Fertilización In Vitro en bovinos

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Fertilización In Vitro en bovinos

  1. 1. Área de Biotecnología de la Reproducción Animal Facultad de Veterinaria 2011Área Biotecnología de la Reproducción – Departamento de Reproducción Animal
  2. 2.  1989: primeros terneros nacidos por FIV en Latinoamérica… (amplia difusión)
  3. 3. Pronúcleos masculino y femenino
  4. 4. Día EtapasSemana Preparación del laboratorio Desinfección de superficies;previa al esterilización de materiales; preparacióntrabajo de soluciones stock0 Colecta de ovarios Transporte en solución salina a 37ºC Aspiración de los COC (Complejos Medio de aspiración: Solución m-PBS ovocito cúmulus) (Buffer Fosfato Salino modificado: D-PBS (+) + SFb + Atb) Recuperación y clasificación de los Bajo lupa estereoscópica COC Maduración In Vitro Medio de maduración: TCM-199 + SFb + LFb + Atb1 Capacitación del semen y dilución Medio BO de capacitación y lavado de semen; medio BO de dilución de semen (ajuste a concentración deseada) Fecundación In Vitro Gotas en placas de Petri pequeñas Desarrollo In Vitro Medio de desarrollo: CR1aa3 Clivaje Evaluación de división celular a las 48 hs4 - 10 Evaluación de desarrollo y cambio Cada 48 horas de medio
  5. 5.  De animales muertos: material de matadero o hembras recién muertas  Aspiración del líquido folicular (folículos de 2 a 8 mm de diámetro)  Desmenuzamiento del ovario (slicing) De hembras vivas  OPU, aspiración con aguja guiada por ultrasonografía  Aspiración con aguja y endoscopía  Laparotomía (usada sólo en casos especiales)
  6. 6. Folículo primordial Folículo Folículo Folículo Folículo Secundario Terciario de Graaf primarioTúnicaalbugíneaEpitelio Corpusgerminal albicans Folículo atrésico Hilio Cuerpo Células lúteo intersticiales
  7. 7. P PM S T T POP PM S TPO
  8. 8.  m-PBS: Buffer Fosfato Salino modificado  Consiste en:  D-PBS (+) – solución stock  Penicilina – Estreptomicina  SFb (suero fetal bovino)COMPOSICIÓN DEL MEDIO PBS:NaCl 8,00 g/lKCl 0,20 g/lKH2PO4 0,20 g/lNa2HPO4 1,15 g/lMgCl26H2O 0,10 g/lCaCl2 0,10 g/l
  9. 9. Calidad Características a evaluarA Bueno Completamente rodeado por más de 3 capas de células del cúmulus y citoplasma homogéneoB Regular Rodeado parcialmente por células del cúmulusC Malo Desnudo y citoplasma irregularD Degenerado Rodeado por fibrina (con aspecto de tela de araña) (Liebfried L and First N L, 1979; Sato E y col, 1990)
  10. 10.  Medio de maduración: M-TCM-199 (TCM-199 de maduración)  Consiste en:  TCM-199 (solución stock)  Penicilina – Estretomicina  SFb (suero fetal bovino)  LFb (licor folicular bovino)LFb: se obtiene de folículos preovulatorios, de más de 8 mm de diámetro, y setransfiere a tubos de centrifuga. Se centrifuga a 800 G (2.500 rpm) durante 30minutos. Se decanta. El liquido sobrenadante se inactiva en baño Maria a 56 ºCdurante 30 minutos; se fracciona en tubos pequeños o crioviales y se almacenacongelado.
  11. 11. m-PBS m-PBS M-TCM-199 M-TCM-199 GOTAS DE MADURACIÓN M-TCM-199 CUBIERTAS CON ACEITE MINERAL 22 hs cultivo Caja de Petri numerada con gotas de maduración, cubiertas con aceite mineral (3 gotas de 100 µ)
  12. 12.  Preparación citoplasmática Preparación nuclear  Retoma la meiosis. Desde Profase I (estado de latencia, Dictioteno), se detiene nuevamente en la Metafase II.  Formación del primer cuerpo polar Expansión de las células del cúmulus
  13. 13. Ovocito Primario  Profase de la Meiosis I (pausa = dictioteno) Maduración citoplasmática y nuclearOvocito Secundario  Metafase de la Meiosis II Fertilización Completa la Meiosis
  14. 14. Ovocitos inmaduros •OVOCITOS MADUROS •Expansión de células del cúmulus • 1º cuerpo polar • Metafase II
  15. 15.  La capacitación permite:  Adquirir hipermotilidad para avanzar por el mucus oviductal  Penetrar el cúmulus  Prepararse para la reacción acrosómica Bioquímica de la capacitación:  Aumento del pH  Aumento de la permeabilidad al calcio  Fusión de membranas  Interacciones con glucosaminoglicanos  Cambio en la relación colesterol/fosfolíidos
  16. 16.  Ornitina-decarboxilasa Fosfolipasa A Fosfolipasa C L-Fucosidasa -Galactosidasa -Glucoronidasa Hialuronidasa Peptil-peptidasa -N-acetilhexosaminidasa Acrosina Arilaminidasa Colagenasa Proacrosina Neuroaminidasa Estearasas Fosfatasas
  17. 17. COMPOSICIÓN DE SOLUCIÓN BÁSICA BO (Bracket and Oliphant): Solución A NaCl 2,1546 g Solución B KCl 0,0987 g NaHCO3 1,2937 g Na2PO42H2O 0,0420 g Rojo Fenol 20 µl MgCl26H2O 0,03485 g Agua ultrapura hasta 100 ml CaCl22H2O 0,1085 g Rojo Fenol (0,5%) 50 µl La solución B se burbujea con CO2 Agua ultrapura hasta 500 mlCOMPOSICIÓN DEL MEDIO BO: Solución A 76 ml Piruvato de Sodio 0,01375 g Penicilina 10.000 UI Estreptomicina 10 mg Solución B 24 ml
  18. 18.  Lavado de semen  BO + Cafeína + Heparina Lavado de ovocitos  BO + BSA (albúmina de suero bovino) (10 mg/ml) Dilución de semen  BO + BSA (20 mg/ml)
  19. 19.  Platina caliente (35 ºC) y Baño María (35 ºC) Descongelación de la pajuela de semen:  10 seg. a temp. ambiente  30 seg. a baño María (35 ºC) Colocar el semen en tubo de centrífuga (gota en portaobjetos -sobre la platina- para evaluación) Se agregan 6 ml de sol BO de lavado de semen Centrifugar a 500 G (2000 rpm, dependiendo del diámetro de la centrífuga), 5 min. Aspirar sobrenadante Nuevamente se agregan 6 ml de sol BO de lavado de semen Centrifugar a 500, 5 min. Aspirar sobrenadante Diluir el pellet en sol. BO de dilución de semen Vol i x [ i ] = Vol f [f]
  20. 20. PREPARACIÓN DEL SEMEN Remover la capa superior Agregar 6 ml de BO de lavado de semen y re- centrifugar a 500 G, 5 min.6 ml sol BOde lavadode semen Luego de 2 lavados Semen retirar sobrenadante (0,5 ml) y dejar pellet Capa espermática Cámara de Neubauer (calcular concentración)
  21. 21. DILUCIÓN DE SEMEN YPREPARACIÓN DE GOTAS DE INSEMINACIÓN Gotas de inseminación 100 µl de espermios en BO cubiertas con aceite mineral Agregar BO de dilución de semen (Vol. calculado) FECUNDACIÓN Vol i x [ i ] = Vol f [f] Incubación 5 h
  22. 22. 1C 2 1 2 3 3 4 Incubación 5 h 5% CO2 38 ºC
  23. 23. BO 40 ml + BSA 400 mg Lavado Al medio de inseminación (BO) en las gotas de semen Lavado cubierto por aceite mineral BO + BSA BO + BSA 5 hs cultivo
  24. 24. FECUNDACIÓN
  25. 25. TCM 199 + 5 % SFb + ANTIBIÓTICOS cultivo Lavado Lavado Al medio de cultivoBO (TCM-199) cubierto por aceite mineral TCM-199 TCM-199
  26. 26. 1 célula 2 células 4 células 16 células día 0-1 día 2 día 2-3 1 célula día 4-5 día 0-1 8 células 16 células Mórula temprana Mórula 2 células compacta día 2-4 día 4-5 día 5-6 día 2 día 6-7Mórula compacta Blastocisto temprano Blastocisto Blastocisto 4 células temprano día 6-7 día 7 día 7-8 día 2-3 día 7 8 células Blastocisto Blastocisto Blastocisto Blastocisto día 2-4 día 7-8 expandido eclosionando eclosionado día 8-9 día 9 día 10
  27. 27. ¿POR QUÉ?¿PARA QUÉ?¿CON QUÉ?
  28. 28. Fertrilización InVitro en Bovinos Área de Biotecnología de la Reproducción Animal Facultad de Veterinaria 2011  Yael Filipiak  Clara Larocca

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