Bioteknologi

2,652 views

Published on

Published in: Technology
0 Comments
0 Likes
Statistics
Notes
  • Be the first to comment

  • Be the first to like this

No Downloads
Views
Total views
2,652
On SlideShare
0
From Embeds
0
Number of Embeds
2
Actions
Shares
0
Downloads
102
Comments
0
Likes
0
Embeds 0
No embeds

No notes for slide

Bioteknologi

  1. 1. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. Bioteknologi Farmasi FAR 40541 2 SKS Penanggung jawab: Dr Amarila MalikDepartemen Farmasi FMIPA-Universitas Indonesia
  2. 2. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.SASARAN PEMBELAJARAN:Mengetahui konsep-konsep dalam bioteknologi,keterkaitan beberapa disiplin ilmu dalambioteknologi, teknologi rekayasa biologi organisme,teknologi DNA rekombinan/rekayasa genetika,pemanfaatan bioteknologi dalam bidang farmasi,dan penerapan bioteknologi dalam upayapemeliharaan kesehatan masyarakat.
  3. 3. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.PUSTAKA :•Wink, M. (Ed). An introduction to Molecular Biotechnology, 2006•Glick, B.R & Paternak, J.J, 1998. Molecular Biotechnology, Principlesand Applications of Recombinant DNA, ASM Press.•Jognson & Manasse, 1993. Biotechnology in Pharmacy, John E.Smith, 1985. Biotechnology Principles, Van Nostrand Reinhold (UK)•Wulf Crueger and Annelies Crueger, 1984. Biotechnology A TextBook of Industrial Microbiology. Sinaeur Association Inc. Sunderland,MA, USA•J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis, 1989. Moleculer Cloning ALaboratory Manual 2nd ed. Cold Spring Harbor Lab. Pres, USA•James D. Watson, John Tooze, Davit T.Kurtz, 1983. RecombinantDNA, Scientific American Books, New York, USA•Indra K. Vasil, 1990. Biotechnology, Science, Education, 2ndCommercialization (Editor), Elsevier Scientific Publish. Co.Inc.
  4. 4. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. Pokok-pokok Bahasan•Pendahuluan•Konsep-konsep dalam bioteknologi dan prospeknya dalam bidang farmasi,•Disiplin ilmu yang terkait dalam bioteknologi,•Teknologi bioproses•Pengembangan galur berpotensi dalam bidang farmasi: fermentasi dan kinetikanya, proses hilir•Materi genetik•Rekayasa genetika dan Teknologi DNA rekombinan•Terapi gen pada manusia,•Pemanfaatan organisme prokariot dan eukariot dalam bidangfarmasi,•Keamanan hayati produk rekayasa genetika dan bioetik.
  5. 5. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. Overview• Pendahuluan - Bioteknologi Farmasi• Dampak bioteknologi terhadap bidang farmasi• Rekayasa genetika-rekombinasi DNA – kloning gen• Aplikasi teknik molekular• Produk komersial dari mikroorganisma• Terapi Gen
  6. 6. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. BIOTEKNOLOGI FARMASI Definisi: Aplikasi dari bioteknologi dalam farmasi àDampak terhadap : obat-obatan diagnostik vaksinBIOTEKNOLOGI:- Pemanfaatan mikroorganisme untuk memproduksi produk-produk yangpenting danBermanfaat : protein dan enzim-Rekayasa genetika hewan dan tanaman agar menghasilkan protein asingtertentu, juga senyawa kimia lainnya, spt. Vitaminà Diperlukan “molecular basic knowledge”
  7. 7. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.PATOFISIOLOGI PENYAKITDRUG ACTIONIDENTIFIKASI DAN PRODUKSI TARGET OBAT: RESEPTOR, ENZIM UNTUK DRUG DISCOVERY DAN DRUG DESIGN
  8. 8. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.TEKNIK DASAR BIOTEKNOLOGI BERBASIS BIOLOGI MOLEKULER ORGANISME REKOMBINANHuman insulin (1978): produk farmasi pertama hasil rekayasa genetikaSepotong DNA penyandi hormon insulin manusiaTransfer ke mikroorganisme : E. coliKontrol ekspresi Human insulin di E. coliGene cloning Teknik : Rekayasa Genetika Genetically modified/genetically engineered1994: 21 produk farmasi turunan teknologi rekombinasi DNA 150 produk dalam taraf “clinical trial”
  9. 9. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. Dampak Bioteknologi terhadap FarmasiTUGAS: Cari apa saja dampak bioteknologi terhadap farmasi. Diskusikan per kelompok Cari protein-protein yang diproduksi secara teknologiDNA rekombinanTerhadap profesi farmasis:àisu-isu ke arah farmakoekonomi dan etika (sosial)àMenjawab dan menjelaskan kepada pasien penangananobat-obat dan efek/akibat penanganan yang tidak tepat
  10. 10. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. DAMPAK BIOTEKNOLOGI TERHADAP BIDANG FARMASII. Obat – obatan berupa protein dan peptide• stabilitas, formulasi, penyimpanan, efek samping berbeda dengan obat – obat yang berupa molekul, kecil Contoh : suhu refrigerator ; tidak boleh terkocokII. Pilihan produk biotek ( protein & peptida).• Pertimbangan sistem ekspresi• Sistem ekspresi berbeda, maka produk sedikit berbeda
  11. 11. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.III. Obat – obat kelas baru yang beredar di pasaran• Pemahaman patofisiologi penyakit yang sebelumnya tidak dapat diatasi . Contoh : human insulin ( HumulinR Lilly ) ; Hep B-vaccine (Engerix – BR Smith Kline Beecham)IV. Agents diagnostik model baru• Contoh : ELISA à monoclonal antibody (Enzyme – Linked immunosorbant Assay) àreaksi warna• probe untuk Plasmodium falciparum, berupa potongan DNA spesifikProfesi FARMASIS “• Isu – isu ke arah farmakoekonomi & etika (ethical )• Menjawab dan menjelaskan kepada pasien penanganan obat – obat dan efek /akibat penanganan yang tidak tepat.
  12. 12. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. RAKAYASA GENETIKADefinisiAdalah proses pembentukan rekombinan baru dari material genetikdengan cara penyisipan suatu molekul asam nukleat asing ( yangdihasilkan di luar sel ) ke dalam suatu vektor, sehinggamemungkinkan penggabungan dan kelanjutan berkembang /diperbanyak di dalam sel inang yang baru.KLON adalah organisme identik yang terbentuk secara genetik danmembawa seluruh potongan DNA yang telah disisipkan, danmemperbanyak molekul yang baru.Kloning gen à rekayasa genetika, teknologi DNA rekombinanContoh : domba Dolly
  13. 13. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.RAKAYASA GENETIKAMaterial genetik :adalah material yang membawa informasi genetik yang diturunkandari tetua ke turunannya, yaitu asam nukleat DNA : deoksi ribonucleic acid RNA : ribonucleic acid Vektor Kloning :adalah wahana pembawa gen target untuk mengintroduksi gen keinang tertentu.Gen :adalah sekuens DNA yang menyandikan protein.
  14. 14. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. ASPEK KLONING- Menerobos barier alamiah suatu spesies àInsulin manusia diproduksi oleh E. coli à E. coli sebagai pabrik biologis-Memungkinkan memperoleh dan memanipulasi secara relatif potongan – potongan DNA yang menyandikan fungsi spesifik terapi gen penyebab penyakit keturunan Co : Sindrom Hurler ( KOMPAS, 02/08’97) sel sumsum tulang belakang diekrtraksi, dimanipulasi dengan sel – sel normal, diintroduksi kembali melalui pembuluh darah.
  15. 15. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. ASPEK KLONINGAdanya rekayasa genetika memungkinkan kita tidak hanyamengisolasi dan menskrining, tapi juga dapat mengkonstruksiorganisme, dalam hal ini galur – galur yang produktif.MikroorganismeTanaman BIOREAKTORHewanDua dasar penerapan kloning gen1. Isolasi dan studi gen – gen tertentu àDiperoleh pengertian yang mendalam mengenai fungsi danmekanisme regulasi gen2. Peningkatan produksi oleh suatu gen spesifik
  16. 16. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.TEKNIK – TEKNIK DASAR YANG BERKAITAN DENGAN KLONING GEN •Metode isolasi DNA •Metode memotong dan menyambung molekul – molekul asam nukleat •Metode transformasi pada sel host/ inang ; sebagai dasar : Escherichia coli ( E. coli ) à why ?Hampir semua pengembangan pertama teknik rekayasa genetikadigunakan E. coli sebagai organisme inang :• Paling banyak dipelajari• Paling lengkap informasi material genetiknya : - sudah lengkap peta genomnya.
  17. 17. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. DEFINISI§Isolasi DNA mengekstraksi molekul DNA dari sel§Memotong DNA ( digestion ) memutus ikatan molekul DNA pada antara basa nt pada sekuens tertentu oleh suatu endonuklease restriksi§Menyambung DNA ( Ligation ) Potongan DNA / gen asing disambungkan dengan DNAvector yang terpotong linier oleh enzim Ligase§Transformasi§Mengintroduksi DNA ke dalam sel inang
  18. 18. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. ISOLASI DNA1.Penghancuran dinding sel : - mekanik - enzimatis2. Lisis sel : - S D S : sodium dodesil sulfat - Triton X – 1003. Membersihkan debris sel - sentrifugasi dilanjutkan dengan depresipitasi dengan solven organik Contoh : fenol, CHCl3 kemudian disentrifugasi ; atau proteinase-K4. Presipitasi - + alkohol à sentrifugasi gradien CsCl ; elektro- - + alcohol + NH4 asetat
  19. 19. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.Memisahkan DNA plasmid dan DNA kromosom/genom1. Beda struktur tersier :DNA plasmid : supercoiled à Covalently Closed Circular ( CCC )DNA kromosom/genom : linier2. Sifat denaturasi- dengan alkali, pemanasan- DNA plasmid lebih mudah renaturasi3. Ultrasentrifugasi :CsCl gradien à DNA plasmid berada di bawah4. Mobilitas di elektroforesis gel agaroseàDNA plasmid lebih diskret /tajam pitanya CsCl / EtBr : DNA linier (kromosom) DNA Supercoiled (plasmid)
  20. 20. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. Agarose gel electrophoresis lamda lamda plasmid plasmid +RE +REDNA size
  21. 21. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.ANALISIS KUALITAS DAN KUANTITAS DNA•Elektroforesis - DNA diwarnai dengan Etidium bromida - dilarikan pada gel agarose dari kutub (–) ke (+) - dapat diketahui adanya degradasiDegradasi :Ik. Fosfodiester putusPenyimpanan : > - 200C - DNAse tidak aktif - mencegah degradasi oleh DNAse > TE buffer : mencegah degradasi oleh DNAse
  22. 22. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.METODE – METODE ISOLASI PLASMID§skala besar : sentrifugasi gradien CsCl§skala kecil ~ mini prep, midiprep •sentrifugasi gradien •alkalin lisis •metode ammonium asetat •metode partikel gelas ( glass milk ) •metode partikel magnetic ( magnetic beads ) •kromatografi ( exclusion chromatography)
  23. 23. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. VEKTOR KLONINGPLASMID bereplikasi diri ( self replicating ) utas ganda : d s molekul DNA sirkulator di maintain di dalam bakteria sebagai bentuk ekstrakromosomal copy number ( Jumlah kopi per sel ): high copy number 10 – 100 kopi / sel low copy number 1 – 4 kopi / sel medium copy number diantaranyaUkuran : 1 s/d 500 kb
  24. 24. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. VEKTOR KLONINGSpektrum inang : broad hostrange à dapat bereplikasi pada sejumlah spesies bakteri narrow hostrange à hanya dapat bereplikasi pada spesies khususBeberapa ciri khas plasmid untuk vektor cloning : §Ukuran kecil §Mempunyai situs – situs pengenalan ER yang unik ( tunggal ), tempat insert disisipkan / diklon. §Satu atau lebih penanda seleksi genetic, untuk mengindentifikasi sel resipien yang membawa kontruksi DNA vektor - insert. §Plasmid cloning vector harus di-genetically engineered Contoh : pBR 322, pUC 19
  25. 25. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. PLASMID-Molekul DNA ekstrakromosom yang bereplikasi mandiri,berbentuk sirkular, utas ganda.- Terutama ditemukan pada bakteria, juga : Kapang Eukariotik ( beberapa )- Plasmid alami menyandikan : 1. Resistensi AB 2. Colicin = Bakteriosin 3. Virulensi 4. Aktivitas metabolit
  26. 26. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.STABILITAS PLASMIDkondisi optimum, stabil medium tumbuh- Mandiri à tidak tergantung kromosom ada gen ORI : untuk replikasi mandiri- Plasmid rekayasa Untuk teknologi DNA rekombinan
  27. 27. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. PEMOTONGAN DNA (digesti ) Restriction Enzymes = enzim restriksi• Diperoleh dari bakteri sbg mekanisme pertahanan terhadap infeksi virus DNA• Endonucleases = memotong (cleave) di dalam utasan DNA• Telah diketahui ada 3,139 enzyme
  28. 28. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. Enzyme Site Recognition = situs pengenalan enzim restriksi• Setiap enzim mendigesti (memotong) DNA pada sekuens spesifik = situs restriksi (restriction site)• Enzim mengenali 4- atau 6- pasangan basa , dengan sekuens palindromik (eg GAATTC)
  29. 29. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. 5’ versus 3’ overhang• Enzyme cuts à 5’ G GAATTC 3’ 3’ CTTAAG 5’ G 5’ G 3’ 5’ AATTC 3’ 3’ CTTAA 5’ 3’ G 5’ § Generates 5’ overhang
  30. 30. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.Common Restriction Enzymes• EcoRI 5’ GAATTC 3’ 3’ CTTAAG 5’ – Escherichia coli – 5’ overhang• PstI 5’ CTGCAG 3’ – Providencia stuartii 3’ CACGTC 5’ – 3’ overhang
  31. 31. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.The DNA DigestionRestriction Buffer provides optimal conditions– NaCl provides the correct ionic strength– Tris-HCl provides the proper pH– Mg2+ is an enzyme co-factor
  32. 32. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.DNA Digestion Temperature• Why incubate at 37°C? Body temperature is optimal for these and most other enzymes• What happens if temperature is too hot or cool? G Too hot = enzyme may be denatured, killed J Too cool= enzyme activity lowered, requiring longer digestion time
  33. 33. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Softwarehttp://www.foxitsoftware.com For evaluation only.
  34. 34. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Softwarehttp://www.foxitsoftware.com For evaluation only.
  35. 35. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.Agarose Electrophoresis• Arus listrik yang membawa DNA bermuatan negatif ke elektroda muatan (warna merah)positif melalui suatu gel agaros• Gel agarose memisahkan fragmen DNA berdasarkan ukuran – Fragmen kecil bergerak lebih di depan (front) di dibandingkan fragmen besar
  36. 36. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. PENYAMBUNGAN DNA ( Ligasi )- Penyambungan gugus 3’OH dan DNA insert. ( Gb. )- Ligasi lebih mudah pada ujung – ujung sticky ( dengan ER sama / isoschizomer / isocaudomer).- Reaksi Ligasi DNA vektor 3 1 : 2 ( s/d 1: 10 ) DNA insert 6 Buter T4 DNA ligase 5x 4 T4 DNA ligase 1 dH2O ( destilata bebas ion ) 6 Total 20 •Inkubasi : 40 – 150 C semalam ( 18 – 24 jam ) - Ujung blunt end : dapat diligasi, walaupun didigesti dengan ER berbeda. Pada reaksi Ligasi, selalu sertakan pula control – control : k. Transformasi : vector utuh k. ligasi : vector linier / terpotong + enz – ligase
  37. 37. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Softwarehttp://www.foxitsoftware.com For evaluation only.
  38. 38. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. TRANSFORMASIà Pengambilan DNA rekombinan oleh E.coli dengan caramengintroduksi DNA murni (purified) ke dalam sel yang sudahkompeten. GFP
  39. 39. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. TRANSFORMASIE.coli sebagai sel inang :> sudah dimodifikasi genetik, antara lain :> Rec A- : tidak mempunyai gen untuk endonuklease restriksisehingga DNA rekombinan yang diintroduksi tidak didegradasicontoh : E.coli DH5α, E.coli HB101
  40. 40. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. TRANSFORMASI • Electroporation – Electrical shock yang menyebabkan membran menjadi permeabel terhadap DNA • Calcium Chloride/Heat Shock – Chemically-competent cells mengambil DNA setelah heat shockE.coli dibuat kompeten dengan cara kimia:-Peningkatan suhu dan CaCl2 à heat shock pada 370 C – 420 C,dalam larutan CaCl2- Setelah ditransformasi, disebar pada medium seleksi
  41. 41. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.Electroporation Electric shock Membuat pori-pori kecil pada membran sel
  42. 42. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. SELEKSIE.coli ( plasmid DNA rekombinan ) di seleksi terhadapE.coli yang tidak membawa rekombinanMacam seleksi : ( 4 )1.Seleksi langsung : contoh: ABR = ABS (inaktivasi penyisipan ) à perlu teknik cawan replika (replica plating)2. seleksi warna koloni : X – gal ®, memanfaatkan gen lacZ yang menghasilkan enz. β – galactosidase. Enzim tsb mengubah substrat X- gal menjadi β-gal biru3.Komplementasi = gen Lacz pada vector vs pada E. coli DHS α ( inang )4. Analisa hibridisasi : - dot blot; colony hybridization
  43. 43. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.REPLICA PLATING• Pertama sebar sel pada cawan agar mengandung AMPICILLIN – Semua TRANSFORMAN menghasilkan koloni (tumbuh) • Replika pada cawan mengandung Tetrasiklin – Hanya NON-REKOMBINAN yang tumbuh Kain BLOCK Beludru PRESS AMP LATE = Transforman AMPR
  44. 44. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.REPLICA PLATING• Replika pada cawan mengandung Tetrasiklin – Hanya NON-REKOMBINAN yang tumbuh Kain BLOCK Beludru PRESS BLOCK AMP LATE AMP LATE BLOCK BLOCK TET PLATE AMP LATE
  45. 45. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.REPLICA PLATING• Replika pada cawan mengandung Tetrasiklin – Hanya NON-REKOMBINAN yang tumbuh GROWTETRES NON-RECOMBINANTS TET PLATE• Cawan TET dan cawan AMP dibandingkan – Ambil REKOMBINAN dari TETSENS AMPRES dari cawan AMP AMP LATE TETRES NON- RECOMBINANTS TET PLATE
  46. 46. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. VERIFIKASI DAN PEMETAAN DNA REKOMBINANDilakukan menggunakan Enzim endonuklease restriksi (ER).Vertifikasi :àMemastikan adanya DNA insert / asing yang di klon pada vektor,menggunakan satu dan dua (ganda) ER (single digest dan doubledigest), berdasarkan ukuran DNA dengan di larikan (running) dielektroforesis gel agarose.Pemetaan :Manfaat ER dalam biologi molekuler.Untuk mengetahui ukuran DNA rekombinan berdasarkan situs – situsEnzim restriksi.à Disebut Physical mapping ( pemetaan fisik ):pemetaan fisik yang lengkap memerlukan berbagai ER.
  47. 47. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. KLONING SEKUENS DNA PENYANDI PROTEIN EUKARIOTPerlu teknik khususàProkariot tidak dapat melakukan intron splicingàDNA eukariot besar karena mengandung banyak intronàEkspresi akan kacau oleh prokariotOleh karena itu :-menggunakan MRNA mature- Enzim Reverse transcriptase yang mensintesis satu utas DNA dariRNA kmd dilanjutkan dengan kerja Klenow fragment yangmensintesis utas kedua DNA dari template DNASehingga akan diperoleh dua macam c DNA ( complementary DNA ) :yang utuh & parsial
  48. 48. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. PRODUK BIOTEKNOLOGI MOLEKULERSEKTOR :Medicinal : -Human Therapeutic -Human DiagnosticNon medical : -Agriculture -Specialities -Non-medical DiagnosticContoh : INDIGO à pewarna jeans
  49. 49. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.INDIGO -diekstraksi dari tanaman -batubara -rekombinan DNALintasan Indigo : banyak dipakai untuk industri Blue JeansGenencor International : green route to blue dye Indol diubah menjadi cis – indole 2,3 – dehydrodiol dengan gen dari Pseudomonas putida yang disisipkan pada E. coli
  50. 50. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. DIAGNOSTIK MOLEKULERKemajuan bidang pengobatan karena berhasil didapatkannya virus– virus spesifik, bakteri, fungi dll, juga molekul – molekul kecil.Untuk kepentingan pencegahan, control, pengobatan dari penyakit –penyakit infeksi maka perlu identifikasi dini dan akurat terhadaporganisme pathogen penyebab penyakità ditumbuhkan/dikultur à amati sifat – sifat fisiologisKENDALA : lama mahalà ada yang tidak dapat ditumbuhkan/dikulturkan à sulit mendeteksi organisme penyebab penyakit
  51. 51. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.Untuk mengatasi kendala – kendala tersebut makadikembangkan prosedur – prosedur diagnostik molekular:1. Metode immunologi detection Co : ELISA monoclonal antibody yang diproduksi di E. coli ( Enzyme – linked immunosorbent assay )2. Metode deteksi DNA yaitu deteksi menggunakan pelacak DNA Prinsip hibridisasi asam. NukleatEssei ini : cepat reliable spesifisitas tinggi : hanya berhibridisasi dengan sekuens nukleotida target
  52. 52. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. PRODUK KOMERSIAL REKAYASA MIKROBAHUMAN PROTEIN PHARMACEUTICALS- jumlah sangat terbatas- produksinya mahal-biological mode of action belum dikarakterisasi jelas+ 300 macam protein terapeutis manusia yang potensial telahdiklon, dan telah melalui berbagai uji selama bertahun–tahunsebelum tersedia secara komersial. (Tabel 7.1)
  53. 53. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. Pharmaceutical biotechnology• Diabetes Insulin• Haemophilia Factor VIII• Stroke Tissue plasminogen activator• Growth failure Human growth hormone• Anaemia Erythropoietin• Viral infection Interferon
  54. 54. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.Strategi teknologi rekombinan DNA human protein pharmaceutical Isolasi cDNA Engineering (Rekayasa) Optimizing Gene Expression
  55. 55. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.§Isolasi cDNAStrategi I: Isolasi protein target Determinasi sekuens asam amino Deduksi menjadi sekuens DNA penyandi Sintesis oligonukleotida Gunakan sebagai probe utk mengisolasi gen atau cDNA dari pustaka genom atau pustaka cDNA
  56. 56. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.Strategi II: Jika suatu protein khusus disintesis di suatujaringan khususà Pustaka cDNA dapat dibuat dari mRNA ; tidak perlu dariprotein.mRNA berfungsi sebagai probe untuk sekuens DNA target.Contoh : Insulin à disintesis hanya dijaringan khusus dipancreas yaitu di pulau Langerhans.Oleh karena itu fraksi mRNA yang diisolasi dari jaringan tersebut70 % menyandikan insulin. MRNA (mature) Reverse transcribed cDNA
  57. 57. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. §Engineering Strategi untuk mendesain protein – protein, dengan cara mengatur kombinasi domain – domain fungsional suatu protein, atau dengan cara mutagenesisis terarah, agar dapat mempelajari mode of action suatu protein. §Optimizing Gene Expression-sistem ekspresi prokariot dan eukariot beda-jika menggunakan prokariot sebagai sel inang akan menurunkanbiaya -namun dipertanyakan apakah efektifitas sintesis bentuk fungsionalprotein heterogous masih tetap??
  58. 58. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.§Optimizing Gene ExpressionHarus dipilih berdasarkan kriteria :-memproduksi protein heterologus yang mirip dengan matureauthentic protein, selain-mampu tumbuh dengan densitas sel tinggi-mudah dipurifikasiContoh : human interleukin – 3Produksi paling baik di Bacillus licheniformismeskipun produksi banyak di E. coli, tapi menghasilkan proteininterleukin-3 yang salah.
  59. 59. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.Sintesis L-Ascorbic Acid ( Vit. C)D-glucoseD-Sorbitol L-sorbose 2 KLG (2-keto-L-gluconic acid) L- ascorbic Acidà Satu tahap fermentasi mikroba à sejumlah tahap – tahapkimiaDari penelitian – penelitian biokimia mengenai lintasan – lintasanmetabolit diketahui bahwa beberapa mikroorganisme menunjukkankemungkinan untuk mensintesis 2 - KLG
  60. 60. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.AcetobacterGluconobacter D. glucose 2,5 – diketo- D- glukonic acid (2,5 – DKG)Erwinia melalui beberapa lintas metabolismeCorynebacterium 2,5-DKG reduktaseBrevibacterium 2,5 – DKG 2 – KLGArthrobacter 1 lintas metabolismeGen penyandi enzim 2.5 – DKG reduktase dari Corynebacterium diklon di Erwinia
  61. 61. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.•MENINGKATKAN PRODUKSI ANTIBOTIKProduksi antibiotik dari Streptomyces spp dengan Fermentasià lama – lama konsentrasi oksigen dalam media cair berkurangPertumbuhan Streptomyces spp menurun dan produksi antibiotikmenurunVitreoscilla sp adalah bakteri aerob yang dapat hidup dalam kondisimiskin O2Bakteri ini dapat memproduksi suatu protein hem homodimerik yangberfungsi mirip dengan hemoglobin eukariot, yaitu dapat mengikat O2dari medium kemudian menyalurkannya ke dalam sel.Gen yang menyandikan protein heme tersebut di klon di Streptomyces
  62. 62. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. TERAPI GEN• Beberapa penyakit genetik manusia dapat dikaitkan terhadap suatu mutasi di suatu gen tunggal, atau mungkin juga lebih kompleks, yaitu terhadap sejumlah gen-gen berbeda yang bermutasi.• TUJUAN utama riset dalam genetika molekuler manusia à menentukan kecacatan pada level gen, dan bagaimana keadaan tersebut menyebabkan simtom penyakit genetik yang spesifik
  63. 63. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. PENDEKATAN Protein yang terlibat Isolasi dan karakterisasi Sekuensing asam amino Investigasi sekuen penyandi Buat pelacak spesifikIsolasi gen target dari pustaka genom
  64. 64. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.• Dasar pemikiran terapi gen: – Jika versi normal dari gen untuk penyakit manusia telah berhasil diklon, maka sangat berbuna untuk memperbaiki kecacatan/mutasi gen tersebut
  65. 65. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. Ex vivo gene therapy Sel diambil dari orang penderita penyakit (pasien) Perbaiki cacat genetik dengan cara transfer gen Seleksi dan tumbuhkan sel-sel yang telah dikoreksi secara genetik (remedial cell) Infuskan atau transplantasikan kembali ke pasienGen remedial diintroduksi ke sel oleh suatu retrovirus mencit yangseudah direkayasa sehingga tidak mampu mengkonversi sel normalmenjadi sel kanker.Retrovirus (rekombinan) menginfeksi sel manusia sehingga genremedial masuk
  66. 66. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. In vivo gene therapyMenggunakan adenovirus : ds DNA low pathogenicity in human Gen remedial Konstruksi pada vektor virus di bawah promotor khusus yang spesifik menginfeksi sel khusus (sel target)
  67. 67. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. Antisense therapy Dirancang untuk pencegahan; - penurunan ekspresi gen tertentu, - bekerja pada tahap translasi (mRNA) Ada 2 cara: A.Menggunakan antisense oligonukleotida (satu utas) B.Menggunakan gen antisense yang diklonAntisense adalah utas asam nukleat DNA yang tidakditranskripsikan, merupakan utas pasangan dari utas yangditranskripsikan (utas sense).
  68. 68. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.A. Menggunakan antisense oligonukleotida (satu utas):DNA------ A G C T G A T -----------------T C G A C T A ---------- transcription antisensemRNA oligonukleotida AGCUGAU TCGACTA Base pairing AGCUGAU TCGACTA No translation
  69. 69. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.B. Menggunakan gen antisense yang diklonDNA------ A G C T G A T ---------- -------T G C G A C T A--------------T C G A C T A ---------- -------A C G C T G A T------- transcriptionmRNA AGCUGAU UCGACUA Base pairingmRNA sense AGCUGAUmRNA antisense TCGACTA No translation
  70. 70. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. PROSEDUR – PROSEDUR DALAM RISET MOLEKULERI. DNA sequencing techniques 1. prosedur Dideoxynucleotide : - Maxam – Gilbert : chemical based - Sanger : enzymatic based 2. Penggunaan Bacteriophage M13 Untuk memperoleh ss.DNA Target DNA + 500 bp < 2000 bp : harus dipotong – potong menjadi beberapa fragmen overlap dengan ER• Primer Walking :• Uk. DNA > 5000 BP
  71. 71. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. PROSEDUR – PROSEDUR DALAM RISET MOLEKULERII. Polymerase Chain Reaction ( PCR ) - Amplifikasi molekul DNA - Esensial : 1. Dua buah primer sintesis oligonukleotida (masing – masing ~ 20 nt ) 2. sekuens target pada sampel DNA 3. DNA polymerase yang thermostabil à mencapai suhu 950 C atau lebih 4. Empat macam deoxynucleotidatriphosphat (dNTP) : dATP, dCTP, dGTP, dTTP
  72. 72. Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. PROSEDUR – PROSEDUR DALAM RISET MOLEKULERII. Polymerase Chain Reaction ( PCR )Tahap – tahap :-denaturasi : - suhu 950 C : ds-DNA menjadi ss-DNA - enzim Taq DNA polymerase - primer-renaturasi /annealing : suhu diturunkan perlahan sampai 550C primer berikatan dengan template DNA-sintesis : - suhu dinaikkan sampai 750C, suhu optimum untuk fungsi katalisis enzim Taq DNA polymerase untuk mensintesis DNA.Ketiga tahap diulangi beberapa siklus sampai diperoleh molekulDNA dalam jumlah besar.

×