Course VHIR-UCTS-UEB - Session 2 - RTqPCR

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High throughput technologies in Genomics - Tecnologías de alto rendimiento en genómica.

Session 2: RTqPCR

Course held at Vall d'Hebron Research Institute (VHIR), in Barcelona, Catalonia, Spain, on October 5th, 2011.

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Course VHIR-UCTS-UEB - Session 2 - RTqPCR

  1. 1. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICADIA 1. 5 de Octubre  Microarrays (Ricardo Gonzalo y Alex Sánchez)  RTqPCR (Paqui Gallego y Alex Sánchez)
  2. 2. Programa del Seminario RTqPCR-2011 Definición de la técnica Terminología asociada a qPCR Diseñando un experimento de qPCR Etapas en la realización de un experimento de qPCR Evaluación de un ensayo de qPCR Bibliografía muy recomendada
  3. 3. Definición de la Técnica PCR en tiempo real o qPCR o RT-qPCR Termociclador Cebadores Ácido nucléico con sistema de detección Taq polimerasaA G CU TNucleótidos Tampón de reacción UNG (opcional) ROX Sonda Agentes intercalantes R Qhttp://www.appliedbiosystems.com/support/apptech/#rt_pcr
  4. 4. ROX como referente pasivo ROX=6-carboxy-X-rhodamine + ROX - ROX Desv St= ± 0.306 Desv St= ± 0.059 Δ Rn Ciclos Ciclos Fluoróforo referente pasivo más comúnmente utilizadopara normalizar la fluorescencia específica en instrumentos de ABI y Stratagene.
  5. 5. Programa del Seminario RTqPCR-2011 Definición de la técnica Terminología asociada a qPCR Diseñando un experimento de qPCR Etapas en la realización de un experimento de qPCR Evaluación de un ensayo de qPCR Bibliografía muy recomendada
  6. 6. Terminología asociada a qPCR Escala semi-logarítmica al Plató LineLog Fluorescence l cia en pon Rn Threshold Ex Baseline Ct value= 15.5 Cycle Number
  7. 7. RT-qPCR vs PCR Convencional PCR Convencional RT-qPCR Semi-cuantitativa:  Cualitativa y cuantitativa. Rango dinámico pequeño ›2 logs Baja Precisión; baja resolución y poco Cuantificación Absoluta A tiempo real Sensible. (fase exponencial) Cuantificación Relativa Manipulación post-PCR . Baja Resolución No-automatización A tiempo final Plus/Minus  Elevado rango dinámico de detección (fase plató) Discriminación Alélica Discriminación basada sólo en tamaño  Capaz de detectar cambios 2-fold. No requiere procesado post-PCR Los resultados no están expresados en  números. El BrET no es muy cuantitativo
  8. 8. Programa del Seminario RTqPCR-2011 Definición de la técnica Terminología asociada a qPCR Diseñando un experimento de qPCR Etapas en la realización de un experimento de qPCR Evaluación de un ensayo de qPCR Bibliografía muy recomendada
  9. 9. Diseñando un experimento de qPCR Aplicación Método de Normalización Química de detección:  Sondas específicas marcadas con fluorocromos  Agentes Intercalantes  Fluorocromos unidos a primers Reactivos:  Core kit vs Master Mix  dNTPs/dUTPs y UNG enzyme  ROX como referente pasivo Termociclador:  Formato  Número de canales de detección  Software de análisis  Duración del programa  Precio y flexibilidad de la oferta
  10. 10. Aplicaciones RTqPCR 3´oligo 5´oligo Proteína Tejido Target mRNA miRNACélula RNA ncRNAEucariota siRNA saRNA CNAAnálisis en Células Stem Validación MicroarraysAnálisis en célula Única DNA Bacteria SNP CNV Mutaciones Micoplasma Patógenos en la comida Virus Análisis Metilación
  11. 11. Estrategias de Normalización qPCR  Normalización respecto a la masa total de RNA exraído (chequeo calidad –RIN, moleculas/ng RNA)  Normalización respecto al volumen/masa de la muestra ( moléculas/mg tejido; moléculas/ml sangre)  Normalización respecto al número de células ( moléculas/célula)  Normalización respecto a un gen endógeno no regulable (GAPDH, tubulina, actina, albúmina, ciclofilina, micro-globulina, histonas, rRNA, ……)  Normalización respecto a más de un gen endógeno (›3)  geNorm (Vandesompele et al. 2002. Genome Biology)  BestKeeper (Pfaffl et. Al. 2004; Biotechnology Letters 2004)  Normfinder  Statistical modeling for selecting houskeeper genes (Szabo et al.2004, Genome Biology)Genes and Immunity (2005) 6, 279-284. ReviewBMC Bioinformatics 2009, 10:110
  12. 12. Plataforma de RTqPCR en la UCTS 7000 SDS 7900HT Fast SDS LightCycler 480 Tiras de 8 TubosFormato Microfluidicas Placas-384 White Plates-384 Placas-96 (Arrays de baja densidad)Ref. Pasivo ROX Ninguno ROX Formato 384-p: FAM, TAMRA, Filtros/canales detección:Química FAM, TAMRA, VIC, VIC, JOE, NED, SYBR, ROX, TET. JOE, NED, SYBR, ROX 500, 533, 568, 610, 640, 670 nm Formato LDA: FAM, VIC, ROX.mode 9600 Emulation/Standard Fast 9600 Emulation /Standard FastSoftwares V1.2.3f2 con RQ study SDS 2.4.1 RQ Manager 1.2 SW 1.5 Primer Express 2.0
  13. 13. La UCTS dispone de los siguientes reactivos:Química: SYBRGreen SondasTaqMann SondasTaqMannUNG: Sí SíMode: 9600 Emulation/Standard Fast
  14. 14. Programa del Seminario RTqPCR-2011 Definición de la técnica Terminología asociada a qPCR Diseñando un experimento de qPCR Etapas en la realización de un experimento de qPCR Evaluación de un ensayo de qPCR Bibliografía muy recomendada
  15. 15. Etapas Implicadas en la Realización de un ensayo de qPCR DNA ProductoMuestra Amplificado RNA cDNA Preparación Extracción Transcripción PCR a tiempo Muestra Ác. Nucléicos Reversa (RT) Real (qPCR )
  16. 16. Preparación Material de partida DNA Producto Muestra Amplificado RNA cDNA Preparación Extracción Transcripción PCR a tiempo Muestra Ácidos Nucléicos Reversa (RT) Real (qPCR )  Tipo de muestra  Método ExtracciónNATURE PROTOCOLS. Vol1, Num3, 2006
  17. 17. Preparación Material de partida DNA Producto Muestra Amplificado RNA cDNA Preparación Extracción Transcripción PCR a tiempo Muestra Ácidos Nucléicos Reversa (RT) Real (qPCR )  RNA total/mRNA/DNA  Calidad & Cantidad  Almacenamiento (-80ºC)NATURE PROTOCOLS. Vol1, Num3, 2006
  18. 18. Evaluación del RNA RNA Q &Q Pureza (ausencia Integridad Cantidad de contaminación por • Existen dif. métodos de DNA y Proteínas y • rRNA ( 28S:18S=2:1) cuantificación. ausencia de inhibidores) • Número RIN (› 5) • Generan difs. resultados. • ODA260/A280=1.8-2.0 • Ensayo 3´:5´(alrededor de 1 indica •Hay que cuantificar muestras elevada integridad; ›5 degradado) comparables entre sí con el • OD A260/A230=2 mismo método de cuantificación. • SPUD assay (Nolan, 2006) Molecular Aspects of Medicine 27 (2006) 126–139 Expert Rev. Mol. Diagn. 5, 493-498 (2005) PERFECTO BUENO MALO 10.0 9.2 8.1 7.2 6.0 5.0 4.4 4.0 2:1Gel Desnt.Agarosa Agilent Bioanalyzer
  19. 19. Reacción de Transcripción Reversa (RT) Producto Muestra RNA cDNA Amplifcado Preparación Extracción Transcripción PCR a tiempo Muestra Ácidos Nucléicos Reversa (RT) Real (qPCR )  One-Step vs Two Step  CDNA Priming  Pérfil Térmico  Consideraciones ExperimentalesNATURE PROTOCOLS. Vol1, Num3, 2006
  20. 20. One Step RT-PCR vs Two Step RT-PCR One-Step RT-PCR  Requiere una única mezcla de reacción ya que RT y PCR ocurren en el mismo tubo.  AmpErase UNG no se puede usar.  Única enzima (ej. PolimerasaTth) RNA-y-DNA dependiente.  Minimiza tiempo de preparación y el riesgo de contaminación.  No es posible la optimización por separado de ambas reacciones.  Requiere primer RT específico de secuencia.  Menos sensible debido a la menor eficiencia de la actividad RT de la polimerasa.  Acumulación de dímeros de primers. RT qPCR RNA cDNA Producto Amplif. Two-Step RT-PCR  Requiere dos mezclas de reacción (reacción RT y reacción PCR).  Más flexible (El cDNA se puede guardar y ser usado RNA RT cDNA más tarde).  Permite la optimización por separado de ambas reacciones. qPCR cDNA Producto Amplif.  Permite el uso de primer RT específico de secuencia, random primers o oligo(dT).NATURE PROTOCOLS. Vol1, Num3, 2006
  21. 21. Transcripción Reversa: cDNA Priming
  22. 22. Consideraciones Experimentales de la RT En general, usar el RNA total como molde para la RT. Dado que la eficiencia de RT depende del gen diana y de la enzima de RT, es muy importante usar siempre el mismo enzima RT, los mismos primers para la síntesis de cDNA y las mismas condiciones experimentales si se quieren comparar resultados entre sí. Hacer réplicas Incluir siempre control no-RT Añadir la misma cantidad de RNA total en cada reacción. Siempre que sea posible, montar las reacciones de RT de todas las muestras al mismo tiempo para evitar la variación entre tandas. Cuando se procesan múltiples muestras en diferentes tandas, incluir una muestra control positiva de referencia en todas las tandas.NATURE PROTOCOLS. Vol1, Num3, 2006
  23. 23. qPCR Producto Muestra RNA cDNA Amplifcado Preparación Extracción Transcripción PCR a tiempo Muestra Ácidos Nucléicos Reversa (RT) Real (qPCR )  Elección en el software del ensayo a realizar  Perfil Térmico  Consideraciones ExperimentalesNATURE PROTOCOLS. Vol1, Num3, 2006
  24. 24. Elección en el software del ensayo a realizar7000 SDS de ABI 7900 SDS de ABI
  25. 25. Con Curva Stándard 7000 SDS de ABI 7900 SDS de ABIAbsolute Quantification Standard Curve (AQ) (Standard Curve)
  26. 26. Elección en el software del ensayo a realizar7000 SDS de ABI 7900 SDS de ABI
  27. 27. ddCt 7900 SDS 7000 SDS ∆∆Ct (RQ)Relative Quantification (ddCt) PlateRelative Quantification (ddCt) Study
  28. 28. LightCycler 480 II
  29. 29. Perfil térmico clásico qPCRPerfil térmico que incluye paso de Activación UNG 1.- Activación UNG 2.- Activación Taq y desnaturalización UNG 3.- Desnaturalización del dsDNA 4.- Anillamiento y extensión primers
  30. 30. Consideraciones qPCR Cuando se procesan múltiples muestras en diferentes placas, la inclusión de una muestra calibradora o curva estándar en cada placa es un control importante para medir la variabilidad inter-ensayo. Duplicados técnicos son generalmente suficientes (Triplicados si Cts›35). Si las réplicas difieren ›0.5 Ct, las reacciones deberían repetirse. Son más importantes los duplicados biológicos. Incluir Controles negativo (NTC) y positivos. Cargar el NTC en el pocillo que esté más distanciado de aquel que contenga mayor concentración de cDNA para evitar contaminación cruzada. Preparar mezcla de reacción de pcr en laboratorio diferente de donde se manipule el cDNA. Es siempre mejor no esperar demasiado en correr un run de qPCR después de la preparación de la placa. Si necesitas comparar dos placas idénticas con diferente ciclo de temperaturas, es mejor prepararlas al mismo tiempo, y guardar una de ellas a 4ºC protegido de la luz hasta 10 horas. Especial atención en el sellado de la placa para evitar evaporaciones y evitar marcas y huellas en la parte superior del cobertor/tapa. NATURE PROTOCOLS. Vol1, Num3, 2006 Real-Time PCR Aplications Guide from Bio-Rad
  31. 31. Programa del Seminario RTqPCR-2011 Definición de la técnica Terminología asociada a qPCR Diseñando un experimento de qPCR Etapas en la realización de un experimento de qPCR Evaluación de un ensayo de qPCR Bibliografía muy recomendada
  32. 32. Etapas Implicadas en la Realización de un ensayo de qPCR DNA Producto AmplificadoMuestra RNA cDNAPreparaciónMuestra Extracción Ác. Nucléicos Transcripción Reversa (RT) PCR a tiempo Real Análisis (qPCR ) de datos Calidad del Ensayo Métodos de Cuantificación Estadística
  33. 33. Calidad del Ensayo Reproducibilidad (viene indicada por las réplicas) Controles qPCR NEGATIVOS  NTC (Non Template Control) Detección de dímeros de primers y contaminación  NAC (Non Amplif. Control) Detección de degradación de sondas  No RT (No RT control) Detección de contaminación por DNA genómico POSITIVOS  Control Endógeno Testado de la calidad de los reactivos. Usado también para normalizar.  Control Exógeno Testado de la calidad de los reactivos  Spiking Control Detecta presencia de inhibidores Curva de Disociación (SYBR Green) Curva Estándar  Linealidad de los datos  Distancia entre las curvas de amplificación  Eficiencia de amplificación
  34. 34. Calidad del EnsayoCurva Estándard: Eficiencia Convertir E en Pendiente Amplificación Porcentaje (E= 10-1/slope) %E= (E-1)100% R2 ›0.98 o r › 0.99 -3,0 2,2 115 -3,1 2,1 110 Slope= -3.73 -3,2 2,1 105 -3,3 2,0 101 -3,32 2,0 100 OK -3,4 2,0 97 -3,6 1,9 90 -3,7 1,9 86 -4 1,8 78 2n=Factor de dilución Factor n=LG(Factor Dil.)/LG(2) Dilución 2 1,00 5 2,32 10 3,32
  35. 35. Métodos de Cuantificación Cuantificación Absoluta Cuantificación RelativaCantidad de ácido nucléico (número de Cantidad relativa de ácido nucléicocopias, µg) por cantidad de muestra de una muestra Adada (por célula, por µg de RNA total) respecto a una muestra B Ejemplo: Niveles de expresión génicaEjemplo: medida carga viral en Tumor vs Tejido normal. A.- Cuantificación Relativa con Curva Stándard: Qty gen problema Muestra Problema = Qty gen EC 106 105 104 103 102 10 Qty gen problema Calibradora = Qty gen EC B.- Método Pfaffl: (Egen diana) dCT, gen diana (calibradora – muestra problema) RQ = (Egen EC)Ct dCT, gen EC (calibradora – muestra problema) C.- Método (Livak) Doble Delta CT: dCT = CT(gen diana) – CT(gen EC) ddCT = dCT(muestra problema) – dCT (calibradora) Log (Num de copias) RQ= 2–ddCT
  36. 36. Eficiencias del Gen Target vs Eficiencia gen EC Slope(Ct gen Target – Ct gen Endógeno) R2 Y = 0.0471x + 3.0178 R2 = 0.2315 ΔCt= Log Diluciones
  37. 37. RTqPCR en tela de juicioRoutine lab method’s accuracy called intoquestionNATURE MEDICINE VOL 16,page 349 APRIL 2010Catherine Shaffer Ejemplos:1) Potential viral pathogenic mechanism for new variant inflammatory bowel diseaseV Uhlmann et al. Mol Pathol 2002;55:84–90Estudio que causó una polémica en 1998 al sugerir un vínculo entre la vacuna triple vírica y el autismo.RT-qPCR and molecular diagnostics: no evidence for measles virus in the GI tract of autisticchildren.S.A. Bustin. Eur Pharm Rev Dig 1 (2008) 11-16.2) The mRNA of the Arabidopsis Gene FT Moves from Leaf to Shoot Apex and Inducesflowering.Huang et al. Science 309 September 2005: 1694-1696“Breakthrough of the Year 2005”, the runners-up. Science 310:1880-1885Retraction of Hung et al., Science 309 (5741) 1694-1696.H. Bohlenius et al. Sience 316 April 2007:367.
  38. 38. Diseño y Optimización de un experimento de RTqPCR
  39. 39. MIQE Guidelines
  40. 40. Programa del Seminario RTqPCR-2011 Definición de la técnica Terminología asociada a qPCR Diseñando un experimento de qPCR Etapas en la realización de un experimento de qPCR Evaluación de un ensayo de qPCR Bibliografía muy recomendada
  41. 41. Direcciones de interés relacionadas con qPCRhttp://qpcr.gene-quantification.info/http://genex.gene-quantification.info/http://www.horizonpress.com/pcr/qPCR-machines.htmlqPCR-Technical-Guide.pdf (Sigma Life Science)http://www.eurogentec.comhttp://www.dorak.info/genetics/glosrt.html
  42. 42. Seminario RTqPCR18 de Octubre en VHIR Prof. Michael Kubista Está entre los pioneros que desarrollaron la RTqPCR
  43. 43. Gracias

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