Dr. Roderic Guigó. Centre de Regulació Genòmica / Interrogating RNA heterogeneity

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Dr. Roderic Guigó. Centre de Regulació Genòmica / Interrogating RNA heterogeneity

  1. 1. Interroga)ng  RNA  heterogeneity   RNASeq  in  the  ENCODE  project   roderic.guigo@crg.cat   Centre  de  Regulació  Genòmica,  Universitat  Pompeu  Fabra  
  2. 2. 2001:  la  culminació  del  projecteThe  Human  Genome  
  3. 3. 23/07/13   3  
  4. 4. 23/07/13   4  
  5. 5. 5  
  6. 6. The  ENCyclopedia  Of  DNA  Elements   23/07/13   6  
  7. 7. ENCODE  Project   •  The  genome  (DNA  sequence)  is  constant   across  highly  diverse  cell  types   •  Genome  ac)vity  is  different  across  cell  types   •  The  ENCODE  project  aZempts  to  characterize   the  ac)ve  regions  of  the  genome  in  as  many   cell  types/condi)ons  as  possible   7  
  8. 8. ENCODE  Timeline   8   Elise  Feingold,NHGRI  
  9. 9. 2007     Results  of  ENCODE   Pilot  Phase     on  1%  of  the   human  genome   published   4 June 23/07/13   9  
  10. 10. ENCODE  assays   A  user's  guide  to  the  encyclopedia  of  DNA  elements  (ENCODE).  The  ENCODE  ConsorBum.   PlOS  Biology,  2011   Chip-seq (~150) RNA-seq (~100) Dnase-seq (~100)
  11. 11. Next  Genera)on  Sequecing   •  Genomic  sequencing   •  cDNA  to  RNA.  RNASeq   –  Transcriptome  characteriza)on   •  DNA  bound  to  proteins.   ChIPSeq   –  Transcrip)on  Factors   –  Histone  modifica)ons   •  DNA  modifca)ons.  i.e.   MethylSeq.     –  DNA  methyla)on   •  and  many  others…   11  
  12. 12. ENCODE Uniform Analysis Pipeline Mapped  reads  from  produc)on  (Bam)   Uniform  Peak  Calling  Pipeline  (SPP,  PeakSeq)   IDR  Processing,  QC  and  Blacklist  Filtering   Mo)f  Discovery   Stats,  GSC   enrichments,  etc.   Signal  Aggrega)on     over  peaks   Signal  Genera)on   (read  extension  and  mappability  correc)on)   Segmenta)on   Poor  reproducibility  Good    reproducibility   Rep1   Rep2   Self  Organising  Maps   ChromHMM/Segway Anshul Kundaje, Qunhua Li, Michael Hoffman, Jason Ernst, Joel Rozowsky, Pouya Kheradpour
  13. 13. Irreproducible Discovery Rate (IDR) If one re-ran the experiment, what is the probability one would observe the same element at this rank or better Uses ranked element lists from two replicates, and makes the assumption that there is noise at the bottom of the rank ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !! !! ! ! ! ! ! !! ! ! ! ! ! ! !! ! ! ! ! !! ! ! ! ! ! !! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !! ! ! !!! ! ! !! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !! ! ! ! ! ! ! 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! ! ! ! ! ! ! ! ! !! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 1e+01 1e+03 1e+05 1e+07 1e+011e+031e+051e+07 Score Repl1 ScoreRepl2 Chip-seq Dnase-seq RNA-seq Ben Brown, Qunhau Li, Peter Bickel
  14. 14. 14  
  15. 15. 15  
  16. 16. 17  
  17. 17. Graur  et  al.,  2013,  Genome  Biology  and  Evolu1on   This  absurd  conclusion  was  reached  through  various  means,  chiefly     •  (1)  by  employing  the  seldom  used  “causal  role”  defini)on  of   biological  func)on  and  then  applying  it  inconsistently  to  different   biochemical  proper)es,     •  (2)  by  commijng  a  logical  fallacy  known  as  “affirming  the   consequent,”   •  3)  by  failing  to  appreciate  the  crucial  difference  between  “junk   DNA”  and  “garbage  DNA,”     •  (4)  by  using  analy)cal  methods  that  yield  biased  errors  and  inflate   esBmates  of  func)onality,     •  (5)  by  favoring  sta)s)cal  sensi)vity  over  specificity,  and     •  (6)  by  emphasizing  sta)s)cal  significance  rather  than  the   magnitude  of  the  effect.     Here,  we  detail  the  many  logical  and  methodological  transgressions   involved  in  assigning  func)onality  to  almost  every  nucleo)de  in  the   human  genome.     18  
  18. 18. 19  
  19. 19. Raw  genome  coverage  of  elements   Element  Type   Coverage   CumulaBve   Coverage   Exons   3%   3%   Chip-­‐seq  bound  mo)fs   4.5%   5%   DNaseI  Footprints   5.7%   9%   Chip-­‐seq  bound  regions   8.1%   12%   DNaseI  HS  regions   15.2%   19.4%   Histone  Modifica)ons  (*)   44%   49%   RNA   62%   80%   (*  excluding  broad  marks)   20  
  20. 20. 21  
  21. 21. 22   ENCODE  Publica)ons   Mike  Pazin,NHGRI  
  22. 22. RNA  in  the  ENCODE  project   23/07/13   23  
  23. 23. July 23, 2013 24 RNA  (as  the  first  phenotype)   •  Transcrip)on  to  RNA  and  subsequent  processing  is   the  first  step  in  the  unfolding  of  the  intruc)ons   encoded  in  the  DNA.   •  There  is  a  one-­‐to-­‐one  correspondence  between  the   RNA  content  of  the  cell  and  the  cellular  phenotype   (which  is  obviolusly  not  true  for  the  DNA)   •  The  phenotypic  effects  of  the  varia)ons  in  the  DNA   are  ul)mately  mediated  by  varia)ons  in  the  RNA   content  of  cell.    
  24. 24. The  ENCODE  RNA  assays     (CSHL,  CalTech)   23/07/13   25   Carrie  Davis,  CSHL  
  25. 25. The  ENCODE  RNASeq  pipeline   •  Reads  mapped  to  genome  and  transcriptome  using   STAR  (CSHL)—an  splice  aware  RNASeq  mapper   •  Independent  from  the  annota)on  (GENCODE)   –  Splice  Sites   –  RNASeq  con)gs   –  Cufflinks  (CalTech)  genes  and  transcripts  models     –  In  all  cases,  use  IDR  to  select  reproducible  elements  across   the  replicates   •  GENCODE  quan)a)on   –  Quan)fica)on  of  exons,  genes  and  transcripts  using  the   Flux  Capacitor  (CRG)   –  In  all  cases,  use  IDR  to  select  reproducible  elements  across   replicates   23/07/13   26  
  26. 26.   hHp://genome.ucsc.edu/ENCODE/   The  RNA  dashboard   (hZp://genome.crg.cat/encode_RNA_dashboard)   23/07/13   27   Julien  Lagarde   Maik,  Roder  
  27. 27. The  ENCODE  RNASeq   23/07/13   28   Carrie  Davis,  CSHL  
  28. 28. Red:  propor)on  of     nucleo)des  in  genomic   domains  covered  by  RNASeq   con)gs       29   ENCODE  RNASeq  cumulaBve  coverage     of  the  Human  Genome   Sarah  Djebali  
  29. 29. Expression  of  coding  vs  long  non  coding  genes.   Angelika  Merkel  
  30. 30. 23/07/13   31  
  31. 31. 23/07/13   32  
  32. 32. Expression  of  coding  vs  long  non  coding  genes.   Angelika  Merkel  
  33. 33. Quantitative models of Transcription - HistonesXianjun Dong, Zhiping Weng H3k79me2 H3k9ac
  34. 34. Quantitative models of Transcription - TFs Chao Cheng, Mark Gerstein −4 −2 0 2 4 6 8 −50510 CAGE PolyA+ K562 Cytosol Predicted expression (log2) Measuredexpression(log2) R = 0.81 (R2 = 0.64) RMSE = 2.56 Classification: AUC = 0.90 Rrgression: R = 0.62 (R2 = 0.38; RMSE = 3.06) Relative importance of TFs Classification 02060 YY1ETS1M YCM AXELF1E2F4EG R1E2F6JUNRESTTAL1M XI1SP1 ZBTB7A BCLAF1M AFKG ABPAUSF1THAP1 CEBPBG ATA2FO SATF3BCL3FO SL1SRFUSF2SPI1 ZBTB33 ZNF274G ATA1 ZNF263SP2NFYASIX5NRF1 NR2C2NFYBJUNDNFE2 Regression 010002500 YY1E2F4ETS1M YCELF1RESTJUNEG R1M AXFO S ZNF274 ZBTB7ANFYATAL1 G ABPAM XI1SIX5THAP1 ZNF263NFYBNR2C2G ATA1NRF1SP2E2F6 BCLAF1G ATA2SP1BCL3SPI1USF2 CEBPBUSF1ATF3FO SL1M AFK ZBTB33SRFJUNDNFE2 YY1, E2F4, ETS1 −4 −2 0 2 4 6 8 −50510 CAGE PolyA+ K562 Cytosol Predicted expression (log2) Measuredexpression(log2) R = 0.81 (R2 = 0.64) RMSE = 2.56 Classification: AUC = 0.90 Rrgression: R = 0.62 (R2 = 0.38; RMSE = 3.06) Relative importance of TFs Classification 02060 YY1ETS1M YCM AXELF1E2F4EG R1E2F6JUNRESTTAL1M XI1SP1 ZBTB7A BCLAF1M AFKG ABPAUSF1THAP1 CEBPBG ATA2FO SATF3BCL3FO SL1SRFUSF2SPI1 ZBTB33 ZNF274G ATA1 ZNF263SP2NFYASIX5NRF1 NR2C2NFYBJUNDNFE2 Regression 010002500 YY1E2F4ETS1M YCELF1RESTJUNEG R1M AXFO S ZNF274 ZBTB7ANFYATAL1 G ABPAM XI1SIX5THAP1 ZNF263NFYBNR2C2G ATA1NRF1SP2E2F6 BCLAF1G ATA2SP1BCL3SPI1USF2 CEBPBUSF1ATF3FO SL1M AFK ZBTB33SRFJUNDNFE2
  35. 35. Tilgner  et  al.,     Splicing  occurs   predominantly   during   transcrip)on     Genome   Research,  2012     23/07/13   36  
  36. 36. RNA processing July  23,  2013   37  
  37. 37. 23/07/13   38   Evidence  for  co-­‐transrip)onal  splicing  
  38. 38. 23/07/13   39   Khodor,   Y.L.   et   al.   Nascent-­‐seq   indicates   widespread   cotranscriptional   pre-­‐mRNA   splicing   in   Drosophila.   Genes  Dev  25,  2502-­‐12  (2011).     Ameur,  A.  et  al.  Total  RNA  sequencing  reveals  nascent   transcription   and   widespread   co-­‐transcriptional   splicing   in   the   human   brain.   Nat   Struct   Mol   Biol   18,   1435-­‐40  (2011).  
  39. 39. complete  Splicing  Index  (coSI)   40   a   b   c   d   e   COSI = a + b + c a + b + c + d + e The  CoSI,  Complete  Splicing  Index,     measures  the  degree  of  comple)on  of   splicing  of    a  given  exon  based  on   RNASeq  reads.  CoSI=1,  means  that  all   RNASeq  reads  mapping  to  the  exon   support  the  splicing  of  the  exon.     CoSI  =0  means  all  reads  support  the   exon  not  being  spliced  
  40. 40. coSI  in  the  polyA+  cytosolic  RNA   41  
  41. 41. coSI  in  the  chroma)n  associated  RNA   42  
  42. 42. 43   coSI  in  the  polyA+  cytoslic  RNA  
  43. 43. 44   coSI  in  the  chroma)n  associated  RNA  
  44. 44. 45   coSI  in  polyA-­‐  nuclear  RNA  
  45. 45. 46   coSI  in  polyA+  nuclear  RNA  
  46. 46. snRNAs  involved  in  splicing  enriched  in   the  chroma)n  frac)on   47  
  47. 47. Processing  of  RNA  through  cell  compartments   48   CoSI  
  48. 48. lncRNAs  are  spliced  less  efficiently   than  protein  coding  genes   23/07/13   49  
  49. 49. Summary   •  The  ENCODE  project  is  producing  a  very  rich  set   of  RNASeq  assays  across  mul)ple  cell  lines,  cell   compartments,  and  RNA  classes.   •  Interroga)on  across  cellular  and  subcellular   compartments  provides  useful  informa)on  on   the  dynamics  of  RNA  processing  within  the  cell.   •  RNASeq  allows  measuring  of  individual  isoforms.     –  Many  new  ques)ons  can  be  stated   23/07/13   50  
  50. 50. 23/07/13   51   acknowledgements  
  51. 51. 23/07/13   52  
  52. 52. Current  Group  

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