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Determinaciòn de azúcares reductores por espectrofotometría (método dns)

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Determinaciòn de azúcares reductores por espectrofotometría (método dns)

  1. 1. "AÑO DE LA PROMOCIÓN DE LA INDUSTRIA RESPONSABLE Y DEL COMPROMISO CLIMÁTICO" “DETERMINACIÒN DE AZÚCARES REDUCTORES POR ESPECTROFOTOMETRÍA (MÉTODO DNS)” CURSO: Análisis instrumental de productos Agroind. CICLO: VI DOCENTE: ING. RODRIGUEZ PAUCAR GILBERT NILO INTEGRANTES:  MUÑOZ ROJAS, Andrea Gisela.  VEGA VIERA, Jhonas Abner. FACULTAD DE INGENIERÍA ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL NUEVO CHIMBOTE - PERÚ
  2. 2. COMPOSICIÓN BIOQUÍMICA DE PRODUCTOS AGROINDUSTRIALES MUÑOZ ROJAS, Andrea Gisela. VEGA VIERA, Jhonas Abner. Página 2 I. INTRODUCCIÓN Entre los distintos componentes de los alimentos, después del agua, los carbohidratos son las sustancias más abundantes y más ampliamente distribuidas en la naturaleza; siendo la celulosa la biomolécula que se encuentra en mayor cantidad en la biosfera, y el almidón, la fuente energética alimentaria más empleada en el mundo. En todos los seres vivos se encuentran presentes los carbohidratos ya que la ribosa y la desoxirribosa son parte de su material genético. De la misma forma, en las frutas y hortalizas los carbohidratos cumplen funciones estructurales y energéticas, constituyendo algunos la estructura rígida o mecánica de los tejidos vegetales; en tanto que en las semillas, raíces y tubérculos funcionan básicamente como reservas energéticas. Por otro lado, en algunos animales estos compuestos son parte de sus reservas energéticas (glucógeno) o constituyen un componente esencial de su estructura externa (quitina). Además de ser componentes naturales de muchos alimentos, la industria alimentaria emplea los carbohidratos en función de sus propiedades funcionales, usándolos como ingredientes para mejorar la aceptabilidad, palatabilidad y vida útil de diversos alimentos. Desde el punto de vista químico, los carbohidratos pueden definirse como polihidroxialdehidos y polihidroxicetonas y sus derivados. Según la anterior definición, la denominación de carbohidrato agrupa a una gran cantidad de compuestos. En la naturaleza se encuentran carbohidratos de diferente número de carbonos y distintos grupos funcionales o susbstituyentes. Esto da origen a distintos tipos de azúcares, tales como las aldosas, cetosas, azúcares acetilados, benzoesterificados y metilados, azúcares ácidos, glicósidos y anhidroazúcares. De la misma forma, las moléculas de carbohidrato pueden incluir desde un solo monosacárido hasta varios miles de estos. Debido a lo expuesto anteriormente, la diversidad de sus orígenes y la gran variabilidad en su composición química, han surgido una variedad enorme de métodos de análisis de carbohidratos; ya sean dichos métodos: físicos, químicos o bioquímicos. Entre los métodos cualitativos basados en las propiedades físicas de los carbohidratos están las cromatografías en papel y capa fina, la cromatografía gas-líquido, la de intercambio iónico, la electroforesis, la refractometría, la hidrometría, la polarimetría y la espectroscopia de rayos infrarrojos. Por otro lado, entre los métodos químicos están los basados en reacciones que dan origen a compuestos coloreados, tales como las que se dan después de tratar los monosacáridos con ácido mineral fuerte y hacer reaccionar el furfural o hidroxifurfural formado, con compuestos orgánicos tales como fenoles, aminas aromáticas, urea y antrona.
  3. 3. COMPOSICIÓN BIOQUÍMICA DE PRODUCTOS AGROINDUSTRIALES MUÑOZ ROJAS, Andrea Gisela. VEGA VIERA, Jhonas Abner. Página 3 De la misma forma, también se hace uso de su capacidad reductora, haciéndolos reaccionar con sales de metales como el cobre, hierro, yodo, plata y cerio. Por último, también es posible su análisis basándose en la capacidad de formar complejos coloreados con el yodo, tal como sucede con el almidón. En relación con los métodos bioquímicos de análisis de carbohidratos, estos pueden ser microbiológicos o emzimáticos. Los primeros se basan en la capacidad de ciertas cepas de lavaduras de fermentar específicamente algunos grupos de azúcares; dichas levaduras son especialmente útiles a la hora de diferenciar entre pentosas y hexosas, incluyendo los polímeros de ambas. Con respecto a los métodos enzimáticos, estos incluyen los análisis de monosacáridos, oligosacáridos y polisacáridos. En el caso de los dos últimos, el análisis incluye la hidrólisis enzimática de los enlaces glicosídicos. II. FUNDAMENTO TEORICO El método DNS (técnica de miller) es una técnica colorimétrica que emplea ácido 3,5 dinitrosalicílico para la hidrólisis de polisacáridos presentes en una muestra. Determina las absorbancias por medio de un espectrofotómetro a 540nm. Esta técnica sirve para cuantificar los azucares reductores producidos durante una fermentación o para cuantificar los productos de una reacción enzimática. La curva de calibración es la representación gráfica en un eje de coordenadas, de la Absorbancia (eje de ordenadas: Y) frente a la Concentración (eje de abscisas: X). Se ensayan varias soluciones de concentración conocida y se determinan sus absorbancias, construyéndose la curva de calibrado, que es una recta. La concentración de una solución problema (desconocida), se averigua por interpolación de la Abs de la solución en la curva de calibración, o a través de la ecuación de la recta (y = mx + b) donde: Absorbancia (y) = constante (m) x concentración + absorbancia del blanco. Fundamento. El DNS reacciona únicamente con los azúcares reductores. La sacarosa es un disacárido no reductor, pero tras su hidrólisis en medio ácido se liberan glucosa y fructosa que sí son reductores y reaccionan con el DNS generando un producto coloreado. La intensidad del color, que se puede medir por métodos espectrofotométricos es proporcional a la concentración de sacarosa. III. OBJETIVOS  Establecer la longitud de onda de la máxima absorción para las diferentes soluciones coloreadas  Conocer y aplicar los principios de la curva patrón aplicada a la cuantificación de azucares reductores con el reactivo 3,5-dinitrosalcilico (3,5 DNS)  Cuantificar los azucares reductores presentes en el alimento
  4. 4. COMPOSICIÓN BIOQUÍMICA DE PRODUCTOS AGROINDUSTRIALES MUÑOZ ROJAS, Andrea Gisela. VEGA VIERA, Jhonas Abner. Página 4 IV. MATERIALES Y METODOS A. Materiales - Espectrofotometro UV-Vis –NIR JASCO, MODELO v-670 - Centriguga digital Sigma - Materiales de vidrio: fiolas, pepetas, vasos de preciptado B. Reactivos DNS - Tratrato de sodio y potasio - Hidróxido de Sodio - Metabisulfito de sodio - Reactivo DNS C. METODOS - A muestras coloreadas, realizarles el barrido de lecturas de absorbancia desde 400 a 700 nm, luego determinar su máxima absorbancia. - Construcción de la curva de glucosa - Preparar un estándar de 1.0 mg/ml. De glucosa, realizar las diluciones para obtener concentraciones de 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2 y 1.4 mg/ml.
  5. 5. COMPOSICIÓN BIOQUÍMICA DE PRODUCTOS AGROINDUSTRIALES MUÑOZ ROJAS, Andrea Gisela. VEGA VIERA, Jhonas Abner. Página 5 - Tomar 1ml de cada patrón y llevar a un tubo de prueba, luego adicionar 1ml de solución DNS, agitar y llevar luego a ebullición por 10 min. Enfriar rápidamente y agregar 10 ml (o 5 ml.) de agua destilada con previa agitación. - Leer absorbancia en el espectrofotómetro a 540 nm. - Construir la curva patrón, para ello, graficar los datos de la curva patrón colocando en el eje de las abscisas la concentración de azucares reductores en
  6. 6. COMPOSICIÓN BIOQUÍMICA DE PRODUCTOS AGROINDUSTRIALES MUÑOZ ROJAS, Andrea Gisela. VEGA VIERA, Jhonas Abner. Página 6 mg/ml y en las ordenadas la absorbancia. Calcular la pendiente ajustando la ordenada a cero. - Análisis de muestra agroindustrial 1. Obtener de la muestra en forma de pulpa o jugo, y diluir la cantidad de muestra tal que la dilución final tenga aproximadamente entre 0,2 y 1 mg de azucares reductores por ml; de ser necesario, centrifugar la muestra y utilizar el sobrenadante. 2. En el caso de muestra sólida, diluir una cantidad en agua destilada luego someter a licuado, filtrar y el sobrenadante diluir hasta que la dilución final tenga aproximadamente entre 0.2 y 1 mg de azucares reductores por ml. 3. De la muestra diluida, extraer 1 ml en un tubo de ensayo, adicionar 1 ml de la solución DNS, agitar y llevar a ebullición por 10 min. Enfriar rápidamente y agregar 10 ml (o 5 ml.) de agua destilada con previa agitación. 4. Leer absorbancia en el espectrofotómetro a 540 nm. Con este dato encontrado insertaremos en la curva de calibración previamente construida y el resultado se debe expresar como porcentaje, tomando en consideración la dilución.
  7. 7. COMPOSICIÓN BIOQUÍMICA DE PRODUCTOS AGROINDUSTRIALES MUÑOZ ROJAS, Andrea Gisela. VEGA VIERA, Jhonas Abner. Página 7 V. RESULTADOS Se reportan las absorbancias obtenidas de las dos muestras en dos diferentes laboratorios de investigación. Utilizando las formulas se obtuvieron la media (Y°) de cada duplicado y la desviación estándar. Se muestra también la curva patrón obtenida y ajustada con regresión lineal, así como la ecuación de la curva. Se muestran las absorbancias medidas a una longitud de onda de 540nm, así como el promedio de las tres. Tubo de ensayo Concentración (mg/L) ABS A ABS B Promedio de Absorbancia 0 0 0 0 0 1 0.1 0.0342 0.029100 0.03165 2 0.2 0.0707 0.094200 0.08245 3 0.4 0.1560 0.266400 0.2112 4 0.6 0.2313 0.288800 0.26005 5 0.8 0.2590 0.399700 0.32935 6 1 0.4013 0.478700 0.44 7 1.2 0.4920 0.591800 0.5419 8 1.4 0.5405 0.678900 0.6097 Tabla1. Pruebas en el laboratorio de ing. agroindustrial a cargo de Ing. John Tubo de ensayo Concentración (mg/L) ABS A ABS B Promedio de Absorbancia 0 0 0 0 0 1 0.1 0.0184 0.007400 0.0129 2 0.2 0.066115 0.105292 0.0857035 3 0.4 0.21319 0.392325 0.3027575 4 0.6 0.3603728 0.435806 0.3980894 5 0.8 0.374709 0.617767 0.496238 6 1 0.630903 0.711945 0.671424 7 1.2 0.746647 0.937192 0.8419195 8 1.4 0.918258 1.114000 1.016129 Tabla2. Pruebas de laboratorio realizado en el instituto de investigación de Ing. Agroindustrial Usamos las siguientes fórmulas para calcular cálculo del promedio y la desviación estándar. Tabla 3. Fórmulas Media (풚°) 푦1+푦2+푦푁 푁 Dónde: N= número de valores y= Abs 540nm Desviación Estándar 휎=√ 1 푁 푦푖−푦° 2 푁 푖=1 Donde: N= número de valores 푦푖= Abs 540nm 풚°= media
  8. 8. COMPOSICIÓN BIOQUÍMICA DE PRODUCTOS AGROINDUSTRIALES MUÑOZ ROJAS, Andrea Gisela. VEGA VIERA, Jhonas Abner. Página 8 CASO A Hallamos la Media (Yº) En las pruebas del laboratorio de ing. agroindustrial a cargo de Ing. John (A) = 1+ 2+ Dónde: N= 8 y=todos los valores en la premisa A = -Hallamos la desviación estándar En las pruebas del laboratorio de ing. agroindustrial a cargo de Ing. John (A) =√ 1 − ° 2 =1 Donde: N= 8 yi= 0.0342 y°=0.2427777778 = 1 1 Hallamos la Media (Yº) En las pruebas del laboratorio de ing. agroindustrial a cargo de Ing. John (B) = 1+ 2+ Dónde: N= 8 y=todos los valores en la premisa A = -Hallamos la desviación estándar En las pruebas del laboratorio de ing. agroindustrial a cargo de Ing. John (B) =√ 1 − ° 2 =1 =0.213519
  9. 9. COMPOSICIÓN BIOQUÍMICA DE PRODUCTOS AGROINDUSTRIALES MUÑOZ ROJAS, Andrea Gisela. VEGA VIERA, Jhonas Abner. Página 9 CASO B Hallamos la Media (Yº) Pruebas de laboratorio realizada en el instituto de investigación de Ing. agroindustrial (A) = 1+ 2+ Dónde: N= 8 y=todos los valores en la premisa A = 0.41607435 -Hallamos la desviación estándar Pruebas de laboratorio realizada en el instituto de investigación de Ing. agroindustrial (A) =√ 1 − ° 2 =1 Donde: N= 8 yi= 0.0184 y°=0.41607435 =0.280076 Hallamos la Media (Yº) Pruebas de laboratorio realizado en el instituto de investigación de Ing. Agroindustrial (B) = 1+ 2+ Dónde: N= 8 y=todos los valores en la premisa A = 1 -Hallamos la desviación estándar Pruebas de laboratorio realizado en el instituto de investigación de Ing. Agroindustrial (B) =√ 1 − ° 2 =1 =0.35849477
  10. 10. COMPOSICIÓN BIOQUÍMICA DE PRODUCTOS AGROINDUSTRIALES MUÑOZ ROJAS, Andrea Gisela. VEGA VIERA, Jhonas Abner. Página 10 Caso A En las pruebas del laboratorio de ing. agroindustrial a cargo de Ing. John l (A y B) Gráfico 1. Se muestra las curvas obtenida en las pruebas de laboratorio de ing. agroindustrial. Caso B Pruebas de laboratorio realizada en el instituto de investigación de Ing. agroindustrial (A y B) Gráfico 2. Se muestra las curvas obtenida en las pruebas de laboratorio del instituto de investigación de Ing. Agroindustrial. y = 0.4402x - 0.0004 R² = 0.9928 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 Absorvancia 540nm Concentración (mg/L) ABS A ABS B Promedio de Absorbancia Lineal (Promedio de Absorbancia) y = 0.7453x - 0.0529 R² = 0.9921 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 ABS A ABS B Promedio de Absorbancia Lineal (Promedio de Absorbancia)
  11. 11. COMPOSICIÓN BIOQUÍMICA DE PRODUCTOS AGROINDUSTRIALES MUÑOZ ROJAS, Andrea Gisela. VEGA VIERA, Jhonas Abner. Página 11 Gráfico 3. Se muestra la curva patrón (promedio de absorción) obtenida en las pruebas de laboratorio. Se grafica la concentración en miligramos por litro contra el promedio obtenido de las absorbancias de las dos muestras. Se observa la ecuación dada por la regresión lineal. Utilizando la ecuación de la recta obtenida por la tendencia lineal de la curva de calibración observada en la (Grafica No.3) y el valor de las absorbancias que se Encuentran en las tablas Se llega a: - En las pruebas del laboratorio de ing. agroindustrial a cargo de Ing. John - Pruebas de laboratorio realizado en el instituto de investigación de Ing. Agroindustrial Despejando X de la Ec. = : 364 7285 .......... (1) = : 2 44 1 .......... (2) y = 0.7285x - 0.0364 R² = 0.9918 y = 0.4401x - 0.0002 R² = 0.9944 -0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 Promedio de Absorbancia John Promedio de Absorbancia IITO Lineal (Promedio de Absorbancia John) Lineal (Promedio de Absorbancia IITO) y = 0.7285x - 0.0364 y = 0.4401x - 0.0002 1 2
  12. 12. COMPOSICIÓN BIOQUÍMICA DE PRODUCTOS AGROINDUSTRIALES MUÑOZ ROJAS, Andrea Gisela. VEGA VIERA, Jhonas Abner. Página 12 Hallamos primero los valores de X en las pruebas del laboratorio de ing. agroindustrial a cargo de Ing. John cuando Y es la Absorbancia de la muestra problema = + Tubo de ensayo Concentración (mg/L) ABS ABS Promedio de Absorbancia tendencia lineal A B X 0 0 0 0 0 0.049965683 1 0.1 0.0342 0.0291 0.03165 0.093411119 2 0.2 0.0707 0.0942 0.08245 0.163143445 3 0.4 0.156 0.2664 0.2112 0.339876458 4 0.6 0.2313 0.2888 0.26005 0.406932052 5 0.8 0.259 0.3997 0.32935 0.502059025 6 1 0.4013 0.4787 0.44 0.653946465 7 1.2 0.492 0.5918 0.5419 0.793822924 8 1.4 0.5405 0.6789 0.6097 0.886890872 Hallamos primero los valores de X en las pruebas del Pruebas de laboratorio realizado cuando Y es la Absorbancia de la en el instituto de investigación de Ing. Agroindustrialmuestra problema = + 1 Tubo de ensayo Concentración (mg/L) ABS ABS Promedio de Absorbancia tendencia lineal A B X 0 0 0 0 0 0.000454442 1 0.1 0.0184 0.007400 0.0129 0.029765962 2 0.2 0.066115 0.105292 0.0857035 0.195190866 3 0.4 0.21319 0.392325 0.3027575 0.688383322 4 0.6 0.3603728 0.435806 0.3980894 0.904997501 5 0.8 0.374709 0.617767 0.496238 1.128011815 6 1 0.630903 0.711945 0.671424 1.526071347 7 1.2 0.746647 0.937192 0.8419195 1.913473074 8 1.4 0.918258 1.114000 1.016129 2.309313792
  13. 13. COMPOSICIÓN BIOQUÍMICA DE PRODUCTOS AGROINDUSTRIALES MUÑOZ ROJAS, Andrea Gisela. VEGA VIERA, Jhonas Abner. Página 13 1 0,9 y = 0,6884x - 0,0612 R² = 0,9987 0,8 0,7 0,6 LAB. JHON 0,5 IITA 0,4 Lineal (LAB. JHON) 0,3 y = 0,401x - 0,0075 R² = 0,9969 Lineal (IITA) 0,2 0,1 0 0 0,5 1 1,5 Concentracion PARA LA DETERMINACION DE AZUCARES REDUCTORES EN LA MUESTRA GRUPO I Hallamos la cantidad de azucares Reductores para cada fruta naranja piña carambola º brix 12 12.2 6 extracción de zumo (ml) 0.5 0.5 1 absorbancia JHON 0.2147 0.1396 0.2945 IITA 0.3379 0.2269 0.4785 CONCENTRACIONES LAB. JHON IITA 0,1 0,0342 0,0184 0,2 0,0707 0,0661 0,4 0,156 0,2137 0,6 0,2313 0,3604 0,8 0,3 0,48 1 0,4013 0,6309 1,2 0,492 0,7466 1,4 0,5405 0,9183
  14. 14. COMPOSICIÓN BIOQUÍMICA DE PRODUCTOS AGROINDUSTRIALES MUÑOZ ROJAS, Andrea Gisela. VEGA VIERA, Jhonas Abner. Página 14 0.5 ml (zumo) 1 ml 50 ml - Laboratorio Ing. Jhon Ecuación de la gráfica absorbancia vs [ ]: y = 0,6884x - 0,0612 NARANJA De la naranja se obtuvo una absorbancia de 0, 2147 (y= 0, 2147) Se extrajo 0.5 ml de zumo de naranja, para hacer os cálculos debemos conocer la cantidad en gramos, entonces: A esa cantidad de zumo se le aforo a 50 ml con agua destilada, hallamos nuestro factor de dilución: Factor de dilucion = 5253 5 =1 De la ecuación de la gráfica hallamos [ ], sabien que Y= 0.2147 (Absorbancia) Con los valores hallados podemos calcular el % de azúcares reductores (X) en el zumo de naranja haciendo una regla de tres simple: X=3.8% azúcares reductores
  15. 15. COMPOSICIÓN BIOQUÍMICA DE PRODUCTOS AGROINDUSTRIALES MUÑOZ ROJAS, Andrea Gisela. VEGA VIERA, Jhonas Abner. Página 15 PIÑA De la piña se obtuvo una absorbancia de 0,1396 (y= 0, 1396) Se extrajo 0.5 ml de zumo de piña, para hacer los cálculos debemos conocer la cantidad en gramos, entonces: =1 = =1 = = A esa cantidad de zumo se le aforo a 50 ml con agua destilada, hallamos nuestro factor de dilución: Factor de dilucion = 5242 5 =1 De la ecuación de la gráfica hallamos [ ], sabien que Y= 0.1396 (Absorbancia) [ ]= 1396: 612 6884 [ ]= 1 Con los valores hallados podemos calcular el % de azúcares reductores (X) en el zumo de naranja haciendo una regla de tres simple: 10.484 mg (muestra)  1 100 mg (muestra)  X X=2.78% azúcares reductores CARAMBOLA 0.5 ml (Zumo) 1 ml 50 ml
  16. 16. COMPOSICIÓN BIOQUÍMICA DE PRODUCTOS AGROINDUSTRIALES MUÑOZ ROJAS, Andrea Gisela. VEGA VIERA, Jhonas Abner. Página 16 De la carambola se obtuvo una absorbancia de 0,2945 (y= 0, 2945) Se extrajo 1 ml de zumo de carambola, para hacer los cálculos debemos conocer la cantidad en gramos, entonces: =1 = =1 1 =1 =1 A esa cantidad de zumo se le aforo a 50 ml con agua destilada, hallamos nuestro factor de dilución: Factor de dilucion =1 2 5 = De la ecuación de la gráfica hallamos [ ], sabien que Y= 0.2945 (Absorbancia) [ ]= 2945: 612 6884 [ ]= 1 Con los valores hallados podemos calcular el % de azúcares reductores (X) en el zumo de naranja haciendo una regla de tres simple: 20.4 mg (muestra)  1 100 mg (muestra)  X X=2.532% azúcares reductores 1ml (Zumo) 1 ml 50 ml
  17. 17. COMPOSICIÓN BIOQUÍMICA DE PRODUCTOS AGROINDUSTRIALES MUÑOZ ROJAS, Andrea Gisela. VEGA VIERA, Jhonas Abner. Página 17 - Instituto de investigación Tecnológico Agroindustrial - Ecuación de la gráfica absorbancia vs [ ]: y = 0,401x - 0,0075 NARANJA De la naranja se obtuvo una absorbancia de 0,3379 (y= 0, 3379) Se extrajo 0.5 ml de zumo de piña, para hacer los cálculos debemos conocer la cantidad en gramos, entonces: =1 = =1 = = A esa cantidad de zumo se le aforo a 50 ml con agua destilada, hallamos nuestro factor de dilución: Factor de dilucion = 5253 5 =1 De la ecuación de la gráfica hallamos [ ], sabien que Y= 0.1396 (Absorbancia) [ ]= 3379: 75 4 1 [ ]= 1 Con los valores hallados podemos calcular el % de azúcares reductores (X) en el zumo de naranja haciendo una regla de tres simple: 10.506 mg (muestra)  1 100 mg (muestra)  X X=8.19% azúcares reductores 0.5 ml (Zumo) 1 ml 50 ml
  18. 18. COMPOSICIÓN BIOQUÍMICA DE PRODUCTOS AGROINDUSTRIALES MUÑOZ ROJAS, Andrea Gisela. VEGA VIERA, Jhonas Abner. Página 18 PIÑA De la piña se obtuvo una absorbancia de 0,2269 (y= 0, 2269) Se extrajo 0.5 ml de zumo de piña, para hacer los cálculos debemos conocer la cantidad en gramos, entonces: =1 = =1 = = A esa cantidad de zumo se le aforo a 50 ml con agua destilada, hallamos nuestro factor de dilución: Factor de dilucion = 5242 5 =1 De la ecuación de la gráfica hallamos [ ], sabien que Y= 0.1396 (Absorbancia) [ ]= 2269: 75 4 1 [ ]= Con los valores hallados podemos calcular el % de azúcares reductores (X) en el zumo de naranja haciendo una regla de tres simple: 10.484 mg (muestra)  100 mg (muestra)  X X=5.57% azúcares reductores 0.5 ml (Zumo) 1 ml 50 ml
  19. 19. COMPOSICIÓN BIOQUÍMICA DE PRODUCTOS AGROINDUSTRIALES MUÑOZ ROJAS, Andrea Gisela. VEGA VIERA, Jhonas Abner. Página 19 CARAMBOLA De la carambola se obtuvo una absorbancia de 0,4785 (y= 0, 4785) Se extrajo 1 ml de zumo de carambola, para hacer los cálculos debemos conocer la cantidad en gramos, entonces: =1 = =1 1 =1 =1 A esa cantidad de zumo se le aforo a 50 ml con agua destilada, hallamos nuestro factor de dilución: Factor de dilucion =1 2 5 = De la ecuación de la gráfica hallamos [ ], sabien que Y= 0.4785 (Absorbancia) [ ]= 4785: 75 4 1 [ ]=1 11 Con los valores hallados podemos calcular el % de azúcares reductores (X) en el zumo de naranja haciendo una regla de tres simple: 20.4 mg (muestra)  1 11 100 mg (muestra)  X X=5.94 % azúcares reductores 1ml (Zumo) 1 ml 50 ml
  20. 20. COMPOSICIÓN BIOQUÍMICA DE PRODUCTOS AGROINDUSTRIALES MUÑOZ ROJAS, Andrea Gisela. VEGA VIERA, Jhonas Abner. Página 20 MUESTRA GRUPO I (mg/ml) JHON INSTITUTO 0.0 0.000000 0.000000 0.1 0.029100 0.007400 0.2 0.094200 0.105292 0.4 0.266400 0.392325 0.6 0.288800 0.435806 0.8 0.399700 0.617767 1.0 0.478700 0.711945 1.2 0.591800 0.937192 1.4 0.678900 1.114000 y = 0.4849x + 0.0071 R² = 0.9885 y = 0.7968x - 0.0244 R² = 0.9861 -0.200000 0.000000 0.200000 0.400000 0.600000 0.800000 1.000000 1.200000 0.0 0.5 1.0 1.5 absorbancia Concentracion Jhon IITA Lineal (Jhon) Lineal (IITA) naranja piña carambola º brix 12 12.2 6 extracción de zumo (ml) 0.5 0.5 1 absorbancia JHON 0.2147 0.1396 0.2945 IITA 0.3379 0.2269 0.4785
  21. 21. COMPOSICIÓN BIOQUÍMICA DE PRODUCTOS AGROINDUSTRIALES MUÑOZ ROJAS, Andrea Gisela. VEGA VIERA, Jhonas Abner. Página 21 0.5 ml (zumo) 1 ml 50 ml - Laboratorio Ing. Jhon Ecuación de la gráfica absorbancia vs [ ]: y = 0.4849x + 0.0071 NARANJA De la naranja se obtuvo una absorbancia de 0, 2147 (y= 0, 2147) Se extrajo 0.5 ml de zumo de naranja, para hacer os cálculos debemos conocer la cantidad en gramos, entonces: A esa cantidad de zumo se le aforo a 50 ml con agua destilada, hallamos nuestro factor de dilución: Factor de dilucion = 5253 5 =1 De la ecuación de la gráfica hallamos [ ], sabien que Y= 0.2147 (Absorbancia) [ ]= 2147: 71 4849 [ ]= Con los valores hallados podemos calcular el % de azúcares reductores (X) en el zumo de naranja haciendo una regla de tres simple: 10.506 mg (muestra)  100 mg (muestra)  X X=4.35% azúcares reductores
  22. 22. COMPOSICIÓN BIOQUÍMICA DE PRODUCTOS AGROINDUSTRIALES MUÑOZ ROJAS, Andrea Gisela. VEGA VIERA, Jhonas Abner. Página 22 PIÑA De la piña se obtuvo una absorbancia de 0,1396 (y= 0, 1396) Se extrajo 0.5 ml de zumo de piña, para hacer los cálculos debemos conocer la cantidad en gramos, entonces: =1 = =1 = = A esa cantidad de zumo se le aforo a 50 ml con agua destilada, hallamos nuestro factor de dilución: Factor de dilucion = 5242 5 =1 De la ecuación de la gráfica hallamos [ ], sabien que Y= 0.1396 (Absorbancia) [ ]= 1396: 71 4849 [ ]= Con los valores hallados podemos calcular el % de azúcares reductores (X) en el zumo de naranja haciendo una regla de tres simple: 10.484 mg (muestra)  100 mg (muestra)  X X=2.88% azúcares reductores 0.5 ml (Zumo) 1 ml 50 ml
  23. 23. COMPOSICIÓN BIOQUÍMICA DE PRODUCTOS AGROINDUSTRIALES MUÑOZ ROJAS, Andrea Gisela. VEGA VIERA, Jhonas Abner. Página 23 CARAMBOLA De la carambola se obtuvo una absorbancia de 0,2945 (y= 0, 2945) Se extrajo 1 ml de zumo de carambola, para hacer los cálculos debemos conocer la cantidad en gramos, entonces: =1 = =1 1 =1 =1 A esa cantidad de zumo se le aforo a 50 ml con agua destilada, hallamos nuestro factor de dilución: Factor de dilucion =1 2 5 = De la ecuación de la gráfica hallamos [ ], sabien que Y= 0.2945 (Absorbancia) [ ]= 2945: 71 4849 [ ]= 1 Con los valores hallados podemos calcular el % de azúcares reductores (X) en el zumo de naranja haciendo una regla de tres simple: 20.4 mg (muestra)  1 100 mg (muestra)  X X=3.04% azúcares reductores 1ml (Zumo) 1 ml 50 ml
  24. 24. COMPOSICIÓN BIOQUÍMICA DE PRODUCTOS AGROINDUSTRIALES MUÑOZ ROJAS, Andrea Gisela. VEGA VIERA, Jhonas Abner. Página 24 - Instituto de investigación Tecnológico Agroindustrial - Ecuación de la gráfica absorbancia vs [ ]: y = 0.7968x - 0.0244 NARANJA De la naranja se obtuvo una absorbancia de 0,3379 (y= 0, 3379) Se extrajo 0.5 ml de zumo de piña, para hacer los cálculos debemos conocer la cantidad en gramos, entonces: =1 = =1 = = A esa cantidad de zumo se le aforo a 50 ml con agua destilada, hallamos nuestro factor de dilución: Factor de dilucion = 5253 5 =1 De la ecuación de la gráfica hallamos [ ], sabien que Y= 0.1396 (Absorbancia) [ ]= 3379: 44 7968 [ ]= Con los valores hallados podemos calcular el % de azúcares reductores (X) en el zumo de naranja haciendo una regla de tres simple: 10.506 mg (muestra)  100 mg (muestra)  X X=4.56% azúcares reductores 0.5 ml (Zumo) 1 ml 50 ml
  25. 25. COMPOSICIÓN BIOQUÍMICA DE PRODUCTOS AGROINDUSTRIALES MUÑOZ ROJAS, Andrea Gisela. VEGA VIERA, Jhonas Abner. Página 25 PIÑA De la piña se obtuvo una absorbancia de 0,2269 (y= 0, 2269) Se extrajo 0.5 ml de zumo de piña, para hacer los cálculos debemos conocer la cantidad en gramos, entonces: =1 = =1 = = A esa cantidad de zumo se le aforo a 50 ml con agua destilada, hallamos nuestro factor de dilución: Factor de dilucion = 5242 5 =1 De la ecuación de la gráfica hallamos [ ], sabien que Y= 0.1396 (Absorbancia) [ ]= 2269: 44 7968 [ ]= Con los valores hallados podemos calcular el % de azúcares reductores (X) en el zumo de naranja haciendo una regla de tres simple: 10.484 mg (muestra)  100 mg (muestra)  X X=3.24% azúcares reductores 0.5 ml (Zumo) 1 ml 50 ml
  26. 26. COMPOSICIÓN BIOQUÍMICA DE PRODUCTOS AGROINDUSTRIALES MUÑOZ ROJAS, Andrea Gisela. VEGA VIERA, Jhonas Abner. Página 26 CARAMBOLA De la carambola se obtuvo una absorbancia de 0,4785 (y= 0, 4785) Se extrajo 1 ml de zumo de carambola, para hacer los cálculos debemos conocer la cantidad en gramos, entonces: =1 = =1 1 =1 =1 A esa cantidad de zumo se le aforo a 50 ml con agua destilada, hallamos nuestro factor de dilución: Factor de dilucion =1 2 5 = De la ecuación de la gráfica hallamos [ ], sabien que Y= 0.4785 (Absorbancia) [ ]= 4785: 44 7968 [ ]= Con los valores hallados podemos calcular el % de azúcares reductores (X) en el zumo de naranja haciendo una regla de tres simple: 20.4 mg (muestra)  100 mg (muestra)  X X=3.21 % azúcares reductores 1ml (Zumo) 1 ml 50 ml
  27. 27. COMPOSICIÓN BIOQUÍMICA DE PRODUCTOS AGROINDUSTRIALES MUÑOZ ROJAS, Andrea Gisela. VEGA VIERA, Jhonas Abner. Página 27 VI. CONCLUSIONES. Con esta práctica pudimos determinar de manera cuantitativa la concentración de azucares en determinadas muestras con concentraciones conocidas para poder obtener dos curva patrón de la absorbancia en la muestra y nuestras concentraciones u/o diluciones como ya observados en la gráfica 3, con las curvas obtenidas se realiza una gráfica de tendencia lineal que se ajusta a los datos, el R2 obtenido para la ecuación de la recta del laboratorio de instituto de investigación es 0.9944 y el laboratorio de prácticas de Ing. Agroindustrial es 0.9918. Teniendo en cuenta que el R2 es mayor a 0.95 y los datos no tienen mucha dispersión, por lo tanto son aceptables. Las pruebas de Fehling y de Benedict, por ejemplo, se basan en la capacidad de los azucares reductores de reducir los iones cúpricos (Cu2+) y aportan un ensayo sencillo para reconocer azucares que pueden existir como aldehído o cetona libre. Los azucares que reaccionan se llaman azucares reductores, que pueden unirse de forma inespecífica a otras moléculas; los que no lo hacen, azucares no reductores. El método DNS es una técnica colorimétrica que emplea 3,5-ácido dinitrosalicílico para la hidrólisis de polisacáridos presentes en una muestra, seguido de la determinación espectrofotométrica a 540nm de los azúcares reductores. Así comprobamos también que la espectrofotometría es el método de análisis óptico más adecuado para la determinación de una concentración en una muestra. Dicho de otro modo es un instrumento que permite comparar la radiación absorbida o transmitida por una solución que contiene una cantidad desconocida de soluto, y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia en este caso la glucosa. VII. DISCUSIONES. De los datos obtenidos se realizaron graficas para determinar el grado de sensibilidad de los equipos utilizados que fueron un cromatografo en el laboratorio del Ing. Jhon y otro cromatografo de (IITA) ,en aqueallas graficas se pudo observar que el cromatografo que obtuvo el grado de sensibilidad mayor fue el del IITA ya que se obtuvo una pendiente mayor.
  28. 28. COMPOSICIÓN BIOQUÍMICA DE PRODUCTOS AGROINDUSTRIALES MUÑOZ ROJAS, Andrea Gisela. VEGA VIERA, Jhonas Abner. Página 28 Las posibles razones de la diferencia en los resultados en cada cormatografo podría ser la manipulación ya que el análisis fueron realizados por la misma persona y error cometido es diferente. Otra de las razones seria al momento de preparar las disolución por un mal manejo de nosotros los prácticas, a falta de práctica en el manejo de los instrumentos. De los resultados hallados en las diferentes frutas calculamos la cantidad de azucares reductores en cada uno de ellas, en cada cromatografo, de los datos obtenidos se observó que la naranja tiene mayor cantidad de azucares reductores que la piña y carambola, su porcentaje de azucares reductores es en este orden naranja > piña> carambola; los que fueron comparados con los datos teóricos y fueron en ese mismo orden VIII. CUESTIONARIO 1. ¿Cuáles son los métodos que determinan cualitativamente los azucares reductores? Descríbelos  la reacción o prueba de Benedict identifica azúcares reductores (aquellos que tienen su OH anomérico libre), como la lactosa, la glucosa, . En soluciones alcalinas, pueden reducir el Cu2+ que tiene color azul a Cu+, que precipita de la solución alcalina como Cu2O de color rojo-naranja. El fundamento de esta reacción radica en que en un medio alcalino, el ion cúprico (otorgado por el sulfato cúprico) es capaz de reducirse por efecto del grupo Aldehído del azúcar (CHO) a su forma de Cu+. Este nuevo ion se observa como un precipitado rojo ladrillo correspondiente al óxido cuproso (Cu2O). y todo esto por que conta de Sulfato cúprico; Citrato de sodio; Carbonato anhidro de sodio.. Esta ración dio positiva para la lactosa y glucosa porque en el medio alcalino facilita que el azúcar esté de forma lineal, puesto que el azúcar en solución forma un anillo de piranósico o furanósico. Una vez que el azúcar está lineal, su grupo aldehído que tiene un oh libre que puede reaccionar con el ion cúprico en solución; en la sacarosa, no dan positivo puesto que sus OH anoméricos están siendo utilizados en el enlace glucosídico. En resumen, se habla de azúcares reductores cuando tienen su OH anomérico libre, y éstos son los que dan positivo en la prueba de Benedict.  La prueba de Barfoed sirve para distinguir monosacáridos reductores de disacáridos reductores, basándose en la velocidad de reacción; en los monosacáridos la formación del oxido cuproso es mas rápido que en los
  29. 29. COMPOSICIÓN BIOQUÍMICA DE PRODUCTOS AGROINDUSTRIALES MUÑOZ ROJAS, Andrea Gisela. VEGA VIERA, Jhonas Abner. Página 29 disacáridos. Este reactivo se compone de una solución de 0.33 molar de acetato de cobre neutro en una solución de 1% de ácido acético. En la prueba de barfoed la reacción es positiva para la galactosa y ribosa, porque al utilizar acetato cúprico y ácido acético con lo que solo los monosacáridos son capaces de reducir el cobre, formando así un precipitado rojo ladrillo, en tanto que el almidón es un disacárido que tienen menor poder de reductor al tener comprometido uno de sus carbonos anoméricos en el establecimiento del enlace glicosídico, no reaccionan y por lo tanto dan un resultado negativo.  Reacción de Seliwanoff: Los carbohidratos se clasifican como cetosas o aldosas. Vale decir, que las cetosas en el carbono 2 tienen una función cetona, que en presencia de un ácido fuerte producen rápidamente derivados furfúricos que reaccionan con un difenol llamado resorcina que está contenido en el reactivo de Seliwanoff. La fluctos da positiva porque pertenece al grupo cetona y como Esta prueba es específica para cetosas y se basa en la conversión de la cetosa en 5-hidro- metil-furfural y su posterior condensación con resorcinol formando así complejos coloreados rojo o rosado. La razón por que dio negativo en la glucosa es sencillo porque esta pertenece al grupo aldehído como ya aviamos mencionado anterior mente y de esta forma no puede reaccionar con esta reacción.  Reacción de molish: En la reacción de Molish, el agregado de ácido sulfúrico concentrado a a la leche provoca la deshidratación del glúcido en la interfase, para dar un anillo de furfural o hidroximetilfurfural que reacciona con alfa-naftol, para dar un producto de color púrpura. La presencia de carbohidratos en nuestra muestra se pone de manifiesto por la reacción de Molisch, Basada en la acción hidrolizante y deshidratante del ácido sulfúrico sobre los hidratos de carbono. En dicha reacción el ácido sulfúrico cataliza la hidrólisis de los enlaces glucosídicos de la muestra y la deshidratación a furfural (en las pentosas) o hidroximetilfurfural (en las hexosas). Estos furfurales se condensan con el alfa naftol del reactivo de Molisch (reacción de Molisch) dando un producto coloreado.  Prueba de Bial es una prueba química para la presencia de pentosas. Los componentes incluyen orcinol, ácido hidroclórico, y cloruro férrico. Que En presencia de una pentosa, el pentosoma será deshidratado para formar furfural. La solución dará muestra azulada. 2. Explique porque la sacarosa y el almidón no son reductores. La sacarosa: no presentapoderreductorporque la uniónglucosídica se estableceentre el carbono 1 de la glucosa y el carbono 2 de la fructosa, con lo cual se estabilizan las estructuras cíclicas, pues se constituye un acetal y no queda ningún hemiacetal capaz de darunacadenaabiertaporhidrólisis.
  30. 30. COMPOSICIÓN BIOQUÍMICA DE PRODUCTOS AGROINDUSTRIALES MUÑOZ ROJAS, Andrea Gisela. VEGA VIERA, Jhonas Abner. Página 30 El almidón: se considera un azúcar no reductor porque a pesar de que tiene carbonos anoméricos libres capaces de oxidarse, hay muy pocos en comparación a la cantidad de unidades de monosacáridos que componen el almidón. Es decir, solo los de los extremos de la larga cadena que compone al almidón, puede oxidarse y calculando que una cadena de almidón (que a su vez tiene ramificaciones) tiene más de 10000 residuos de monosacáridos, entonces se concluye que si bien el almidón puede oxidarse, su poder de reductor es prácticamente nulo debido al muy bajo rendimiento y que la cantidad de carbonos libres son muypocos, conociéndoseestocomo un azúcar no reductor. 3. ¿Qué función cumple el blanco en la medición de la absorbancia? Todo método espectrofotométrico se basa en la comparación de la absorbancia de una sustancia de concentración desconocida con la de una solución de la misma sustancia cuya concentración se conoce y a la cual se denomina solución patrón o estándar. La absorbancia de una solución es la resultante de la absorbancia del soluto cuya concentración se desea conocer y la de otros componentes del sistema (solventes, reactivos) que absorben también a esa longitud de onda. Estos compuestos se denominan interferencias. Se debe descartar la absorbancia de las interferencias, para ello es necesario hacer siempre una muestra que contenga todos los componentes del sistema menos aquel que se desea medir. Esta muestra se llama blanco y la absorbancia de éste debe restarse a las muestras problema y a los patrones, o bien, con el blanco se calibra el instrumento a absorbancia igual a 0, o sea 100% de transmisión. 4. Diferencie entre patrón interno y patrón externo El método del estándar externo, consiste en inyectar en el equipo volúmenes constantes de disoluciones de concentraciones conocidas y crecientes del compuesto que se pretende cuantificar; tras este proceso, se representa la cantidad de compuesto frente al tamaño del pico (área o altura), debiéndose obtener una linea recta. A partir de esta recta de calibrado, es posible realizar la cuantificación en una muestra desconocida, por interpolación gráfica o matemática del pico obtenido en la recta de calibrado. El principal problema que plantea la calibración por medio de este método es la reproducibilidad de la inyección, o bien el control estricto de las cantidades inyectadas, aunque tomando las debidas precauciones, la exactitud alcanzada puede ser notablemente alta. Por otra parte, la calibración debe repetirse periódicamente para
  31. 31. COMPOSICIÓN BIOQUÍMICA DE PRODUCTOS AGROINDUSTRIALES MUÑOZ ROJAS, Andrea Gisela. VEGA VIERA, Jhonas Abner. Página 31 verificar la fiabilidad de la cuantificación, lo que en algunos casos puede hacer que este método sea un poco tedioso. El método de estándar interno, se utiliza con frecuencia en el análisis cuantitativo para compensar posibles errores derivados de la manipulación de la muestra. Este método consiste en esencia en añadir una cantidad conocida de un compuesto patrón a la muestra a analizar antes de realizar con ella cualquier manipulación; en el cromatograma, aparecerán los picos correspondientes al analito y al patrón añadido, y de la relación entre el tamaño de ambos, podrá calcularse, previo calibrado, la cantidad de analito existente en la muestra. Para efectuar el calibrado en este método, se preparan disoluciones de concentración creciente del compuesto a analizar a las que se añade una cantidad idéntica en todos los casos del compuesto patrón; tras obtener los correspondientes cromatogramas, se representa la concentración del compuesto a cuantificar en función de la relación de los picos problema/patrón, con lo que se obtendrá una recta en la que es posible interpolar la relación entre los dos picos que se obtenga al realizar el cromatograma de una muestra desconocida. IX. BIBLIOGRAFIA  Frank Bradleey Armstrong, Thomas Peter Bennett BIOQUIMICA (1982) pag.163-165.  http://es.scribd.com/doc/51664602/En-el-laboratorio-de-pruebas-cualitativas- para- carbohidrato-podemos-analizar-barios-cosas  http://webcache.googleusercontent.com/search?q=cache:Xik40D7C3DoJ:www.cursos. ucv.cl/qui34302/X- Laboratorios/Laboratorio1REVGuia03.doc+&cd=5&hl=es&ct=clnk&gl=pe  http://es.scribd.com/doc/51664602/En-el-laboratorio-de-pruebas-cualitativas- para- carbohidrato-podemos-analizar-barios-cosas#  http://es.scribd.com/doc/47427482/cromatografia#logout

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