Metodo indireto de Elisa

1. MÉTODO INDIRETO DE ELISA PARA
DETECÇÃO E TITULAÇÃO DE
ANTICORPOS DE CAMUNDONGO ANTI-
GAMAGLOBULINA BOVINA (GGB)

5. Material:-
1-) Preparação antigênica solúvel de gamaglobulina bovina (GGB).
2-) Soros-teste de cobaias imunizadas anteriormente com antígeno
citado + adjuvantes distintos (ACF – Adjuvante Completo de Freund;
AIF – Adjuvante Incompleto de Freund) ou sem adjuvante.
3-) Conjugado de Ig G de coelho anti-Ig G de camundongo com
peroxidase (enzima)
4-) Peróxido de hidrogênio (H2O2 – água oxigenada) a 3%
(substrato)
5-) Orto-Fenileno-Diamina – OPD (cromógeno)
6-) Microplacas para Elisa
7-) Tampão Carbonato-Bicarbonato pH 9,6 a 0,05M
8-) Tampão PBS pH 7,4
9-) Tampão PBST pH 7,4 + 10% de LPD (Leite em Pó Desnatado

6. Procedimento:-
1- Adicionar volumes de 50L da solução antigênica em sua diluição
ideal de uso (1g/mL) preparada em Tampão Carbonato-Bicarbonato
(1:12500). Incubar a reação over-night, em geladeira. Ao final, lavar
as cavidades da microplaca 4 – 5 vezes com PBS. (Realizado
previamente)
2- Bloquear as cavidades da microplaca através da adição de LPD a
10% em TCB, incubar a reação por 45 minutos a 37ºC. Ao final, lavar
a microplaca como no item anterior. (Realizado previamente)
3- Adicionar as diluições das amostras de soros-teste preparadas em
tampão PBST + LPD. Incubar a reação por 60 minutos a 37ºC. Ao
final, lavar novamente, conforme já descrito. (Realizado previamente)

7. Procedimento:-
4- Adicionar o conjugado em sua diluição ideal de uso (1:2000)
preparada em tampão PBST + LPD. Incubar por mais 60 minutos a
37ºC. Ao final, lavar novamente.
5- Adicionar a solução de substrato (H2O2) + OPD. Incubar, sob
proteção da luz, por 15 minutos e, então, bloquear a reação com HCl.
6- Fazer a leitura (figura 02) das DOs. Determinar a DO média dos
controles para obtenção dos títulos de Acs presentes nos soros.

8. Antígeno Soro Antiglobulina Substrato Reação
Marcada com enzimático de cor
enzima
Lavagem Lavagem Lavagem
Esquema da Reação de ELISA (Método Indireto)

9. Antígeno
Anticorpo
Substrato Enzimático
Antiglobulina marcada com
enzima

10. 1/50 1/100 1/200 1/400 1:800 1/1600 1/3200 1/12800 1/512001/6400 1/25600
81 2 3 4 5 6 7 9 10 11 12
A
B
D
E
F
C
G
H
ACF
AIF
Sem
Adjuvante
Soro Normal
Camundongo
Contr. Ag