗旱相关基因 . 参照拟 从图 4 看出 , 第一次 PCR 扩增的电泳带较弱 , 南芥中基因功能分类方法 , 这些 EST 序列分类见第二次 PCR 扩增后可看到明显的电泳带 ,这说明消 表 1. zycnzj.com/http://www.zycnzj.com/ © 1994-2007 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
  4. 4. zycnzj.com/ www.zycnzj.com  4期 第 岳桂东 ,等 : 干旱胁迫下开花期玉米消减文库的构建及分析   171   表 1  ESTs 所代表的基因功能分类 Tab. 1  Functional classification of the ESTs of partial clones from two subtracted libraries 功能分类 干旱处理 1 d 文库 EST 条数及举例 7 d 干旱处理文库 EST 条数及举例 氨基酸代谢 6 ; Ferredoxin2dependent glutamate synthase , monode2 7 ; amino2acid N2acetyltransferase , aminotransferase , hydroascorbate reductase , etc. etc. 糖类代谢 13 ; sucrose synthase 3 ,62phospho212fructokinase , etc. 12 ; sucrose synthase 3 ,carbonic anhydrase , etc. 脂类代谢 10 ; myo2inositol phosphate synthase ,acetyl2coenzyme A 7 ; C24 sterol methyl oxidase ,sterol2C5 ( 6) 2desaturase , carboxylase , etc. etc. 其他代谢 9 ; S2adenosylmethionine decarboxylase , betaine alde2 6 ; NADPH2cytochrome P450 reductase , inorganic py2 hyde dehydrogenase , etc. rophosphatase ,etc. 能量相关 4 ; succinic semialdehyde dehydrogenase non photosyn2 2 4 ; Chlorophyll aΠ 2binding protein CP29 precursor , b theticNADP2malic enzyme , etc. chlorophyll synthase , etc. 转录相关 28 ; phosphoinositide phosphatase , MADS domain tran2 2 19 ; BTH2induced protein phosphatase 1 , homeodomain scription factor zinc finger protein , etc. protein , DRE binding factor 1 ( dbf1) ,etc. 蛋白合成 13 ; 30S ribosomal protein S162like , ribosomal protein 14 ; ribosomal protein S4 , 40S ribosomal protein , etc. L19 , etc.蛋白质加工与降解类 15 ; lectin2like protein , ubiquitin2specific protease , 16 ; 10 kDa chaperonin , aspartic proteinase , etc. etc. 细胞信号转导 21 ; serineΠthreonine protein kinase , protein kinase 10 ; MAP kinase 5 , MAP kinase 4 , etc. AFC3 , etc. 26 ; sugar transporter , P2type ATPase Sucrose Trans2 14 ; sugar transporter ,plasma membrane H + 2ATPase , 细胞运输相关 porter , etc. etc. 13 ; dehydrin ( dhn22) ,phospholipase D heat shock 70 4 ; dehydrin ( dhn22) ,heat shock protein 70 , UVB2re2 细胞防御 K protein , etc. D sistance protein UVR8 , etc. 亚细胞定位 10 ; WD repeat protein ,histone H2A protein , etc. 9 ; O2acetylserine ( thiol ) lyase , Lysyl2tRNA syn2 thetase ,etc. 其他分类 18 ; RNA helicase , etc. 11 ; GTP2binding protein2like , etc. 未分类 103 88 总计 279 221 然该技术的一大缺点是在建库过程中 cDNA 需要经3 讨论 过限制酶消化从而得到的只是基因片段 , 但这些基 因片段可通过末端快速扩增 ( Rapid amplification of cDNA ends , RACE) 或者 Internet 网上电子克隆快速 植物在生长发育过程中 , 要受到许多不良环境 [10 ] 地得到基因的全长 . 与 cDNA microarray 相比 ,SSH的影响 . 为适应环境 , 在长期的进化中植物己逐渐 中两次 driver cDNA 均过量 , 可能会掩盖 tester cDNA建立起适应和抗性机制 . 当植物受到干旱胁迫时 , 中某些有表达差别的 cDNA 而丢失一些差异较小的植物体内会产生一系列生理生化反应 , 涉及大量的 基因 ,但 SSH 在分离差异表达基因中不需已知基因干旱胁迫反应基因的表达与调控 , 分离这些基因并 序列信息且具有上述的优点 ,可以认为 SSH 是高通鉴定其功能 ,明确它们在植物抗旱方面的作用 ,是近 量分离植物抗旱基因的首选技术 . 本实验结果为该年来植物 抗 旱 性 研 究 的 重 点 . cDNA microarray 和 观点提供了有力证据 , 为干旱诱导的玉米差异表达SSH 是两个能够高效高通量分离差异表达基因的方 基因的高通量克隆打下了良好的基础 .法 ,在植物基因克隆中颇受重视 . 使 cDNA microarray 本研究以开花期玉米为材料 ,分别对其进行 1 d技术可有效地筛选到表达差异较小的基因 ,但 cDNA 和 7 d 的干旱胁迫 ,构建了相应的消减文库 ,期望能microarray 成本高且对基因序列依赖度高 . SSH 是 从 1 d 文库中克隆到一些植株遭受干旱后瞬时快速Diatchenko 等建立的一种应用 PCR 方法的消减杂交 [5 ] 上调表达的基因 , 从中筛选感应干旱胁迫和信号转技术 ,设计巧妙 ,具有高度敏感性 、 操作简便 、 周期 导的基因 ; 期望从 7 d 文库中分离出一些参与植株短 ,阳性率高等突出优点 , 自 1996 年问世以来便受到了广泛的关注 ,到目前已有很多成功报道zycnzj.com/http://www.zycnzj.com/ , 并在此基础上了解相关的代 [8 ,9 ] . 虽 耐旱反应的效应基因 © 1994-2007 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
  5. 5. zycnzj.com/ www.zycnzj.com   172 山            ( 理     ) 东 大 学 学 报 学 版 第 41 卷  谢途径 . 该方面的研究工作正在进行 . [ 6 ] WAN Ji , Matthew B Wright , Li C , et al. Efficacy of SSH PCR in isolating differentially expressed genes[J ] . BMC Genomics ,参考文献 : 2002 , 3 (1) : 12. [7 ] 李广存 , 金黎平 , 谢开云 ,等 . 抑制差减杂交 ( SSH) 技术[1 ] 山   , 黄占斌 , 张岁岐 . 节水农业 [M] . 北京 : 清华大 仑 学出版社和暨南大学出版社 , 2000. 12~13. 及其在植物基因分离上的应用 [J ] . 中国生物工程杂志 , 2004 ,24 (9) : 26~32.[ 2 ] Ribaut J M , Hoisington D A , Deutsch J A , et al. Identification of quantitative trait loci under drought conditions in tropical [8 ] GAO Peng , WANG Guo2ying , ZHAO Hu2ji , et al. Isolation and identification of submergence2induced genes in maize ( Zea 2 maize. I. Flowering parameters and anthesis silking interval mays) seedlings by suppression subtractive hybridization [J ] . [J ] . Theoretical and Applied Genetics , 1996 , 92 : 905~914. Acta Botanica Sinica , 2003 , 45 (4) : 479~483.[3 ] 戴俊英 , 顾慰连 , 沈秀英 . 玉米不同品种各生育时期干 [9 ] 唐万虎 , 张祖新 , 邹锡玲 , 等 . 玉米耐渍功能基因组分 旱对产量的影响 [J ] . 沈阳农业大学学报 , 1990 , 21 (3) : 1~5. 析及相关基因 Sicyp51 的鉴定与克隆 [J ] . 中国科学 , C[4 ] 宋凤斌 , 戴俊英 . 干旱胁迫对玉米雌穗生长发育和产量 辑 , 生命科学 , 2005 ,35 (1) :29~36. [10 ] 杨锡明 , 高   , 栾   . 获取基因全长 cDNA 的方法 磊 静 的影响 [J ] . 吉林农业大学学报 , 2000 , 22 (1) : 18~22.[5 ] Diatchenko L , Lau Y F C , Campbell A P , et al. Suppression 及其进展 [J ] . 现代检验医学杂志 , 2005 , 20 ( 3 ) : 80~ subtractive hybridization : A method for generating differentially 83. regulated or tissue2specific cDNA probes and libraries[J ] . Proc ( 编辑 : 于善清) Natl Acad Sci , 1996 , 93 : 6 025~6 030.  ( 上接第 167 页) [7 ] 方小平 , 许泽永 , 张宗义 , 等 . 花生小叶外植体植株再 生及农杆菌介导的基因遗传转化 [J ] . 中国油料 , 1996 ,[2 ] 李   , 李兴汉 , 白世枝 , 等 . 花生子叶的高频植株再 岩 18 (4) :52~56. 生和基因转化 [J ] . 辽宁农业科学 , 1994 , 4 :8~11. [8 ] 徐平丽 , 单   , 柳展基 , 等 . 农杆菌介导抗虫 CpT Ⅰ 雷[3 ] Venkatachalam P , Geetha N , Khandelwal A , et al. Agrobacte2 基因的花生遗传转化及转基因植株的再生 [J ] . 2003 , rium2mediated genetic transformation and regeneration of trans 2 25 (2) :5~8. genic plants from cotyledon explants of groundnut ( Arachis hy2 [9 ] 王关林 , 方宏筠 . 植物基因工程 ( 第 2 版) [M] . 北京 : 科 pogaea L. ) via somatic embryogenesis [J ] . Current Science , 学出版社 , 2004. 344~345. 2000 , 78 (9) :1 130~1 136. [10 ] 徐平丽 , 单   , 王传堂 , 等 . 花生下胚轴丛生芽的诱 雷[ 4 ] Sharma K K, Vanamala A. An efficient method for the produc2 导和植株再生 [J ] . 花生科技 , 1999 , ( 增刊) :254~256. tion of transgenic plants of peanut ( Arachis hypogaea L. ) [11 ] Murashige T , Skoog F. A revised medium for rapid growth through Agrobacterium tumef aciens2mediated genetic transforma2 and bioassays with tobacco tissue cultures[J ] . Physiol Plant , tion[J ] . Plant Science , 2000 , 159 :7~19. 1962 , 15 :473~497.[5 ] 单世华 , 李春娟 , 刘思衡 , 等 . 以农杆菌为介导花生遗 [12 ] Gamborg O L , Miller R A , Ojima K. Nutrient requirements 传转化的研究 [J ] . 中国油料作物学报 , 2003 , 25 ( 1 ) : for suspension cultures of soybean root cells[J ] . Experimental 9~12. Cell Research , 1968 , 50 :151~158.[6 ] 陈红岩 , 张   , 高   , 等 . 乙肝病毒表明抗原基因 军 毅 [13 ] 周   , 陈小媚 . AgNO3 对花生离体培养芽再生的作 蓉 在花生中的遗传转化及免疫原性检测 [J ] . 生物技术通 用 [J ] . 花生科技 , 1999 , ( 增刊) :257~260. 讯 , 2002 , 13 (4) :245~250. ( 编辑 : 于善清) zycnzj.com/http://www.zycnzj.com/ © 1994-2007 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net

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