Rippei Hayashi, Nono Takeuchi and Takuya Ueda
POR:
Sara Manuela Ocampo Ramírez
Paola Andrea Parra Estrada
NLS
Nuclear Location Signal
Specific aminoacidic sequences
Nucleus Cytoplasm
Nuclear pore 1. Carrrier prontein
2. Cytoplas...
IMPORTIN
Receptor and carrier proteins
Has two subunits
Importin- α Importin-β
Lewin´s cell
NRF- 2
GA-binding protein / E4
Transciption factor 1
Multimeric transcsiption factor
NRF-2α NRF-2β
NRF- 2
FUNCTION:
Regulates lineage-specific genes,
cytosolic ribosomal proteins, genes that
control cellular growth, regul...
Cultivo de células y transfección
Resultado del
crecimiento in vitro
de células obtenidas
de organismos
multicelulares
Res...
Construcciones de un plásmido
Formación de un DNA
extracromosómico
independiente al DNA
cromosómico
Formación de un DNA
ex...
Inmunofluorescencia
Reacción antígeno-anticuerpo hecha
visible por la incorporación de un
colorante fluorescente al anticu...
Proteínas recombinantes
Proteínas producidas en el
laboratorio mediante ingeniería
genética en células distintas a las
que...
Ensayos in vitro de importación
nuclear
Técnica para realizar un
determinado experimento
en un tubo de ensayo, o
generalme...
Ensayos de unión de proteínas
Técnica usada para detectar interacción
entre dos proteínas.
Activa un gen reportero o un fa...
TÉCNICAS DE SEPARACIÓN DE MOLÉCULAS SEGÚN LA MOVILIDAD DE ÉSTAS
La separación puede realizarse
• En papel o en acetato de ...
Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas
Técnica de inmunoensayo de tipo heterogénea en la cual un antígeno inmovilizad...
Tipo sándwichTipo sándwich
Tipo indirectoTipo indirecto
Tipo competitivoTipo competitivo
La importina-La importina-αα::ββ mediamedia
la importación nuclearla importación nuclear
del complejo NRF-2del complejo NR...
Importada al núcleo de
manera eficiente.
Esto no facilitó significativamente la
importación nuclear
Se formó un heterodímero
Se requieren para importación
nuclear
Dependían de esto para la importación
nuclear, al igual que la importación del
complejo NRF-2α-GFP:NRF-2β
NRF-2β media
imp...
Ran Q69L
Forma mutante de Ran GTPasa
Disocia moléculas de carga de la importina-
β-relacionada, por lo que estas median la...
IdentificaciónIdentificación
del NLSs deldel NLSs del
NRF-2NRF-2αα y ely el
NRF-2NRF-2 ββ
NRF-2α que normalmente es
dependiente del NRF-2 β, in vivo fue
localizada en el núcleo estando sola.
Lo anterior gracias a la mutante NRF-2 α Y409E,
que no se une al NRF-2 β, todavía se puede mover
en el núcleo.
Inhibe la localización nucleas de NRF-2 α, lo que apoya la
idea de que esta va al núcleo a través del dominio Ets.
La deleción del aminoácido 310, causó un aumento
sorprendente en la localización citosólica
Se hizo localizar en el
núcleo. Esenciales para la
función de la NLS
Representantes de cada subtipo de importina-αLa importina-β y Ran no
pueden activar la
importación nuclear en
ausencia de ...
Los carriles 1 y 4 A y el carril 1y2 B
indican que la NRF-2α y la NRF-2β se
unen a Rch-1: importinaβ facilitando
su import...
Observación de la importación nuclear de NRF-2α y NRF-2β utilizando
proteínas mutantes incapaces de unir Rch1-importina β....
RELACION DE LA IMPORTACION
ENTRE EL NUCLEO Y EL CITOPLASMA
1 2 3 4
1. Interacción entre Rch1 y
NRF-2B no se unen por si
solas.
2. Utilización de Rch1 con IBB
murado tiene mas afinid...
•Do HJ, Song H, Yang HM,
Kim DK, Kim NH, Kim JH, et
al. Hu W, Philips AS, Kwok
JC, Eisbacher M, Chong BH
Its appeared that...
Learned to develop ourselves with article both in
English and in Spanish language.
Learned to relate what we saw in clas...
NFR-2
NRF-2α NRF-2β
ADN Dominio de
ACT.
Dominio
ETs NLSIMPORTINA α β
núcleoTransporta complejo proteína
Subunidad β Subuni...
•GONZÁLEZ RABANAL, José Manuel; CALVO PRIETO, Jesús; BARROS
PUGA, Marta. Gestión de la función administrativa del servicio...
Seminario biomolecular corregido
Seminario biomolecular corregido
Seminario biomolecular corregido
Seminario biomolecular corregido
Seminario biomolecular corregido
Seminario biomolecular corregido
Seminario biomolecular corregido
Seminario biomolecular corregido
Seminario biomolecular corregido
Seminario biomolecular corregido
Upcoming SlideShare
Loading in …5
×

Seminario biomolecular corregido

137 views

Published on

0 Comments
0 Likes
Statistics
Notes
  • Be the first to comment

  • Be the first to like this

No Downloads
Views
Total views
137
On SlideShare
0
From Embeds
0
Number of Embeds
2
Actions
Shares
0
Downloads
2
Comments
0
Likes
0
Embeds 0
No embeds

No notes for slide
  • T he NLS is a specific sequence of amino acids that recognizes cytoplasmic proteins that are to be imported into the nucleus. This is also known as nuclear localization signal. these were discovered through the analysis of virus 40 (SV40) of the Apes, which produced an abnormal form of the viral protein antigen called T.
  • The importin is a heterodimer that recognizes a cytoplasmic proteins labeled with the NLS are intended to nucleus. This has two subunits: A. sticking to the NLS present in cytoplasmic proteins; leads the B subunit by the nuclear pore and there facilitates translocation to the nucleus where it binds to a protein Ran in a GTP-bound form which binds this subunits
  • Cultivo de células: Para qué ? permiten el estudio de las propias células, su metabolismo, el control del ciclo celular, la modulación de la expresión génica, el cultivo de virus, la clonación y el estudio de numerosos aspectos relacionados con el cáncer y su diagnóstico. Transfección: Para qué? Estos métodos h an permitido en gran medida ampliar los conocimientos acerca de la regulación génica y de la función de las proteínas en los sistemas celulares. Actualmente se emplean en gran número de aproximaciones experimentales, en la generación de animales transgénicos, en la selección de líneas celulares modificadas, etc.
  • Para qué?  sirven como una importante herramienta en laboratorios de genética e ingeniería bioquímica, donde son comúnmente usados para multiplicar o como genes particulares expresos. Otro uso importante de los plásmidos es fabricar grandes cantidades de proteínas.
  • IF directa: Colorea el antígeno IF indirecta: Colorea el anticuerpo Para qué? El uso de esto permite el diagnóstico de algunas enfermedades autoinmunes como el VIH (IF indirecta), Lopus eritematoso (IF directa) Libro de Biología pag 151
  • Para qué? Permiten: • Obtención de grandes cantidades del producto, de una forma más fácil y reproducible, en comparación con el obtenido por extracción a partir de su fuente natural. • Obtención de productos libres de patógenos y otros riesgos potenciales. Esto es particularmente importante en el caso de los productos farmacéuticos. Por ejemplo, los factores de coagulación o la hormona de crecimiento pueden administrarse libres de contaminación como proteínas recombinantes, en lugar de proteínas purificadas de sangre e hipófisis humanas, respectivamente. • Pueden producirse proteínas que no existen en la naturaleza, como los anticuerpos de cadena simple, útiles en el diagnóstico y tratamiento de algunas enfermedades.
  • Para qué? Para mediar el trabajo de importación e inhibir algunas otras vías de importación nuclear, que pudieran alterar el proceso.
  • El principio de la técnica es el siguiente, el factor de transcripción es separado en dos fragmentos, uno que reconoce UAS y el otro que promueve la activación de la maquinaria de transcripción. Cada fragmento es fusionado a una de las proteínas cuya interacción se desea analizar, usando técnicas de  ingeniería genética . Si las proteínas forman un complejo entre sí, los dos fragmentos del factor de transcripción se encontrarán y el gen reportero será transcrito. UPSTREAM : Río arriba
  • Se usa comúnmente para DNA recombinante ya que permite diferenciar la carga de los polipéptidos, habitualmente se usa un soporte de gel compuesto de agarosa o de poliacrilamida. En las partículas de DNA los ácidos nucleicos están cargados negativamente por los grupos fosfato mientras que las proteínas se cargan Negativamente cuando entran en contacto con detergentes como el SDS.
  • Se realiza mirando las variables, tales como selección de reactivo, temperatura, medición de volumen y tiempo. se usa en muchos laboratorios para determinar si un anticuerpo particular está presente en una muestra de sangre.
  • Se realiza uniendo un primer Ac a una fase solida, el Ag reacciona con el, se lava para eliminar sustancias no unidas y hace reaccionar con otro Ac dirigido por otros determinantes antigenicos. El segundo Ac esta marcado por una enzima, tras otro proceso de lavado se revela su ensayo, siendo proporcional al producto formado a la cantidad de Ag presente en la muestra.
  • Se realiza fijando Ag a la fase solida, se hace reaccionar con la muestra donde este el Ac, tras el lavado se añade Ig antiglobulina humana ( anticuerpo) marcada con enzima. Se vuelve a lavar y se revela. La cantidada de producto formado es directamente proporcional a la cantidad de Ac presente en la muestra.
  • Se realiza para medir el antígeno. La muestra se hace competir con Ag marcado frente a un Ac. Se lava para eliminar el componente que ha quedado libre y se revela. la cantidad de producto formado es inverasamente proporcional a la Ag de la muestra.
  • Todo esto sugiere que la importación nuclear del complejo NRF-2 αβ está mediada por importina- β o importina- α , pero no por otras porteínas importina- β -relacionadas
  • Todo esto sugiere que la importación nuclear del complejo NRF-2 αβ está mediada por importina- β o importina- α , pero no por otras porteínas importina- β -relacionadas
  • Todo esto sugiere que la importación nuclear del complejo NRF-2 αβ está mediada por importina- β o importina- α , pero no por otras porteínas importina- β -relacionadas
  • Todo esto sugiere que la importación nuclear del complejo NRF-2 αβ está mediada por importina- β o importina- α , pero no por otras porteínas importina- β -relacionadas
  • Todo esto sugiere que la importación nuclear del complejo NRF-2 αβ está mediada por importina- β o importina- α , pero no por otras porteínas importina- β -relacionadas
  • Todo esto sugiere que la importación nuclear del complejo NRF-2 αβ está mediada por importina- β o importina- α , pero no por otras porteínas importina- β -relacionadas
  • Todo esto sugiere que la importación nuclear del complejo NRF-2 αβ está mediada por importina- β o importina- α , pero no por otras porteínas importina- β -relacionadas
  • Seminario biomolecular corregido

    1. 1. Rippei Hayashi, Nono Takeuchi and Takuya Ueda POR: Sara Manuela Ocampo Ramírez Paola Andrea Parra Estrada
    2. 2. NLS Nuclear Location Signal Specific aminoacidic sequences Nucleus Cytoplasm Nuclear pore 1. Carrrier prontein 2. Cytoplasmatic protein 3. NLS 4. Nuclear protein 1 2 3 44
    3. 3. IMPORTIN Receptor and carrier proteins Has two subunits Importin- α Importin-β
    4. 4. Lewin´s cell
    5. 5. NRF- 2 GA-binding protein / E4 Transciption factor 1 Multimeric transcsiption factor NRF-2α NRF-2β
    6. 6. NRF- 2 FUNCTION: Regulates lineage-specific genes, cytosolic ribosomal proteins, genes that control cellular growth, regulates the entire antioxidant system and mitochondria-related genes. ACTIVATION: Regulated by nuclear transport upon neural activation. FUNCTION: Regulates lineage-specific genes, cytosolic ribosomal proteins, genes that control cellular growth, regulates the entire antioxidant system and mitochondria-related genes. ACTIVATION: Regulated by nuclear transport upon neural activation.
    7. 7. Cultivo de células y transfección Resultado del crecimiento in vitro de células obtenidas de organismos multicelulares Resultado del crecimiento in vitro de células obtenidas de organismos multicelulares Introducción de DNA externo con un vector de expresión. Introducción de DNA externo con un vector de expresión.
    8. 8. Construcciones de un plásmido Formación de un DNA extracromosómico independiente al DNA cromosómico Formación de un DNA extracromosómico independiente al DNA cromosómico Fuente: google images
    9. 9. Inmunofluorescencia Reacción antígeno-anticuerpo hecha visible por la incorporación de un colorante fluorescente al anticuerpo. Exposición a luz ultravioleta. Reacción antígeno-anticuerpo hecha visible por la incorporación de un colorante fluorescente al anticuerpo. Exposición a luz ultravioleta. Técnica de anticuerpos fluorescentes
    10. 10. Proteínas recombinantes Proteínas producidas en el laboratorio mediante ingeniería genética en células distintas a las que se producen en la naturaleza. Proteínas producidas en el laboratorio mediante ingeniería genética en células distintas a las que se producen en la naturaleza.
    11. 11. Ensayos in vitro de importación nuclear Técnica para realizar un determinado experimento en un tubo de ensayo, o generalmente en un ambiente controlado fuera de un organismo vivo. Técnica para realizar un determinado experimento en un tubo de ensayo, o generalmente en un ambiente controlado fuera de un organismo vivo.
    12. 12. Ensayos de unión de proteínas Técnica usada para detectar interacción entre dos proteínas. Activa un gen reportero o un factor de transcripción sobre la secuencia regulatoria UAS (Upstream activating sequence), localizada al inicio del promotor. Técnica usada para detectar interacción entre dos proteínas. Activa un gen reportero o un factor de transcripción sobre la secuencia regulatoria UAS (Upstream activating sequence), localizada al inicio del promotor.
    13. 13. TÉCNICAS DE SEPARACIÓN DE MOLÉCULAS SEGÚN LA MOVILIDAD DE ÉSTAS La separación puede realizarse • En papel o en acetato de celulosa • Matriz porosa: gel • Disolución: libre La separación obedece a la carga eléctrica y masa. La separación obedece a la carga eléctrica y masa.
    14. 14. Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas Técnica de inmunoensayo de tipo heterogénea en la cual un antígeno inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable como cambio de color o algún otro tipo
    15. 15. Tipo sándwichTipo sándwich
    16. 16. Tipo indirectoTipo indirecto
    17. 17. Tipo competitivoTipo competitivo
    18. 18. La importina-La importina-αα::ββ mediamedia la importación nuclearla importación nuclear del complejo NRF-2del complejo NRF-2αβαβ NúcleoNúcleo NRF-2α NRF-2α NRF-2β NRF-2β recluta a la NRF-2α. Dominios Ets pueden dirigir la NRF-2α al núcleo. Hipótesis: Transporte de NRF-2 mediada por dominios Ets de NRF-2α y eficiencia aumentada por unión al NRF-2β
    19. 19. Importada al núcleo de manera eficiente. Esto no facilitó significativamente la importación nuclear
    20. 20. Se formó un heterodímero Se requieren para importación nuclear
    21. 21. Dependían de esto para la importación nuclear, al igual que la importación del complejo NRF-2α-GFP:NRF-2β NRF-2β media importación nuclear de complejos NRF-2αβ
    22. 22. Ran Q69L Forma mutante de Ran GTPasa Disocia moléculas de carga de la importina- β-relacionada, por lo que estas median la importación nuclear. Rch1-IBB Rch1-IBB y una importina-α, se unen y enmascaran la importina-β. El dominio Rch1-IBB inhibió la importación del complejo nuclear.
    23. 23. IdentificaciónIdentificación del NLSs deldel NLSs del NRF-2NRF-2αα y ely el NRF-2NRF-2 ββ
    24. 24. NRF-2α que normalmente es dependiente del NRF-2 β, in vivo fue localizada en el núcleo estando sola.
    25. 25. Lo anterior gracias a la mutante NRF-2 α Y409E, que no se une al NRF-2 β, todavía se puede mover en el núcleo.
    26. 26. Inhibe la localización nucleas de NRF-2 α, lo que apoya la idea de que esta va al núcleo a través del dominio Ets.
    27. 27. La deleción del aminoácido 310, causó un aumento sorprendente en la localización citosólica
    28. 28. Se hizo localizar en el núcleo. Esenciales para la función de la NLS
    29. 29. Representantes de cada subtipo de importina-αLa importina-β y Ran no pueden activar la importación nuclear en ausencia de la importina-α. Rch1, NPI-1, Qip1 activan la de NRF-2α-GFP:NRF-2β. El complejo importina-α:β media importación nuclear de la NRF-2αβ
    30. 30. Los carriles 1 y 4 A y el carril 1y2 B indican que la NRF-2α y la NRF-2β se unen a Rch-1: importinaβ facilitando su importación nuclear respectivamente. Los carriles 6 A y el carril 4 B indican que hay mutaciones en la importación nuclear de NRF-2α y la NRF-2β si se utiliza una variedad de tipo salvaje.
    31. 31. Observación de la importación nuclear de NRF-2α y NRF-2β utilizando proteínas mutantes incapaces de unir Rch1-importina β. Las mutaciones no inhibieron las interacciones del complejo NRF-2αβ.
    32. 32. RELACION DE LA IMPORTACION ENTRE EL NUCLEO Y EL CITOPLASMA
    33. 33. 1 2 3 4 1. Interacción entre Rch1 y NRF-2B no se unen por si solas. 2. Utilización de Rch1 con IBB murado tiene mas afinidad por NRF-2B. 3. Utilización de Rch1 con una residuo mutado inhibe la unión del NRF-2B. 4. Unión eficiente entre Rch1 completo y NRF-2
    34. 34. •Do HJ, Song H, Yang HM, Kim DK, Kim NH, Kim JH, et al. Hu W, Philips AS, Kwok JC, Eisbacher M, Chong BH Its appeared that the nuclear import of NRF-2α alone is not an efficient event in vivo as compared to that of the NRF-2αβ complex. It is unlikely that the residual of NRF-2α inhibits nuclear import, the deletion had no effect on its subcellular localization. Therefore, it is probable that the nuclear-localization capability of the NRF-2α Ets is not as strong as the NLS of NRF-2β. •Desagree
    35. 35. Learned to develop ourselves with article both in English and in Spanish language. Learned to relate what we saw in class what we learned in Article. We put into practice the knowledge learned about reading the electrophoresis. Learned the importance of being specific and clear in the study of items.
    36. 36. NFR-2 NRF-2α NRF-2β ADN Dominio de ACT. Dominio ETs NLSIMPORTINA α β núcleoTransporta complejo proteína Subunidad β Subunidad α Prot. citosólicas Genes ribosómicos celular
    37. 37. •GONZÁLEZ RABANAL, José Manuel; CALVO PRIETO, Jesús; BARROS PUGA, Marta. Gestión de la función administrativa del servicio Gallego de salud. Vol 3. Editorial Mad, S.L. 2006. Pag 364. •GÓMEZ, Susana; GUTIERREZ, Maria Fernanda. La inmunología en el diagnóstico clínico. Primera edición. Centro editorial Javeriano. 1994. Pag 76. •MARTINEZ SÁNCHEZ, Lina María. Biología molecular. 2. ed. Medellín: UPB. Fac. de Medicina, 2006. Pag 121-127; 148-155.

    ×