Curso de Genómica - UAT (VHIR) 2012 - Microarrays

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Curso de Genómica - UAT (VHIR) 2012 - Microarrays

  1. 1. Institut de RecercaHospital Universitari Vall d’HebronInstitut d’Investigació Sanitària de l’Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) Tecnologies d’alt rendiment a l’ucts. Conceptes i anàlisi de dades 28/11/12 – 05/12/12 Ricardo Gonzalo Sanz
  2. 2. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN la ucts.conceptos y análisis de datosDIA 1. 28 de Noviembre. 10-14:00 Microarrays. Ricardo Gonzalo Sanz Analisis de resultados de microarrays. Alex Sanchez RTqPCR. Paqui Gallego Análisis de resultados de RTqPCR. Jose Luis MosqueraDIA 2. 5 de Diciembre. 10-14:00 Ultrasecuenciación. Paqui Gallego y Rosa Prieto Analisis de resultados de Ultrasecuenciación. Alex Sanchez Zeptosens. Paqui Gallego Análisis de resultados de Zeptosens. Ferran BriansóHoja de asistencia. Certificado asistenciaEncuesta satisfacción.
  3. 3. EsquemaARRAYS AFFYMETRIX•Tipos•¿cómo están hechos?MATERIAL DE PARTIDA: RNA•Calidad (Bioanalyzer/RIN)•Cantidad (Kits amplificación)EXPERIMENTO DE MICROARRAYS•Procedimiento de amplificación / detección•GeneTitan•Controles de calidad
  4. 4. Esquema ARRAYS AFFYMETRIX •Tipos •¿cómo están hechos?MATERIAL DE PARTIDA: RNA•Calidad (Bioanalyzer/RIN)•Cantidad (Kits amplificación)EXPERIMENTO DE MICROARRAYS•Procedimiento de amplificación / detección•GeneTitan•Controles de calidad
  5. 5. Tipos de microarraysSegún lo que interrogan: DNA ANALYSIS ARRAYS RNA ANALYSIS ARRAYS •SNPs •3’IVT •Resequencing •Gene/Exon arrays •Citogenética •miRNA •Chip on chip •FFPE Según el formato: Cartucho individual Placa de 16/24/96
  6. 6. Tipos de microarrays.DNADNA ANALYSIS ARRAYS •Genome-Wide SNP Analysis GW Human SNP array 6.0 ? 1.8 M marcadores genéticos (900.000 SNP + 900.000 CNV) •Resequencing Arrays Human Mitochondrial array “Custom” resequencing arrays •Citogenética CytoScan HD Array Dna copy number (ganancias/pérdidas), LOH, disomia uniparental, SNPs
  7. 7. Tipos de microarrays. DNADNA ANALYSIS ARRAYS • ChiP-on-Chip: Estudio de interacciones entre DNA y proteínas y modificaciones del DNA, ej.  Sitios de unión de factores de transcripción  Sitios de unión de histonas  Metilación del ADN
  8. 8. Tipos de microarrays. RNAEXPRESSION ANALYSIS ARRAYS •3’IVT 5’ 3’ •Detección sesgada (buena cola polyA, buen extremo 3’) •Muchas especies representadas •Arrays más clásicos Human U133 Plus 2.0 Prime View Array (Unigene database 133) (Unigene database 219)
  9. 9. Tipos de microarrays. RNAEXPRESSION ANALYSIS ARRAYS Exon Arrays5’ 3’ Gene ArraysExon Arrays Human, Mouse, Rat Exon 1.0 ST ArrayGene Arrays Human, Mouse, Rat, CHO, Porcine, Canine … Gene 1.0 ST Array Human/Mouse/Rat/CHO Gene 2.0 ST Array •Librería actualizada (RefSeq 36 51) •Incluye sondas para detección long intergenic no-coding RNA transcripts (lincRNAs)
  10. 10. Tipos de microarrays. RNAmiRNA GeneChip miRNA 3.0 Array •153 organisms in the array (human, mouse, rat, canine, ….) •100% miRBase v17 •2.216 snoRNAs and scaRNAs (human small nuclear RNAs) •Low inputs amounts (130 ng total RNA) •2.999 probe sets unique to pre-miRNA hairpins •Interroga de forma independiente pre-miRNAs y maduros •También útil para muestras de FFPE
  11. 11. Tipos de microarrays. RNAALMAC XCEL ARRAY •Tipo química 3’IVT •Especialmente diseñado para muestras de FFPE. Muy problemáticas (calidad RNA baja, modif químicas,…) •Diseño de kit “a medida” (Sensation Plus FFPE kit) 20 ngr •Kits de extracción RNA (FormaPure BeckmanCoulter, RecoverAll LifeTech, Rneasy Qiagen,…) •70% equivalente a HgU133 Plus 2.0 •8% información mejorada que no está en HgU133 plus2.0 •22% sondas derivadas de secuenciación de muestras de cáncerOncoScan •De momento es un servicio. En breve un array de catálogo. •Especialmente diseñado para muestras de FFPE. Muy problemáticas (calidad RNA baja, modif químicas,…) •75 ngr de DNA •Información sobre cambios en número de copias, SNPs y LOH. •Permite integración datos con expresión y miRNAs
  12. 12. Tipos de microarrays.Human Transcriptome Array (HTA) •Arrays todavía no en catálogo. Se pueden pedir a través de “core facilities”. Finales 2012. •Más adecuado que Exon arrays (solamente 20% de la información está basada en datos bien contrastados). Falsos positivos
  13. 13. Tipos de microarrays.
  14. 14. ¿Cómo están hechos? (I). Fotolitografía
  15. 15. ¿Cómo están hechos?
  16. 16. ARRAYS AFFYMETRIX•Tipos•¿cómo están hechos?MATERIAL DE PARTIDA: RNA•Calidad (Bioanalyzer/RIN)•Cantidad (Kits amplificación)EXPERIMENTO DE MICROARRAYS•Procedimiento de amplificación / detección•GeneTitan•Controles de calidad
  17. 17. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICAMATERIAL DE PARTIDA RNA TOTAL Poli A mRNA Células eucariótas QIAGENEXTRACCIÓN Tejido TRIZOL CALIDAD BIOANALYZER CANTIDAD
  18. 18. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICACALIDAD RNA (I): BIOANALYZER
  19. 19. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICACALIDAD RNA (II): BIOANALYZER
  20. 20. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICACALIDAD RNA (III): BIOANALYZER. Cálculo de la concentración RNA Area: 192.0 RNA Concentration: 150 ng/µl Result Flagging Color: 255 Result Flagging Label: Bad RNA quality RNA Area: 155.7 RNA Concentration: 122 ng/µl rRNA Ratio [28s / 18s]: 1.6 RNA Integrity Number (RIN): 8.5 (B.02.08) Result Flagging Color: 65280 Result Flagging Label
  21. 21. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICACALIDAD RNA (IV): BIOANALYZER. Cálculo de la concentración Not all expected ladder peaks have been found. You should try to modify peak find settings or add peaks using manual integration. Issue with ladder peak detection. Please check ladder. RNA Area: 1,653.2 RNA Concentration: 50,101 pg/µl rRNA Ratio [28s / 18s]: 1.3 RNA Integrity Number (RIN): 7.7 (B.02.08) Result Flagging Color: 65280 Result Flagging Label: Good RNA quality
  22. 22. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICABIOANALYZER Chips disponibles: RNA Agilent RNA 6000 Nano Kit Agilent RNA 6000 Pico Kit Agilent 2100 Small RNA Kit DNA Agilent DNA 1000 Kit Agilent DNA 7500 Kit Agilent DNA 12000 Kit Agilent High Sensitivity DNA Kit PROTEINAS Agilent Protein 80 Kit Agilent Protein 230 Kit High Sensitivity Protein 250 Kit CÉLULAS Agilent Cell Kit
  23. 23. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICACALIDAD RNA (III): RNA INTEGRITY NUMBER 0 ≤ RIN ≤ 10
  24. 24. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICACALIDAD RNA (IV): RNA INTEGRITY NUMBER
  25. 25. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICACALIDAD RNA (V): RNA INTEGRITY NUMBER? ¿qué RIN es el más adecuado? ¿hasta que RIN se puede utilizar? ¿se pueden mezclar diferentes RIN? RIN 5.0 RIN 8.0
  26. 26. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICACALIDAD RNA (VI): TIPO DE MUESTRA• kits especiales extracción RNA• extracción “genes globina”• no trabajar con sangre total• HABLAR CON NOSOTROS ANTES
  27. 27. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICACANTIDAD RNA • 3’ IVT ARRAYS 200 ng / 3 µL • Exon/Gene ARRAYS 200 ng / 3 µL • NUGEN 500 pg / 5 µL • miRNA 130ng / 8 µL
  28. 28. ARRAYS AFFYMETRIX•Tipos•¿cómo están hechos?MATERIAL DE PARTIDA: RNA•Calidad (Bioanalyzer/RIN)•Cantidad (Kits amplificación)EXPERIMENTO DE MICROARRAYS•Procedimiento de amplificación / detección•GeneTitan•Controles de calidad
  29. 29. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICAPROCEDIMIENTO (I) 3’IVT EXPRESS TTTTT AAAAAA IVT AAAAAA TTTTTTTRNA (150 ng) O/N cRNA (≈ 40 µg) RNA-cDNA dscDNA EXON/GENE NNNNN IVT NNNNNRNA (150 ng) O/N RNA-cDNA dscDNA cRNA ssDNA (7 µg)
  30. 30. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICAPROCEDIMIENTO (II) NUGEN NNNNN SPIA TTTTTRNA (500 pg) RNA-cDNA dscDNA ssDNA (8 µg) miRNA Biotin-labeled 3DNA ATP AAAAAA AAAAAARNA (130 ng) Biotin-labeled RNA
  31. 31. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICAPROCEDIMIENTO (III)3’IVT EXPRESS EXON/GENE NUGEN miRNA Resequencing Fragmentación O/N
  32. 32. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
  33. 33. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICAY ESTO SOLO ACABA DE EMPEZAR… .CEL UEB
  34. 34. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICADIFERENCIAS ENTRE LOS KITS 3’ IVT Exon/Gene NUGEN O oligo dT NNN oligo dT + NNN cRNA ssDNA ssDNA 15 µg 5.5 µg 5 µg NO MEZCLAR DIFERENTES PROTOCOLOS DE AMPLIFICACIÓN EN UN MISMO PROYECTO…
  35. 35. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICAGENETITAN (I)
  36. 36. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICAGENETITAN(II) • Formato placa: 16, 24, 96 arrays
  37. 37. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICAGENETITAN(III) • Formato placa: 16, 24, 96 arrays  mayor high throughtput reducción del tiempo de procesado  disminución de costes  mayor reproducibilidad (disminución de efecto batch)  Formato cerrado (16, 24, 96)  No todos los tipos de especies, tipo de array representados
  38. 38. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICACONTROL DE CALIDAD (I)
  39. 39. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICACONTROL DE CALIDAD (II)
  40. 40. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICACONTROL DE CALIDAD (III). cRNA Puricado
  41. 41. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICACONTROL DE CALIDAD (III). cRNA Fragmentado

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