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Métodos

  1. 1. Imunologia Clínica Faculdade Dom BoscoTestes sorológicos Professor: Vitor Yuzo Obara vitorobara@hotmail.com
  2. 2. Nesta aula veremos:Como a interação entre antígeno e anticorpo podem promover o diagnóstico de doenças?Quais são as condições para ocorrer este tipo de reação?Quais são os métodos mais comumente empregados em laboratórios de Análises Clínicas?Quais técnicas podem ser automatizadas?
  3. 3. 1 CARACTERÍSTICAS GERAIS DA REAÇÃO ANTÍGENO-ANTICORPOLigantes biológicos baseados entre afinidades entre as moléculas;Reconhecimento específico;Variedade de métodos;Detecção de antígenos e anticorpos;Sensibilidade do teste potencializada;Detecção de moléculas pequenas a moléculas complexas.
  4. 4. 1.1 Características do AntígenoPresença de epítopos;Induzir a produção de anticorpos correspondentes;Epítopos: Sequências de aminoácidos em proteínas; Estruturas proteicas de alta dimensão.
  5. 5. 1.2 Características do AnticorpoImunoglobulina, proteína plasmática;Produzidos em resposta a estímulos antigênicos;Moléculas funcionais e heterogêneas que ligam aos antígenos através do sítio combinatório;5 classes: IgM, IgG, IgA, IgD e IgE.Duas porções: Cadeia pesada (porção constante) e cadeias leves λ ou κ (porção hipervariável – se liga ao antígeno).
  6. 6. 1.2.1 Anticorpos policlonaisObtido pela imunização com antígeno que apresenta vários epítopos;Vários clones de linfócitos B;Anticorpos apresentam heterogeneidade;Alta avidez, comparada com anticorpo monoclonal, porém mais interferentes.
  7. 7. 1.2.2 Anticorpos monoclonaisAnticorpos obtidos através de um único clone;Fusão celular entre uma célula B normal produtor de anticorpo e uma de linhagem de mieloma (câncer de linfócito B) - Hibridoma;Não reconhecem uma molécula inteira, apenas um único epítopo;Reatividade cruzada com outros antígenos (mesma sequência de aminoácidos, carboidratos e lipídeos)
  8. 8. 1.2.2.3 Vantagens e limitações do anticorpo monoclonalVantagens: Limitações: Reagente bem definido; Reatividade insuficiente Produção ilimitada de na precipitação ou reagente homogêneo; aglutinação (formação de um complexo de Podem ser preparados ligação fraca); pela imunização com um antígeno não- Um único anticorpo purificado. monoclonal pode ser insuficiente para caracterização imunoquímica.
  9. 9. 1.3 Produção de anticorpos pela tecnologia Recombinante
  10. 10. 1.4 Cinética da Reação Ag-AcLei do equilíbrio: K1Ag + Ac AgAc K2 Ag = Antígeno livre Ac = Anticorpo livre AgAc = Antígeno ligado ao anticorpo K1 = Constante de Associação K2 = Constante de Dissociação
  11. 11. 1.4 Cinética da Reação Ag-AcTaxa de formação do complexo AgAc = K1 [Ag][Ac]-K2[AgAc] Se em equilíbrio, a taxa é nula:K1 [AgAc] Ka (Constante de afinidade)K2 [Ag][Ac]AVIDEZ
  12. 12. 1.5 Fatores de InterferênciaConstante de associação (Ka) do reagente;Intensidade do sinal dos marcadores;↓ razão sinal de detecção/ruído de fundo (reação inespecífica ou próprio sinal);
  13. 13. 1.6 Fase sólidaSuporte para ocorrer separação do imunocomplexo (AgAc) de componentes restantes livres;Partículas de gel produzidas em agarose, poliacrilamida, pérolas de plástico, placas de micro titulação em poliestireno, partículas de óxido de ferro, eritrócitos, látex.
  14. 14. 2 CLASSES DE IMUNOENSAIOSPrecipitação;Aglutinação;Líticos;Radioimunoensaio (RIE);Enzimáticos (EIE);Fluorescentes (IF);Quimioluminescentes.
  15. 15. 2.1 Precipitação Fenômeno de pró-zonaReação entre Ag e Ac resultando em um complexo grande, visível a olho nu;Depende das [ ] relativas dos reagentes, Tpt, pH, força iônica do meio, avidez dos Ac;Ponto de equivalência: [Ag] = [Ac] → Precipitação máxima.Curva de precipitação (Heindelberger e Kendall)Imunodifusão.
  16. 16. 2.1 Precipitação Amostra do Antígeno de doença a ser paciente pesquisada (contém Ac)Y YYY Y Y YYY Y Y Y A A A A Teste de precipitação Antígeno: CandidinaA A A A A A A A A A A
  17. 17. 2.1 PrecipitaçãoAmostra do Antígeno de doença a ser paciente pesquisada (contém Ac) Y YYY Y Y Y YY Y Y Y A A A A Teste de precipitação Antígeno: CandidinaA A A A A A A A A A A
  18. 18. 2.1 PrecipitaçãoAc do Ag pc Ag = Antígeno= Anticorpo
  19. 19. 2.1 Precipitação Ag Ag Ag Ag Ag Ag Ag Ag Ag Ag Ag Ag Ag Ag Ag Ag Ag Ag Ag Ag Ag Ag Ag Ag
  20. 20. 2.1 PrecipitaçãoAc do Ag pc Ponto de equivalênci a: [Ac]=[Ag]
  21. 21. 2.1 PrecipitaçãoAg Ag Ag Ag Ag Ag Ag Ag Ag Ag Ag Ag Ag Ag Ag Ag Ag Ag Ag Ag Ag Ag Ag Ag Ag Ag Ag Ag
  22. 22. 2.2 AglutinaçãoReação que resulta em agregados visíveis = resultados da interação (Ac)-(Ag-Partículas insolúveis);Dois estágios (simultâneos): I – mistura do Ac (soro) com as partículas sensibilizadas. II – Ac estabelece ponte entre as partículas;Fase sólida pode conter o elemento antigênico (Aglutinação direta) ou sofrer sensibilização (Aglutinação indireta).
  23. 23. 2.2 AglutinaçãoTeste de Aglutinação Direta: Tipagem do grupo ABO e Rh; Teste de inibição da hemaglutinação: Ac contra os vírus da Rubéola, Sarampo, Influenza e outros que promovem a hemaglutinação. Não diferencia IgG e IgM.Testes de Aglutinação Indireta: Partículas podem ser sensibilizadas através de adsorção de Ag solúveis ou por conjugação. Teste de hemaglutinação passiva, teste de aglutinação do látex e teste de aglutinação de cristais de colesterol (VDRL)
  24. 24. 2.2.1 VDRLVeneral Disease Research LaboratoryCristais de colesterol sensibilizados com lecitina e cardiolipina (lipídios);Detecção de anticorpos anti lipídios liberados no início da infecção pelas células lesadas e do próprio treponema.Teste positivo: Presença de flocos visíveis macroscopicamente em contraste com fundo escuro.
  25. 25. 2.2.1 VDRL Amostra do Cristal de colesterol paciente sensibilizado com (contém Ac) Lecitina e CardiolipinaY YYY Y Y YYY Y Y Y A A A A Teste de Aglutinação VDRL A A A A A A A A A A A
  26. 26. 2.2.1 VDRLAmostra do Antígeno de doença a ser paciente pesquisada (contém Ac) Y YYY Y Y Y YY Y Y Y A A A A Teste de Aglutinação VDRL A A A A A A A A A A A
  27. 27. 2.2.1 VDRL Antígeno de doença a ser pesquisadaA A AATeste de Aglutinação VDRL AA Ag A AA A A A A A A Fase sólida: Cristal de Ag Colesterol
  28. 28. 2.2.1 VDRL
  29. 29. 2.3 Ensaios LíticosTeste de fixação do complemento: Ligação entre Ag-Ac promove a fixação do complemento, podendo ser empregado na detecção de Ag e/ou Ac; Duas etapas: I – Incubação do Ag com Ac (ativação do complemento); II – Adição do indicador da reação (hemácia de carneiro sensibilizadas com hemolisina).Ensaio da Neutralização da Hemólise: Inibição de toxinas antigênicas e hemolíticas de Estreptococos ß-hemolíticos. Duas etapas: I – Incubação do Ac (soro do pc) com hemolisina específica. II – Hemácias do grupo O.
  30. 30. 2.3 Ensaios Líticos
  31. 31. 2.4 Imunofluorescência (IF)Capacidade de Ac ligarem-se a fluorocromos sem perder atividade específica com Ag; Fluorocromos: Substâncias que se excitam em luz de alta energia e, instantaneamente, emitem luz visível.Intensidade de luz depende de pH, sendo ótimo em 8,5;Uso de corantes podem diminuir a coloração de fundo e melhorar o contraste (Azul de Evans ou vermelho do Congo);Leitura dependente de Microscópio de flourescência.
  32. 32. 2.4 Imunofluorescência (IF) Fase sólida = Lâmina
  33. 33. 2.4 Imunofluorescência (IF)
  34. 34. 8
  35. 35. 2.4 Imunofluorescência (IF)Amostra do paciente (contém Ac) Y Y Y Y Y Y Y Y Y
  36. 36. 2.4 Imunofluorescência (IF)
  37. 37. 2.4 Imunofluorescência (IF) F C F C F C
  38. 38. 2.4 Imunofluorescência (IF)
  39. 39. 2.4 Imunofluorescência (IF)
  40. 40. 2.5 Radioimunoensaio (RIE)Método de alta sensibilidade (detecção na ordem de ng - 10-9g - ou pg -10-12g), mesmo em preparações não-purificadas, preciso e rápido;↑ custo, ↓ vida média dos reagentes, ↑ risco operacional;Reagente marcado com marcadores radioativos quantifica Ac ou Ag não marcado (soro).
  41. 41. 2.5 Radioimunoensaio (RIE)
  42. 42. 2.6 Ensaio enzimáticoMétodo quantitativo monitorada pela atividade enzimática;Reagentes mais estáveis que RIE, sem exigência de se trabalhar com radioisótopos, pode ser realizada de forma manual ou automatizada;Sistema de detecção: leituras visuais a fotométricas.
  43. 43. 2.6 Ensaio enzimáticoAumento de limiar de sensibilidade por não necessitar de uma segunda etapa (precipitar, aglutinar ou lisar células);Enzima: alta atividade específica, produto da reação enzimática deve ser estável e de fácil quantificação, ser estável, facilmente obtida de forma purificada, ligar-se a antígenos e anticorpos diversos sem perder sua atividade (formação do conjugado), ter preço acessível. Peroxidade, fosfatase alcalina.
  44. 44. 2.6.1 ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay)Princípio: Imobilização de um dos reagentes (Ag ou Ac) em uma fase sólida com outro reagente conjugado a uma enzima (atividade enzimática e imunológica preservada); E E
  45. 45. 2.6.1 ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay)Objetivo: Quantificação de Ag, quando bem definidos, requer uma curva de calibração; Verificação da presença de Ac, maior complexidade na mensuração pela sua heterogeneidade de afinidade e propriedades físico-químicas, geralmente afinidade aumenta em amostras diluídas;Cut-off: separa numericamente valores positivos de negativos.
  46. 46. 2.6.1 ELISA
  47. 47. 2.6.1.1 Tipos de ELISAPesquisa de Antígenos: Sanduíche (Captura); Competição com antígeno marcado.Pesquisa de Anticorpos: Indireto (Não competitivo); Direto (Competitivo); Captura de IgM.Imunoensaio Homogêneo: Immunoblotting
  48. 48. 2.6.1.1.1 Tipos de ELISA: Sanduíche Fase sólida sensibilizada com Ac;ELISA tipo Sanduíche Amostra (Ag); Ac marcado (conjugado); > [Ag da amostra], > ligação aos Ac, >densidade de leitura;
  49. 49. 2.6.1.1.2 Tipos de ELISA:Competição com Ag marcado Fase sólida sensibilizada com Ac; Amostra (Ag) e Ag marcado (conjugado); > [Ag da amostra], > ligação aos Ac, < ligação com o conjugado <densidade de leitura.
  50. 50. 2.6.1.1.3 Tipos de ELISA: Indireto (Não competitivo)
  51. 51. 2.6.1.1.4 Tipos de ELISA: Direto ELISA direto (competitivo)
  52. 52. 2.6.1.1.5 Tipos de ELISA: Captura de IgM Captura IgM
  53. 53. 2.6.1.1 Tipos de ELISA: Homogêneo (Immunoblotting)Separação dos Ag (pc) por eletroforese;Imersão do suporte em Ac específicos;Revelação: coloca-se esta membrana em solução com anti-Ig ligado a uma enzima e um cromógeno (precipitado colorido)
  54. 54. 2.7 Ensaios quimioluminescentesObtenção de energia luminosa a partir de uma reação química;Dissociação de componentes intermediários → excitação eletrônica → retorno ao estado original de energia → LUZ;≠ Imunofluorescência!>limite de detecção que o ELISA→10-18até10-21 M< custo relativo (baixo consumo de reagentes)Rapidez.
  55. 55. 2.7.1 Enzimaimunoensaio quimioluminescentePrincípio: Detecção da reação Ag-Ac utilizando uma enzima e uma molécula sintetizada que atuará como substrato para a enzima através de emissão de luz;Moléculas quimioluminescentes: Luminol, derivados de acridina, éster de fenantridina, indol e dioxetano, fosfatase alcalina, peroxidase, etc.Mais utilizado em métodos semi- ou totalmente automatizados.
  56. 56. 3 TÉCNICAS EMPREGADAS NA AUTOMAÇÃONefelometria;Turbidimetria;Imunoensaio Quimioluminescente;Imunoensaio Fluorescente;Citometria de Fluxo.
  57. 57. 3.1 NefelometriaMedida do espalhamento de uma luz incidente, devido a partículas (imunocomplexo Ag-Ac) em suspensão, para um determinado ângulo;Esse fenômeno é proporcional ao tamanho, forma e concentração das partículas insolúveis formadas;Quantificar as reações de precipitação: ↑ Precipitação → espalhamento e reflexão da luz → ↓ Transmitância da luz;O anti-soro deve ser oticamente límpido, com índice de refração conhecida.
  58. 58. 3.1 Nefelometria
  59. 59. 3.2 TurbidimetriaMedida da diminuição de intensidade de luz emitida devido a partículas que absorverão, refletirão ou espalharão a luz;Luz emitida deve ser próximo ao UV (290-410nm) pois é a região que os imunocomplexos mais absorvem luz;A mistura dos reagentes deve ser rápida e completa, para evitar a formação de áreas mais concentradas → analisador com agitação constante.
  60. 60. 3.2 Turbidimetria vs. Nefelometria
  61. 61. 3.3 Imunoensaio QuimioluminescenteMedição de luz emitida pode ser chamada de luminometria, desse modo, os aparelhos que realizam a leitura de intensidade de luz chamam- se luminômetros;Conjugado (reagente marcado) e os amplificadores da reação são próprios dos fabricantes, p.ex. ImmuliteTM (Siemens) emprega a enzima fosfatase alcalina e como substrato fosfato de adamantil 1,2- dioxetano.
  62. 62. 3.4 Imunoensaio FluorescenteDetecção e quantificação de Ag e Ac utilizando conjugados fluorescentes cuja emissão de luz é lida por um fluorômetro;Fluoróforos são compostos em estrutura de anelbenzênico ( ) que absorvem a luz de altaenergia (UV) e promove ressonência entre os elétrons, quando estes elétrons retornam a uma camada de menor energia (estado inicial), ocorre emissão de luz visível.
  63. 63. 3.5 Citometria de FluxoPrincípio: Cito (célula)+metria (medida) + fluxo (movimento) FOCO DO LASER CONVERGÊNCIA HIDRODINÂMICA
  64. 64. 3.5 Citometria de FluxoMarcação de subpopulações de células com Ac ligados a conjugados específicos e diferentes para cada tipo celular.
  65. 65. 3.5.1 Detectores de dispersão de luz em ângulo de 90ºLaser FALS Sensor Detector 90LS
  66. 66. 3.5.2 Detectores de fluorescência FALS Sensor Freq Fluorescence Fluorescence detector (PMT3, PMT4 etc.)
  67. 67. 3.5.2 Detectores de fluorescência
  68. 68. 4 Testes rápidosMétodo dipstick – Ensaios imunocromatográficos: Busca de Ac (soro) ou Ag (soro, urina, sangue lisado, fezes, líquidos); Teste qualitativo simples, rápido, fácil e barato, além de fácil interpretação e os controles positivos e negativos já estão contidos; Método de impregnação, semelhante ao Western blot; Reagente de detecção pode ser marcado com corante coloidal ou enzimas.
  69. 69. 4 Testes rápidos
  70. 70. Considerações Método Fase sólida Leitura Conjugado Revelador Precipitação Não Leitura direta NA NA Aglutinação Sim Aglutinação NA NA (formação de rede)Ensaios líticos Sim Hemólise NA NA IF Sim Emissão de luz Ac-FC UV (excitação por emissão de UV) RIE Sim Emissão de um Ac-I 125 Substrato sinal radioativo ELISA Sim Mudança de cor Ac-E Substrato EQ Sim Emissão de luz Ac-composto Substrato (Reação luminescente química) Nefelometria Não Quantidade de NA NA luz desviadaTurbidimetria Não Diminuição da NA NA intensidade de luz emitida
  71. 71. ReferênciasSANCHEZ, M.C.A. Testes sorológicos. In: FERREIRA, A.W.; ÁVILA, S.L.M. Diagnóstico laboratorial das principais doenças infecciosas e auto-imunes. 2.ed. [Reimp] Rio de Janeiro: Gunabara Koogan, 2011. Cap. 2 pp.9-48.ASHIHARA, Y. et al. Imunoensaios e imunouímica. In: HENRY, J.B. Diagnóstico Clínico e tratamento por métodos laboratoriais. 20. ed. São Paulo: Manole, 2008. Cap. 35. pp.952-981.

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