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Muestra Lavada <br />Páramo Parque Nacional Podocarpus<br />Muestra Secada <br />Diseño de Parcela<br />
Extracción de ADNn: “Stool mini kit de Qiagen”.<br />Amplificación de ADNn:“Multiplex PCR kit de Qiagen”.<br /> BOX       ...
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DISENO EXPERIMENTAL:1. Experimento de exposición al ambiente.<br />
2.Experimento de Conservación:<br />
RESULTADOS Y DISCUSIONES:<br />EOH-H<br />EOH-H<br />EOH-C<br />EOH-C<br />BUFER<br />BUFER<br />
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Visualización del patrón de bandas y correspondencia genotípica:<br />MJ<br />Genotipo del  Oso Macho (Augusto)<br />G10H ...
Experimento de Exposición al ambiente:<br />ANOVA:<br />Prueba TUKEY:<br />
Experimento de Conservación:<br />ANOVA:<br />Prueba TUKEY:<br />
<ul><li>Chi-cuadrado:</li></li></ul><li>      CONCLUSIONES y RECOMENDACIONES:<br />Muestras frescas,        errores:   <br...
<ul><li>Recolección muestras: aspecto físico  </li></ul>                                        (compactado).<br />Conserv...
GRACIAS<br />
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Optimización de los Métodos de Recolección, Conservación y Extracción de DNA Nuclear a partir de Muestras de Excremento de Oso de Anteojos (Tremarctos ornatus)”

  1. 1. UNIVERSIDAD TÉCNICA PARTICULAR DE LOJA<br />La Universidad Católica de Loja<br />“Optimización de los Métodos de Recolección, Conservación y Extracción de ADN Nuclear a partir de Muestras de Excremento de Oso de Anteojos (Tremarctosornatus)”<br />Autora:<br />Antonia Germania Jiménez Coronel.<br />Director:<br />Blgo. Rodrigo Cisneros Vidal.<br />Centro de Biología Celular y Molecular<br />
  2. 2. INTRODUCCIÓN:<br />El muestreo genético no invasivo. <br /> Poblaciones silvestres amenazadas. <br /> Peligro de extinción (Bosch et al., 2005).<br />El análisis molecular mala y poca calidad de ADNn, el mismo que es difícil de amplificar (Nsubugaet al., 2004). <br /> 1g de heces puede tener grandes cantidades de ADN<br />(Wasseret al., 1997).<br />
  3. 3. JUSTIFICACIÓN:<br />Proyecto de investigación a largo plazo.<br />Estudio: diversidad y estructura genética. <br />Resultados: protocolos óptimos <br /> Optimizar recursos.<br />Estudio y conservación de esta y otras especies neotropicales en peligro de extinción.<br />Colección<br />y<br />Extracción<br />ADN<br />Campo<br />Laboratorio<br />
  4. 4. MUESTREO NO INVASIVO DE ESPECIES ANIMALES SALVAJES.<br />Pelos. <br />Heces <br />Orina. <br />Plumas.<br /> % Amplificación.<br />Contaminación frecuente. <br /> % Errores de genotipado con microsatélites <br /> (Taberlet et al., 1996, 1997 y 1999; Goossens et al., 1998 y Piggottet al., 2004).<br /> Conservación y manejo de especies en peligro de extinción <br /> (Piggott y Taylor, 2003). <br />Detección y recuento de especies raras y amenazadas <br /> (Paetkau 2003 y Waits 2004). <br />La identificación : especies. <br /> género.<br /> individual (Waits and Paetkau 2005).<br />Manipulación<br />Captura<br />Observación<br />Rara<br />Difícil procedencia<br />
  5. 5. EXTRACCIÓN DE ADN:<br />Extracción de ADN de pelo: raíz (células del folículo).<br /> trampas (pelo fresco)<br />Extracción de ADN de heces: (estudio de mamíferos salvajes) células epiteliales descamadas del lumen del intestino. <br /> Microorganismos<br /> Restos de comida no digeridos<br /> Enzimas digestivas<br /> Moco<br /> Sales biliares <br /> Bilirrubina<br /> Polisacáridos de plantas<br />  Escaso y degradado <br /> <br />
  6. 6. FACTORES LIMITANTES DEL ÉXITO EN ESTUDIOS CON ADNn OBTENIDO DE MUESTRAS FECALES. <br />La utilidad del ADN fecal depende: <br /> <br />(a) Longitud/número de copias ADN extraer y amplificar.<br />(b) Confirmación ADN amplificado obtenido. <br />(c) Eliminación de los contaminantes.<br />(d) Degradación de la muestra: laboratorio - campo.<br />(e) Remoción de inhibidores dieta.<br />Cantidad.<br /> Calidad. <br />Tiempo<br />Condiciones ambientales<br />Dieta<br /> Método: Preservación<br />Extracción<br />
  7. 7. Degradación de ADN:<br />Lesiones en el ADN:<br />Pérdida <br />Alteración <br />Rotura de hebras.<br />Pirimidinas ligadas.<br />Fragmentos de desoxirribosa.<br />Cruzamiento de hebras.<br />Radicales de O2.<br />Desnaturalización.<br />Deleciones.<br />Inserciones.<br />bases<br />Humedad<br />Oxidación<br />pH<br />P mecánica<br />Tº<br />Contaminantes<br />Hidrólisis<br />
  8. 8. Errores comunes en el genotipado con ADN obtenido de muestras fecales:<br />Alelo: <br />Marginado Falso<br /> Múltiple<br /> Fuente: (Waits y Paetkau, 2005).<br /> <br />
  9. 9. MARCADORES MOLECULARES (Microsatélites) Y SU UTILIDAD EN GENÉTICA POBLACIONAL.<br /> º Polimorfismo.<br />Herencia: mendeliana simple.<br />Codominantes (heterocigotos /homocigotos).<br />Fáciles de medir y analizar.<br />Confiabilidad: 100%.<br />Repetitivos y automatizables.<br />Regiones no codificantes uniformemente.<br />Presencia de muchos alelos. Patrón de mutación.<br />Poder discriminatorio entre individuos. Alelos nulos.<br />Análisis de parentesco. Homoplasia.<br />+<br />-<br />
  10. 10. OBJETIVOS:<br />GENERAL:<br />Optimizar la concentración de ADNn extraído de las muestras de excremento de oso andino (Tremarctosornatus).<br /> <br />ESPECÍFICOS:<br />Determinar la influencia del tiempo de recolección de las muestras en la concentración de ADNn.<br />Establecer la eficacia de los métodos de conservación de ADNn de excremento de oso andino.<br />Validar y mejorar los métodos convencionales de extracción de ADNn de excremento de oso andino. <br />Verificar de forma cualitativa la concentración de ADNn de oso de anteojos a partir de muestras con productos amplificados.<br /> <br />
  11. 11. METODOLOGÍA:<br />Recolección Muestras: 10ml<br />3 tratamientos conservación/pre-extracción:<br />EOH-C (4:1) 5 000 rpm x 30 min.<br />EOH-H (4:1) 200 ul <br />Buffer DETs-H(4:1) <br /> Experimento de Experimento de<br />Exposición al Ambiente: Conservación: <br /> EOH-H<br /> EOH-C<br />DETs-H<br />Etanol<br />99,9%<br />Buffer DETs<br />7 Repeticiones<br />1 Semana<br />D 0<br />Tº ambiente<br />1 Mes<br />D 7<br />2 Meses<br />D 14<br />D 21<br />
  12. 12. Muestra Lavada <br />Páramo Parque Nacional Podocarpus<br />Muestra Secada <br />Diseño de Parcela<br />
  13. 13. Extracción de ADNn: “Stool mini kit de Qiagen”.<br />Amplificación de ADNn:“Multiplex PCR kit de Qiagen”.<br /> BOX MJ<br /> BOX MJ<br />G1OB <br />G10O<br /> G10X <br />Mu23 <br /> Mu50<br />G10M<br />G1OJ G10P<br />G10H CXX20<br />
  14. 14. <ul><li>Cuantificación de ADNn: Geles de Agarosa 1,5% con Tinción de BrEt.</li></ul>120 V<br /> 300 mA<br />2 horas<br />TBE 1X<br />Gel Eval 1.22 <br />
  15. 15. DISENO EXPERIMENTAL:1. Experimento de exposición al ambiente.<br />
  16. 16. 2.Experimento de Conservación:<br />
  17. 17. RESULTADOS Y DISCUSIONES:<br />EOH-H<br />EOH-H<br />EOH-C<br />EOH-C<br />BUFER<br />BUFER<br />
  18. 18. EOH-H<br />EOH-C<br />BUFER<br />EOH-H<br />EOH-C<br />BUFER<br />
  19. 19. Visualización del patrón de bandas y correspondencia genotípica:<br />MJ<br />Genotipo del Oso Macho (Augusto)<br />G10H (235/235)<br /> G10M (219/219)<br /> G10P (148/148)<br />CXX20 (132/132)<br /> G10J (100/100)<br />BOX<br />Genotipo del Oso Hembra (Nacha)<br />G10O (179/179) <br /> G10B (157/157)<br /> Mu23 (111/113)<br /> Mu50 (105/109)<br />
  20. 20. Experimento de Exposición al ambiente:<br />ANOVA:<br />Prueba TUKEY:<br />
  21. 21. Experimento de Conservación:<br />ANOVA:<br />Prueba TUKEY:<br />
  22. 22. <ul><li>Chi-cuadrado:</li></li></ul><li> CONCLUSIONES y RECOMENDACIONES:<br />Muestras frescas, errores: <br /> amplificación/ genotipificación.<br />Muestras secadas o el viento células epiteliales. <br />Lluvia degradación: hongos / bacterias.<br />
  23. 23. <ul><li>Recolección muestras: aspecto físico </li></ul> (compactado).<br />Conservar etanol pre-extracción centrifugado.<br />Recolectada y conservada -20ºC.<br />Análisis BOX PCR.<br />Análisis de secuenciación: genotipificación. <br /> precisión. <br /> errores.<br />CV<br />CV<br />CV<br />CV<br />
  24. 24. GRACIAS<br />

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