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  1. 1. CIENTÍFICA CIENTÍFICA Vol 8 N° 2, mayo-agosto 2011 Revista arbitradaDirectorDr. José Amiel PérezUniversidad Científica del SurVicerrector de Investigaciónjamiel@ucsur.edu.peComité EditorialDr. Pedro Mendoza AranaUniversidad Nacional Mayor de San MarcosFacultad de Medicina Humanapedro_mendoza_arana@yahoo.co.ukMSc. Javier Enciso GutíerrezUniversidad Científica del SurVicerrectorado de Investigaciónjenciso333@yahoo.com.mxDr. Felipe Antonio San Martín HowardUniversidad Nacional Mayor de San MarcosPresidente del Consejo deGestión de la Investigaciónfsanmartinh@unmsm.edu.peDra. Josefina TakahashiUniversidad Científica del SurFacultad de Negocios Agroforestalesdecagrofor@ucser.edu.peDr. Óscar Valiente CastilloUniversidad San Antonio Abad del CuzcoDecano de la facultad de Medicinaosvacal18@yahoo.esAsesora de diseño: Erika KohatsuAsistente de prensa: Rodrigo SalazarDiseño y diagramación: Carlos AmielCIENTIFÍCA, revista de ciencias de la UniversidadCientífica del Sur, publica tres números al año.La revista está dirigida a investigadores, científicos,docentes y estudiantes universitarios.La Universidad Científica del Sur no se solidariza necesariamentecon las opiniones expresadas en los artículos publicados en estaedición de CIENTÍFICA. Se autoriza la reproducción de los textossiempre que se cite la fuente.revistacientifica@ucsur.edu.peFondo Editorial. Universidad Científica del SurCarretera Antigua Panamericana Sur km 19 - Villa El SalvadorTel. 610 6400 anexo 528Tiraje: 600 ejemplaresHecho el depósito legal en la Biblioteca Nacional del PerúN° 2008-15522 / ISSN: 1997-100X
  2. 2. CIENTÍFICACONTENIDORevista Científica Vol 8 N°2 mayo - agosto 2011 COMITÉ CIENTÍFICO 8 EdITOrIal 9 arTÍCUlOS OrIGINalES • Obtención de extractOs de plantas que estimulan la prOliferación de una línea humana de células madre mesenquimales Obtaining Of plant extracts that stimulates the prOliferatiOn a human line Of mesenchymal stem cells Nathaly Enciso Benavides, José Amiel Pérez, Emilio Guija Poma, Alejandro Fukusaki Yoshizawa, Óscar Reátegui Arévalo, Javier Enciso Gutiérrez 89 • efectO del aloe vera en la cicatrización de lesiOnes gingivales effect Of aloe-vera in healing gingival lesiOns David Prosopio, Jorge Torres, Erick Valdivia, Elmer Salinas P., Margot de los Ríos 98 • evaluación de tres dilutOres para la refrigeración de semen de caballO peruanO de pasO y sus efectOs sObre la mOtilidad espermática e integridad funciOnal de la membrana evaluatiOn Of thre extenders fOr the semem refrigeratiOn prOcess Of peruvian pasO hOrses, and his effects On the mOtility sperm and functiOnal membrane integrity Verónica Orozco Chávez, Manuel Rosemberg Barrón, Alexei Santiani Acosta, Humberto Rodríguez Landeo 104 • evaluación de la capacidad antimicrObiana del clOrurO de cetilpiridiniO (ccp) sObre la micrOflOra existente en lOs cepillOs dentales en usO en preescOlares cOn dentición decidua cOmpleta evaluatiOn Of antimicrObial activity Of cetylpyridinium chlOride (cpc) On the existing micrOflOra tOOthbrushes in use in preschOOl children with cOmplete primary dentitiOn Simabukuro VF, Albites AU, Carmen Villarroel, Xavier Contreras, Ramírez YW, Tang SP, Aguilar GD, Álvarez-Vidigal E 115 arTÍCUlOS dE rEvISIóN • virus hanta. un antiguO virus emergente hantavirus. a fOrmer emerging virus Patricio Berríos Etchegaray, Javier Enciso Gutiérrez 122
  3. 3. ISSN 1997-700X • reflexiOnes en tOrnO a la ciencia reflectiOns abOut the science José Eduardo Rosales Trabuco 127CarTaS al EdITOr • cOnsistencia interna del inventariO de resOlución de prOblemas sOciales internal cOnsistency Of the sOcial prOblem sOlving inventOry-revised Alexandra Delboy Zenteno, Carolina Black Tam, César Merino Soto 134TESIS • factOres asOciadOs a las cOmplicaciOnes pOsOperatOrias en el serviciO de cirugía OncOlógica Luis Wong Espejo 144FE dE ErraTaS 150 • fragilidad física, deteriOrO cOgnitivO y factOres asOciadOs en adultOs mayOres del centrO geriátricO naval del callaO, perúSala CaBIESES • “trepanaciOnes”, extractO de la Obra la salud y los dioses del dr. fernandO cabieses (añO 2007) Dr. Fernando Cabieses 151NOTaS 152INSTrUCCIONES para lOS aUTOrES 156
  4. 4. COMITÉCIENTÍFICODr. Emilio Guija PomaUniversidad Científica del SurDirector del Instituto de InvestigaciónDr. Ricardo Caballero MerinoHospiten Rambla - EspañaJefe de Servicios de Obstetricia y GinecologíaDr. James GrahamUniversidad de Illinois en Chicago – EE.UU.Departamento de Farmacognosis. Facultad de FarmaciaPh.D. Carlos Moslares GarcíaUniversidad Ramón Llull - Barcelona, EspañaVice Decano Facultad de Economía IQSDra. Amparo ZavaletaUniversidad Nacional Mayor de San MarcosFacultad de Farmacia y BioquímicaDr. Manuel León Nuñez VergaraUniversidad Científica del SurFacultad de Medicina HumanaDr. Ricardo Caballero MerinoHospiten Rambla - EspañaJefe de Servicios de Obstetricia y GinecologíaPsic. César Merino SotoUniversidad Científica del SurFacultad de PsicologíaDr. Pedro San Martín HowardHospital Nacional Dos de MayoJefe del Departamento de PediatríaIng. Óscar PaibaUniversidad Científica del SurFacultad de Ingeniería de Sistemas EmpresarialesDra. Nancy LozanoUniversidad Nacional Mayor de San MarcosFacultad de Farmacia y BioquímicaIng. Juan Guerrero BarrantesUniversidad Científica del SurFacultad de Ingeniería y Gestión AmbientalIng. Doménico GuidaUniversidad de Salerno - ItaliaDepartamento de Ingeniería MecánicaIng. José DávilaUniversidad Científica del SurFacultad de Ingeniería de Sistemas EmpresarialesMg. Jenny Canales PeñaUniversidad Científica del SurDirectora de la Carrera de Comunicación y Publicidad CIENTÍFICA SE ENCUENTRA EN EL SISTEMA REGIONAL DE INFORMACIÓN
  5. 5. EDITORIAL APORTES AL CONOCIMIENTO Y APLICACIÓN DE LAS CÉLULAS MADRE PLURIPOTENTESNormalmente, las primeras células nacidas de la fertilización del óvulopor el espermatozoide, células de embrión temprano, son capaces deconvertirse en cualquier tipo de célula adulta, célula diferenciada que haadquirido un determinado linaje y forma un tejido específico. Por estacapacidad se las denomina células pluripotentes, pueden adoptar lascaracterísticas de cualquier tipo de células del cuerpo humano, siguiendoun programa genético preestablecido y perfectamente definido en unproceso que comienza en la fertilización y, a través de distintos pasos,termina en una célula adulta, diferenciada y especifíca.Yamanaka y colaboradores, el año 2006, publicaron en Cell unprocedimiento para obtener células madre pluripotentes inducidas(iPSCs) a partir de células adultas, utilizando cuatro genes: Oct4, Sox2,Kef4 y C-Myc. Observaron que un porcentaje importante de ratonesinyectados con iPSCs había desarrollado cáncer, como consecuencia dela actividad residual no silenciada de los retrovirus vectores ‒verdaderas“naves transportadoras” de genes‒ utilizados para introducirlos en lamolécula de ADN. Para superar este inconveniente se desarrollarontécnicas que utilizan adenovirus en vez de retrovirus, con lo que seprescinde de genes que tienden a estimular el desarrollo de cáncer.También disminuyeron el número de genes inicialmente empleados coneste fin. El mismo Yamanaka, en el 2008, publicó en Science una técnicaque permite obtener iPSCs sin vectores virales.Quedaron siempre dudas respecto de la identidad de las célulaspluripotentes inducidas, de su calidad y su capacidad para producir todotipo de células del organismo, tal como lo exige la definición del término.En ocasiones, algunos genes del ADN de las células originales puedenno haber sido activados y transferir solo parcialmente sus diversascaracterísticas; en consecuencia, estas no califican para adjudicárselessu identidad primigenia de células madre, y puede incluso alterarse sucorrecta derivación en células diferenciadas.Se investiga para establecer de manera inequívoca pruebas de supluripotencia empleando marcadores, técnicas in vitro para obtener granvariedad de células de diferentes Iinajes, producir teratomas o los trestipos de células fundamentales (ectodermo, mesodermo y endodermo),y comprobar su capacidad de incorporación al crecimiento embrionarioen animales de experimentación. Todas son pruebas que cumplen
  6. 6. las células embrionarias y deben hacerlo también las células madre pluripotentes. En el Perú se vienen realizando ensayos clínicos con células madre autólogas, para evitar el rechazo, las cuales, felizmente y por las técnicas breves utilizadas, no ofrecen la posibidad de modificación genética como podría ocurrir con las células pluripotentes inducidas; pero probablemente tampoco se las identifica como células madre y, por tanto, no pueden cuantificarse. Es imprescindible realizar esta tarea determinando la dosis terapéutica. De no hacerlo, estaríamos obviando la etapa experimental que es la que confiere a esta nueva tecnología ‒que con justa razón se ha denominado “la promesa terapéutica”‒ un mayor valor científico, más seguridad y precisión. En la Universidad Científica del Sur estamos desarrollando trabajos experimentales para contribuir a la aplicación correcta de estos métodos y, precisamente, en el artículo “Extractos de plantas que estimulan la proliferación de una línea humana de células madre mesenquimales”, Nathaly Enciso y colaboradores, continuando con publicaciones anteriores, tratan el tema de la identificación de células madre con miras a una cuantificación que permita administrar la cantidad apropiada de estas células en cada intervención médica. Para ello es necesario innovar técnicas actuales y proveer de otras, rigurosas y de aplicación práctica, simples y rápidas. También en este trabajo se busca delinear procedimientos de incremento celular para aquellos casos en los que se encuentre un número muy reducido de células madre pluripotentes, ya que estas podrían multiplicarse convenientemente en cantidad, tiempo y calidad, sin modificación de su genoma, y así garantizar el resultado favorable esperado. Dr. José Amiel Pérez Director88 Científica 8 (2), 2011
  7. 7. Obtención de extractos de plantas que estimulan la proliferación de una línea humana de células madre mesenquimalesarTÍCUlOSOrIGINalES OBTENCIÓN DE EXTRACTOS DE PLANTAS QUE ESTIMULAN LA PROLIFERACIÓN DE UNA LÍNEA HUMANA DE CÉLULAS MADRE MESENQUIMALES OBTAINING OF PLANT EXTRACTS THAT STIMULATES THE PROLIFERATION A HUMAN LINE OF MESENCHYMAL STEM CELLS Nathaly Enciso Benavides1, José Amiel Pérez1, Emilio Guija Poma1, Alejandro Fukusaki Yoshizawa2, Óscar Reátegui Arévalo2, Javier Enciso Gutiérrez1 rESUMEN de E. arvense (5,61%), B. orellana (13,5%) y B. incana (7,5%), que en El tejido adiposo es la fuente más pruebas bioquímicas evidenciaron rica y accesible de células madre una capacidad antioxidante de 5,6 mesenquimales con alta capacidad para (E. arvense), 28,11 (B. orellana) y regenerar diversos tejidos lesionados y 16,25 mmoles/100 g/m.s. (B. incana); tratar enfermedades inmunitarias, previa el contenido de flavonoides fue de 3 expansión de poblaciones celulares. Esta 200 (E. arvense), 1 616 (B. orellana) y expansión de células madre in vitro es 773 mg (B. incana) de catequina/100 g influenciada por diferentes factores, de m.s.; mientras que el contenido de que intervienen sobre la formación de la polifenoles fue de 407 (E. arvense), 2 colonia, como las citoquinas, factores 241 (B. orellana) y 1 595 mg (B.incana) de crecimiento, aminoácidos y otras de ácido gálico/100 g de m.s. En moléculas esenciales para la vida de los ensayos las células recibieron las células madre. El suero fetal bovino solamente medio de cultivo DMEM- (SFB) es muy usado para estimular el High Glucosa con glutamina. Las crecimiento celular; sin embargo, por dosis de los extractos fueron 40, 80, su origen animal, no puede ser usado 160, 320, 640 y 1 280 µg/ml; como con este propósito en células madre control se usó el solvente metanol y de origen animal y humano. Sería de el SFB. Las células se sembraron por mucha utilidad para este fin, obtener triplicado, para cada dosis. El efecto moléculas o sustancias inocuas que sobre la proliferación celular se evaluó cumplan el mismo estímulo que el SFB, a las 24, 48 y 72 horas, mediante la pero que no sean de origen animal. técnica XTT, y se midió la densidad En este trabajo de investigación se óptica en un lector de ELISA a 560 planteó como objetivo determinar, nm, expresándose los resultados en mediante bioensayos, si los extractos porcentaje como Tasa de Estimulación metanólicos de Equisetum arvense, Celular (TEC). Estos resultados Bixa orellana y Buddleja incana tienen evidenciaron que el extracto de E. efecto estimulador en la proliferación arvense, a las 48 horas y a dosis de in vitro de células madre humanas 1280 µg/ml, tiene el mayor valor TEC STEMPRO® Human Adipose-Derived sin SFB (173%) y con SFB (366%), Stem Cell (ADSC), adquirido de seguido por B. orellana sin SFB INVITROGEN Inc. EE.UU. y comparar (106%) y con SFB (329%), finalmente ese efecto con la mezcla de SFB + por B. incana sin SFB (80%) y con extracto metanólico de las plantas SFB (170%). El valor máximo TEC estudiadas. Se obtuvieron extractos utilizando solo SFB fue del 83% a 1 universidad científica del sur. labOratOriO de cultivO celular. 2 universidad científica del sur. labOratOriO de biOquímica y química de prOductOs naturales. Científica 8 (2), 2011 89
  8. 8. Nathaly Enciso Benavides, José Amiel Pérez, Emilio Guija Poma, Alejandro Fukusaki Yoshizawa, Óscar ReáteguiartÍculOs Originales Arévalo, Javier Enciso Gutiérrez las 72 horas. Se concluye que los m.s. was 3200 (E. arvense), 1616 (B. extractos metanólicos de E. arvense y orellana) and 773 (B. incana), while B. orellana producen una TEC mayor the polyphenol content expressed que la de B. incana con o sin el SFB, por as acid galic/100 g de m.s was 407 lo que pueden ser buenos candidatos (E. arvense), 2241 (B. orellana) and para ser usados como estimuladores 1595 (B.incana). For trials stem cells de la expansión poblacional de células received culture medium DMEM-High madre humanas. Glucose with glutamine. Stem cell were seeded in triplicate at following extract Palabras clave: células madre doses 40, 80, 160, 320, 640 and 1280 humanas, proliferación celular, mg / ml, same as the solvent control extractos metanólicos de plantas. and FBS. The effect on cell proliferation was assessed at 24, 48 and 72 hours by aBSTraCT XTT technique, measuring the optical density in an ELISA reader at 560 nm, Adipose tissue is the available and expressed in percentage and rate of richest source of mesenchymal stem cellular stimulation (TEC). The results cells, with high capacity to regenerate showed that E. arvense methanolic various injured tissues and treatment of extract has the highest TEC, either immune diseases previous expansion without FBS (173%) and with FBS of cell populations. This expansion (366%) at 48 hours, with a dose of 1 of stem cells in vitro is influenced by 280 mg / ml, followed by B. orellana different factors affecting the formation without FBS (106%) and with FBS of the colony, such as, cytokines, (329%) and finally B. incana without growth factors, amino acids and other FBS (80%) and with FBS (170%). We molecules essential for stem cells conclude that methanolic extracts of proliferation and differentiation. Fetal E. arvense and B. orellana TEC have bovine serum (FBS) is used to stimulate more proliferation effect on stem cells cell growth, but being from animals, than the FBS alone. Therefore, could cannot be used for animal and human be good candidates for their use as stem cells proliferation. Molecules or stimulants of the population expansion harmless substances of non animal of human stem cells. origin, with similar stimulatory effect Keywords: human stem cells, cell that FBS can be very useful for this proliferation, plant extracts. purpose. The aim of this research work was to determine, through bioassays, if the methanolic extract of Equisetum INTrOdUCCIóN arvense, Buddleja incana and Bixa orellana have stimulatory effect on in Las células madre mesenquimales vitro human stem cells proliferation (MSCs) descubiertas por Friedenstein y and compare this effect with the colaboradores (1) son una población de combination of FBS + methanolic células madre/progenitoras con capacidad extract. For this purpose, a human pluripotente para diferenciarse en linajes stem cell line originating from adipose mesodérmicos y no mesodérmicos tissue (Stemprocell®, Invitrogen, USA) que incluyen osteocitos, adipocitos, was purchased and, cultured in vitro condrocitos, miocitos, cardiomiocitos, using culture medium DMEM supplied fibroblastos, miofibroblastos, células by the same laboratory until the start of epiteliales y neuronas. Residen the trials. After the extraction process primariamente en la médula ósea, the extracts of E. arvense (5.61%) of pero también existen en tejido adiposo, B. orellana (13.5%) and B. incana sangre periférica, sangre de cordón (7.5%), biochemical tests showed umbilical, placenta, útero, hígado y that antioxidant capacity expressed tejidos fetales (2). El tejido adiposo in mmoles/100 g of ms were of 5.6 es la fuente más rica y accesible de (E. arvense) and 11.28 (B. orellana) células madre mesenquimales con and 16.25 (B. incana), the flavonoid alta capacidad para regenerar piel content expressed as catequina/100 g lesionada (3), tendón (4), cartílago, 90 Científica 8 (2), 2011
  9. 9. Obtención de extractos de plantas que estimulan la proliferación de una línea humana de células madre mesenquimaleshueso, con efectos inmunomoduladores pulverizaron utilizando una licuadora yen enfermedades inmunitarias (5) y se separaron en porciones de 100 gpotencial de diferenciación miogénica (6). del polvo seco de Equisetum arvense y Bixa orellana y 20 g de B. incana, queUna vez obtenidas las células madre fueron tratadas con 350 ml y 200 mlde tejidos adultos (mesenquimales), de alcohol metílico respectivamente,deben cultivarse en medios especiales, dejándolas en reposo durante 24ser expandidas para luego someterse a horas. Transcurrido este tiempo seinducción de diferenciación en células procedió a filtrar utilizando papel filtrode diferentes tejidos o para realizar Whatman Nº 2. Al producto residual setrasplantes celulares. Esta expansión le adicionó 250 ml de alcohol metílicode poblaciones de células madre in y se repitió el proceso de la mismavitro, es influenciada por diferentes manera que en la etapa anterior por 3factores que intervienen sobre la veces para E. arvense y B. orellana y 4formación de la colonia, como son: veces para B. incana.tiempo de duplicación de la población,ciclo celular, expresión de marcadores Para realizar las determinaciones(7) y estabilidad genómica (8) y por analíticas bioquímicas se pesó 50,0 mgmoléculas como citoquinas, factores del extracto metanólico de E. arvense,de crecimiento, aminoácidos y otras, 50,6 mg de B. orellana y 26 mg de B.esenciales para la vida de las células incana que se disolvieron en 10 ml demadre (9,10,11,12). alcohol metílico.Por otro lado, la expansión de dETErMINaCIONESpoblaciones de células madre BIOqUÍMICaSmesenquimales in vitro no debemodificar la expresión de factores Capacidad antioxidantede transcripción involucrados enla autorenovación y multipotencia La capacidad antioxidante de los(13,14), por lo que se buscan factores extractos metanólicos de las plantasestimulantes de la proliferación motivo del presente estudio se determinócelular in vitro sin potenciales utilizando la técnica propuesta porefectos mutagénicos ni inductores de Benzie y Strain (15). En forma breve,diferenciación en las células madre. esta se realizó midiendo 1,0 mlEl objetivo de este trabajo es preparar del reactivo 2,4,6-tri-piridil-triazina,extractos metanólicos de las plantas 0,020 ml del extracto metanólico deEquisetum arvense, Bixa orellana la planta y 0,9 ml de agua destilada.y Buddleja incana que estimulen la Paralelamente se preparó el blancoproliferación de una línea de células respectivo, solvente sin muestra, ymadre humanas obtenida de tejido todos los tubos se colocaron en bañoadiposo. maría a 37 ºC durante 15 minutos a cuyo término se determinó la densidad ópticaMaTErIal Y MÉTOdOS a 593 nm en un espectrofotómetro Spectronic modelo Genesys 6. TodasprEparaCIóN dEl ExTraCTO las determinaciones se realizaron porMETaNólICO triplicado. Se elaboró una curva patrón, utilizando diversas concentraciones deSe trabajó con hojas de Equisetum sulfato ferroso para realizar los cálculos.arvense y Bixa orellana compradasen un mercado de Lima y de Buddleja Polifenoles totalesincana colectada en el poblado de SanLuis de Llincag, Huánuco, ubicado El contenido de polifenoles en losa 3,600 m.s.n.m. Las hojas de las extractos metanólicos de las plantasplantas previamente se lavaron con medicinales se determinó utilizando elagua destilada y colocaron en una método de Singleton (16), para cuyoestufa con corriente de aire a 40 ºC propósito a 0,020 ml de las muestras,hasta obtener peso constante, luego se se adicionó 1,0 ml del reactivo de Folin Científica 8 (2), 2011 91
  10. 10. Nathaly Enciso Benavides, José Amiel Pérez, Emilio Guija Poma, Alejandro Fukusaki Yoshizawa, Óscar ReáteguiartÍculOs Originales Arévalo, Javier Enciso Gutiérrez Ciocalteu 1:1 con agua destilada y, a fin de determinar la cinética de acción finalmente, 1,5 ml de una solución de del producto. La metodología seguirá los carbonato de sodio al 7,5%. Los tubos protocolos descritos previamente (18,19). se colocaron en baño maría a 45 ºC durante 15 minutos, a cuyo término Tasa de estimulación celular (TEC) se leyeron en el espectrofotómetro a 765 nm. Paralelamente, se preparó el Se realizó mediante la técnica XTT blanco respectivo sin muestra. Para (20) que se basa en la capacidad de realizar los cálculos se preparó una las células metabólicamente activas curva patrón utilizando diferentes para reducir las sales de tetrazolium a concentraciones de ácido gálico. compuestos de formazán. La lectura se realizó en un lector de ELISA a 560 Flavonoides nm. El modelo biológico en el cual se realizó el experimento fueron cultivos de La determinación de flavonoides se líneas de células madre mesenquimales realizó utilizando la técnica propuesta originarias de médula ósea humana. por Jia (17), para lo cual se midieron Se cultivaron 5 x 103 células en dos 0,200 ml del extracto metanólico, se microplacas de 96 pocitos, en medio de adicionó 1,30 ml de agua destilada y cultivo celular Dulbecco High Glucosa añadió 0,075 ml de una solución de (DMEM-HG), una placa sin y otra nitrito de sodio al 5%, se dejó en reposo placa con SFB al 10%, mantenidos en durante 5 minutos, a cuyo término incubador a 37 ºC, con 5% de CO2 y se añadió 0,15 ml de una solución de 95% de humedad que fueron tratadas cloruro de aluminio al 10%. Después de con diferentes dosis de los extractos, 6 minutos en reposo se adicionaron 0,5 para conocer el efecto de los extractos ml de NaOH 1 N y 0,275 ml de agua metanólicos sobre la proliferación de destilada. La densidad óptica de la estas células. Como controles se tuvo: muestra y el blanco respectivo se midió células cultivadas (C.C) en medio DMEM a 510 nm. Para realizar los cálculos se con SFB al 10% (Control positivo), utilizó una curva patrón preparada con y células en DMEM con solvente concentraciones variables de catequina. METANOL (Prueba en blanco). EvalUaCIóN dE la rESUlTadOS Y dISCUSIóN prOlIFEraCIóN CElUlar Los extractos filtrados se juntaron y Cultivo de células madre humanas evaporaron utilizando un rotavapor a 40 ºC, con lo que se obtuvieron 5,61 Se compró una línea de células madre g de extracto metanólico seco (5,61%) humanas originaria de tejido adiposo de E. arvense, 13,5 g de B. orellana STEMPRO® Human Adipose-Derived (13,5%) y 1,5 g de B. incana (7,5%). Stem Cell (ADSC), adquirido de INVITROGEN, Inc. EE.UU. con la que Las pruebas bioquímicas de los se realizaron todos los ensayos. En el extractos estudiados utilizando como laboratorio se dividieron en 10 alícuotas solvente el metanol, permitieron de 100 µL, conteniendo 100 000 determinar que E. arvense tenía la más células por alícuota, y se mantuvieron alta cantidad de flavonoides y la menor en congelación a -80 °C hasta el día cantidad de polifenoles y, a la vez, del ensayo. Los ensayos in vitro se una menor capacidad antioxidante; realizaron en condiciones de asepsia mientras que Bixa orellana tenía en microplacas de cultivo de 96 pocitos la mayor cantidad de polifenoles y con un volumen final de 0,2 ml. El efecto mayor capacidad antioxidante, en sobre la proliferación celular del extracto a tanto que B. incana tuvo regular ensayar se evaluó a diferentes tiempos de cantidad de polifenoles, baja cantidad cultivo (24, 48 y 72 horas), diferentes dosis de flavonoides y moderada capacidad y en ausencia (control) de los extractos antioxidante (Tabla 1). 92 Científica 8 (2), 2011
  11. 11. Obtención de extractos de plantas que estimulan la proliferación de una línea humana de células madre mesenquimalesEl efecto estimulante de la proliferación incubación; a las 24 horas produjo unde células madre humanas cultivadas 56,7%, a las 24 horas 70,76% y a lassin SFB, pero sí con el extracto, 72 horas, un 83,52% (Tabla 2).fue medido mediante técnica XTT yexpresado como Tasa de Estimulación El efecto estimulante de la proliferaciónCelular (TEC). Se encontró que E. de células madre in vitro demostradoarvense fue el extracto que produjo la en este trabajo empleando extractosmayor TEC 173,89% a dosis de 1 280 vegetales, es innovatorio y deµg/ml y a las 48 horas(Figura 2), seguido porB. orellana 106,92%a las 48 horas (Figura3), mientras que B.incana (Figura 4) tuvomenor TEC (80,81%)que el control SFB(83,52%) (Tabla 2). Porotro lado, en las célulascultivadas con extractode E. arvense a dosisde 1 280 µg/ml y SFB seprodujo la mas alta TEC367,34%, superior a laexperiencia sin SFB. Elextracto metanólico deBixa orellana produjouna TEC de 337,82%a dosis de 1 280 µg/ml,mientras que B. incana figura 1. diferente mOrfOlOgía en las primeras hOras de cultivO. uestran células madre humanas Originarias de tejidO adipOsO. mprodujo una TEC de226,04%, a dosis de 1280 µg/ml (Figuras 5, 6 y 7). importancia para trabajos de expansión de poblaciones de células madreLa tasa de estimulación de la con fines de terapia regenerativa;proliferación de células madre humanas pero también es importante por laproducida por los extractos metanólico factibilidad de su utilización in vivo,de E. arvense, B. orellana y B. incana, debiendo evaluarse experiencias comoen este trabajo, estaría relacionada con estimulantes de células progenitoras,el contenido de flavonoides, mas no con como se ha demostrado con ella capacidad antioxidante ni el contenido extracto de Uncaria tormentosa sobrede polifenoles totales, puesto que en E. células de cordón umbilical (21);arvense son significativamente menores. mientras que un extracto, el polifenol epigallectin y la catequina del té verdeEl SFB al 10% produjo una TEC han demostrado efectos de promociónmáxima dependiente del tiempo de de la osteogénesis e inhibición de tabla 1. cOntenidO de pOlifenOles, flavOnOides y capacidad antiOxidante del extractO metanólicO de plantas medicinales. Nombre de la planta Polifenoles (mg de Flavonoides (mg de FRAP (mmoles/100 g ácido gálico/100 de catequina /100 g de m.s.) Capacidad an- m. s.) m.s.) tioxidante Equisetum arvense 407.30 3 200.53 5.60 Bixa orellana 2 241.00 1 616.96 28.11 Buddleja incana 1 595.18 773.89 16.25 Científica 8 (2), 2011 93
  12. 12. Nathaly Enciso Benavides, José Amiel Pérez, Emilio Guija Poma, Alejandro Fukusaki Yoshizawa, Óscar ReáteguiartÍculOs Originales Arévalo, Javier Enciso Gutiérrez la adipogénesis, en células madre aGradECIMIENTOS de médula ósea (22), similares a los efectos del flavonoide poncirin de la Al CONCYTEC por el apoyo brindado fruta Poncirus trifoliata (23). para lograr los objetivos de este proyecto. A Fredy Fabián estudiante FINaNCIaMIENTO de la Universidad Hermilio Valdizán de Huánuco, quien recolectó la planta Este trabajo fue financiado por el Buddleja incana. CONCYTEC mediante contrato No. 017-2010-CONCYTEC-OAJ tabla 2. tasa de estimulación celular expresada en pOrcentaje del suerO fetal bOvinO sObre células madre humanas según tiempO. Tipo de células Tasa de estimulación celular (TEC) % 24 horas 48 horas 72 horas Suero fetal bovino Humanas 56,70 70,76 83,52 figura 2. tasa de estimulación celular del extractO metanólicO de e. arvense sObre células madre humanas según dOsis y tiempO, cultivadas sin sfb. figura 3. tasa de estimulación celular del extractO metanólicO de B. orellana sObre células madre humanas según dOsis y tiempO, cultivadas sin sfb. 94 Científica 8 (2), 2011
  13. 13. Obtención de extractos de plantas que estimulan la proliferación de una línea humana de células madre mesenquimales figura 4. tasa de estimulación celular del extractO metanólicO de B. incana sObre células madre humanas según dOsis y tiempO, cultivadas sin sfb. figura 5. tasa de estimulación celular del extractO metanólicO de e. arvense sObre células madre humanas cultivadas cOn sfb. figura 6. tasa de estimulación celular del extractO metanólicO de B. orellana sObre células madre humanas cultivadas cOn sfb. Científica 8 (2), 2011 95
  14. 14. Nathaly Enciso Benavides, José Amiel Pérez, Emilio Guija Poma, Alejandro Fukusaki Yoshizawa, Óscar ReáteguiartÍculOs Originales Arévalo, Javier Enciso Gutiérrez figura 7. tasa de estimulación celular del extractO metanólicO de B. incana sObre células madre humanas cultivadas cOn sfb. REFERENCIaS 1. Friedenstein AJ, Piatetzky S II, Petrakova KV. Osteogenesis in transplants of bone marrow cells. J Embryol Exp Morphol. 1966; 16: 381- 90. 2. Liu ZJ, Zhuge Y, Velásquez OC. Trafficking and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells. Journal of Cellular Biochemistry 2009; 106: 984-91. 3. Yang JA, Chung HM, Won CH, Sung JH. Potential application of adipose- derived stem cells and their secretory factors to skin: discussion from both clinical and industrial viewpoints. Expert Opin Biol Ther. 2010;10(4): 495-503. 4. Uysal AC, Mizuno H. Tendon regeneration and repair with adipose derived stem cells. Curr Stem Cell Res Ther. 2010; 5(2): 161-7. 5. Kuhbier JW, Weyand B, Sorg H, Radtke C, Vogt PM, Reimers K. Stem cells from fatty tissue: A new resource for regenerative medicine? Chirurg. 2010;81(9):826-32. 6. Martinello T, Bronzini I, Maccatrozzo L, Mollo A, Sampaolesi M, Mascarello F, Decaminada M, Patruno M. Canine adipose-derived-mesenchymal stem cells do not lose stem features after a long-term cryopreservation. Res. Vet. Sci. 2010; 21. 7. Turnovcova K, Ruzickova K, Vanecek V, Sykova E, Jendelova P. Properties and growth of human bone marrow mesenchymal stromal cells cultivated in different media. Cytotherapy 2009; 25: 1-12. 8. Kenyon J, Gerson S.L. The role of DNA damage repair in aging of adult stem cells. Nucleic Acids Research 2007; 35(22): 7557-65. 96 Científica 8 (2), 2011
  15. 15. Obtención de extractos de plantas que estimulan la proliferación de una línea humana de células madre mesenquimales9. McNiece I, et al. Ex vivo expansion of cord blood mononuclear cells on mesenchymal stem cells. Cytotherapy, 2003; 6: 311-17.10. Wulf-Goldenberg A, et al. Cytokine pre-treatment of CD34+ cord blood stem cells in vitro reduces long-term cell engraftment in NOD/SCID mice. Eur J of Cell Biology 2007; 87: 69-8011. Levay K, et al. Tescalcin is an essential factor in megakaryocytic differentiation associated with Ets family gene expression. Journal of Clinical Investigations 2007; 117: 2672-83.12. Sigma Aldrich. Growth Factors and Cytokines for Stem Cell Biology. Brochure. 2009. www. sigma.com/stemcellgf13. Vicente MA, Vázquez MN, Entrena A, Olmedillas S, García-Arranz M, García- Olmo D, Zapata AG. Low doses of BMP4 increases the survival of human adipose-derived stem cells maintaining their stemness and multipotency. Stem Cells Dev. 2010; Sep 16.14. Baer PC, Griesche N, Luttmann W, Schubert R, Luttmann A, Geiger H. Human adipose-derived mesenchymal stem cells in vitro: evaluation of an optimal expansion medium preserving stemness. Cytotherapy 2010; 12(1): 96-106.15. Benzie IFF, Strain JJ. The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of antioxidant power: the FRAP assay. Anal Biochem, 1996; 239: 70-76.16. Singleton VL, Rossi JA. Colorimetry of total phenolics with phosphomolibdic phosphotungstic acid reagents. Am. J. Enol. Vitic. 1965; 16: 144-58.17. Jia Z, Tang M, Wu J. The determination of flavonoid contents in mulberry and their scavenging effects on superoxide radicals. Food Chem, 1999; 64: 555- 99.18. Freshney I. Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique. 3rd edition. 1994; Alan R. Liss, Inc., New York.19. Mather J, Barnes D. Eds. Methods in Cell Biology, Academic Press, San Diego. Animal Cell Culture Methods, 1998; 57.20. Lam HW, Lin H CH, Lao S CH, Gao JL, Hong SJ, Leong CH W, Yue PYK, Kwan YW, Leung AYH, Wang YT, Lee SM. The angiogenic effects of Angelica sinensis extract on HUVEC in vitro and zebrafish in vivo. J. Cell. Biochem, 2008; 103: 195-211.21. Farias I, do Carmo Araújo M, Zimmermann ES, Dalmora SL, Benedetti AL, Alvarez-Silva M, Asbahr AC, Bertol G, Farias J, Schetinger MR. Uncaria tomentosa stimulates the proliferation of myeloid progenitor cells. J Ethnopharmacol. 2011; 137(1): 856-63.22. Ko CH, Siu WS, Wong HL, Shum WT, Fung KP, Lau CB, Leung PC. Pro- bone and Antifat Effects of Green Tea and Its Polyphenol, Epigallocatechin, in Rat Mesenchymal Stem Cells in Vitro. J Agric Food Chem. 2011; 59(18): 9870-6.23. Yoon HY, Yun SI, Kim BY, Jin Q, Woo ER, Jeong SY, Chung YS. Poncirin promotes osteoblast differentiation but inhibits adipocyte differentiation in mesenchymal stem cells. Eur J Pharmacol. 2011; 664(1-3): 54-9. javier encisO cOrrespOndencia: jenciso333@yahOO.cOm.mx recepción: 27/05/2011 aceptación: 22/07/2011 Científica 8 (2), 2011 97
  16. 16. David Prosopio, Jorge Torres, Erick Valdivia, Elmer Salinas P., Margot De los RíosartÍculOs Originales EFECTO DEL ALOE VERA EN LA CICATRIZACIÓN DE LESIONES GINGIVALES EFFECT OF Aloe-verA IN HEALING GINGIvAL LESIONS David Prosopio1, Jorge Torres1, Erick Valdivia1, Elmer Salinas P.1, Margot de los Ríos1 rESUMEN INTrOdUCCIóN La enfermedad periodontal, en todas La capacidad de respuesta a una sus formas, es una de las afecciones agresión de un tejido es determinada que más afecta al ser humano. Por por una serie de eventos que, de manera ello, dentro del tratamiento para esta progresiva, se activan para restablecer patología se consideran terapias no las condiciones de integridad que este quirúrgicas y terapias quirúrgicas que haya tenido antes de ser afectado. implican incisión de los tejidos blandos, Previamente a considerar los procesos los cuales, luego del procedimiento en de reparación tisular, es importante sí, se reparan mediante el proceso tener presente que la cicatrización es de cicatrización. El objetivo de este el resultado de la regeneración de los trabajo fue comparar la cicatrización en tejidos y del cierre de una herida; no incisiones a nivel gingival en cobayos se trata de un fenómeno aislado y su con la aplicación de Aloe vera y sin evolución está condicionada por una este, en el periodo de una semana. serie de factores bioquímicos a nivel de la solución de continuidad que Palabras clave: Aloe vera, cobayos, representa la lesión, por unos cambios cicatrización en las estructuras tisulares y por una serie de procesos que determinan la formación de la cicatriz. Este proceso aBSTraCT puede ser dividido en tres etapas básicas: de inflamación, fibroblástica Periodontal disease is in all its forms y de remodelación. Dentro de este one of the most senious affections that complicado proceso en la cavidad affect humans. Therefore within the bucal, juega un papel importante la treatment for this disease is considered: función de diversas células como el not surgically therapy and surgical fibroblasto gingival, el queratinocito therapy, which involves soft tissue y el colágeno (1). En situaciones de incision, that after the procedure itself heridas abiertas y quemaduras (2), es is carried out the tissue repair through importante la rápida reparación de las the healing process. The aim of this lesiones, las cuales podrían mejorar a study was to compare the healing of través de la aplicación de sustancias gingival incisions in guinea pigs at the que favorezcan su crecimiento. La application of Aloe vera and without the aplicación simultánea de Aloe vera aloe in the period of one week. sería una opción eficaz para lograr este objetivo en heridas abiertas (3). Keywords: Aloe vera, guinea pig, healing El Aloe vera es una planta de la familia Xanthorrhoeaceae, de hojas gruesas, 1 universidad científica del sur. facultad de estOmatOlOgía 98 Científica 8 (2), 2011
  17. 17. Efecto del aloe vera en la cicatrización de lesiones gingivaleslanceoladas, espinosas y carnosas. JUSTIFICaCIóN dEl ESTUdIOTiene efectos antimicrobianos debidoa las sustancias que contiene, como la La justificación se basa en hallazgosaloetina, que neutraliza el efecto de las clínicos en los que se aplicó la sábilatoxinas microbianas, y la saponina, que a diferentes niveles y se obtuvoactúa como antiséptico. Además, tiene efectos positivos en los procesoscomponentes antiinflamatorios como antiinflamatorios y reparadores de losla emolina, la emodina y la barbaloina, tejidos como piel, mucosa gástricaque generan ácido salicílico, y los entre otros. Asimismo, existen estudiosfitosteroles, que también tienen efectos que han demostrado su eficaciaantiinflamatorios. Podemos mencionar, en enfermedades sistémicas y enasimismo, efectos cicatrizantes por heridas abiertas. Estos resultados sonsu contenido de fosfato de manosa, prometedores y llevan a continuarcarricina (2), que refuerza el sistema investigando para descubrir otrosinmune, y hormonas vegetales, que beneficios de la planta.ayudan a la reparación de tejidos y elcrecimiento celular. Determinar el efecto de la sábila sobre las lesiones gingivales podría ser deDesde hace mucho tiempo se viene mucho aporte para el periodoncista yutilizando el Aloe vera en la medicina odontólogo de práctica general, ya quetradicional debido a su efecto sus componentes podrían utilizarsecicatrizante. Además, estudios en ratas en apósitos posquirúrgicos o sobrehan demostrado que un polisacárido lesiones ya establecidas, con lo queextraído del Aloe vera estimula ayudarían a disminuir los procesosfactores de crecimiento y proliferación inflamatorios y mejorarían la actividadtisular como el factor de crecimiento reparadora de las células de la gíngiva.queratinocítico (KGF-1), el factor decrecimiento endotelial vascular (VEGF) yla producción de colágeno tipo I (1). MaTErIalES Y MÉTOdOSEl Aloe vera presenta una amplia variedad Estudio doble ciego en 14 animales dede especies, calculada en hasta 360 laboratorios (cobayos). Se utilizaronvariedades (2), de las cuales la más savia de Aloe vera, bisturí, gasa estéril,utilizada en la medicina tradicional es recipientes de vidrio con formol al 10% yAloe barbadensis (1,2), por sus beneficios microscopio Leica.cicatrizantes y antiinflamatorios, ademásde otros beneficios, como se sugiere enestudios realizados. La administración oralde Aloe vera podría ser un complementoútil para reducir la glucosa en la sangre depacientes diabéticos, así como reducir losniveles de lípidos en sangre de pacientes conhiperlipidemia, con resultados prometedoresde su actividad oral y tópica (2).OBJETIvODeterminar el efecto antiinflamatorio ycicatrizante de Aloe vera (sábila) sobrelesiones gingivales en animales delaboratorio (cobayos). Figura 1. cOrte de 3 a 4 mm en la encía adherida. Científica 8 (2), 2011 99
  18. 18. David Prosopio, Jorge Torres, Erick Valdivia, Elmer Salinas P., Margot De los RíosartÍculOs Originales Se separó a los especímenes en tres rESUlTadOS grupos: dos de 6 individuos y uno de 2 individuos (grupo control). El Aloe vera OBSERVaCIONES CLÍNICaS se preparó haciendo un corte en la base de la penca y se puso en agua para que El primer día no se observaron diferencias sus componentes químicos que podrían significativas; ambos grupos mostraron ser irritantes, como el Cu, P, Mg, I, fluyan la herida con inflamación circundante. hacia afuera de la hoja y poder así trabajar El día 2, el grupo experimental presentó con los componentes antiinflamatorios y mejores características reparadoras y cicatrizantes (figura 3). menor inflamación en relación con el grupo control. Al primer grupo de 6 individuos (grupo experimental) se le realizó un corte Al cuarto día, las características clínicas de 3 a 4 mm en la encía adherida a son evidentes al presentarse un mejor nivel del incisivo central derecho, y avance en el grupo experimental (con se les aplicó inmediatamente el Aloe aplicación de Aloe vera). Al octavo día, vera preparado previamente. A estos las cicatrices del grupo experimental especímenes se les aplicó el Aloe vera tienen menor volumen en relación 2 veces cada 24 horas durante 4 días con las del grupo control 1, y en (figuras 1 y 2). comparación con el tercer grupo (grupo control 2) las características de la Al segundo grupo de 6 unidades encía han reparado de manera eficaz. también se le realizó un corte con las Luego se sacrificó a los especímenes mismas características que al primer para el estudio histológico de la zona grupo, pero no se les aplicó el Aloe analizada. vera; este fue el primer grupo control. HISTOLOGÍa Al tercer grupo, de 2 individuos, no se le realizó ninguna incisión ni aplicación En el grupo experimental (con aplicación de Aloe vera (segundo grupo control). de Aloe vera) se observó un mayor número de células epiteliales, moderada queratinización, cantidad moderada de vasos sanguíneos, fibroblastos organizados y poco o nada infiltrado inflamatorio (figuras 4, 5, 8 y 9). Figura 2. aplicación del aloe vera luegO del cOrte. Figura 4. micrOfOtOgrafía a 10x, cOlOración he, cOn tratamientO de aloe vera. Figura 3. recOlección del gel de aloe vera. 100 Científica 8 (2), 2011
  19. 19. Efecto del aloe vera en la cicatrización de lesiones gingivalesFigura 5. micrOfOtOgrafía a 40x, cOlOración he, Figura. 7. micrOfOtOgrafía a 40x, cOlOración cOn tratamientO de aloe vera. se Observan vasOs he de encía, sin tratamientO cOn aloe vera. se sanguíneOs, fibrOblastOs OrganizadOs y cOlágenO, Observan múltiples vasOs sanguíneOs, fibrOblastOs nO se Observa infiltradO inflamatOriO. desOrganizadOs infiltradO inflamatOriO.Figura 6. mmicrOfOtOgrafía a 10x, cOlOración he, Figura 8. análisis cOmparativO de las características sin tratamientO de aloe vera. histOlógicas cOn y sin la aplicación de aloe vera. tabla 1. infOrme de lectura histOlógica. Científica 8 (2), 2011 101
  20. 20. David Prosopio, Jorge Torres, Erick Valdivia, Elmer Salinas P., Margot De los RíosartÍculOs Originales tabla 2. resultadOs n n n n tabla 3. resultadOs cualitativOs y cuantitativOs dISCUSIóN donde se observa la estimulación de los factores de crecimiento para fibroblastos y Los efectos antiinflamatorios y reparadores células epiteliales con la aplicación de gel del Aloe vera actúan de manera positiva de Aloe vera, lo que mejora la cicatrización sobre los tejidos gingivales, al mejorar la de heridas abiertas. respuesta celular y tisular frente a una agresión. Se debería continuar analizando CONClUSIóN y hacer el estudio en un grupo experimental más grande detallando las características El gel de Aloe vera tiene efectos clínicas e histológicas de las lesiones. En antiinflamatorios, cicatrizantes y reparadores estudios anteriores se muestran similares sobre las lesiones gingivales en animales de resultados, como en el realizado por laboratorio. Suwimon Jettanacheawchankit y col., 102 Científica 8 (2), 2011
  21. 21. Efecto del aloe vera en la cicatrización de lesiones gingivalesrEFErENCIaS BIBlIOGrÁFICaS1. Jettanacheawchankit S. Sasithanasate S, Sangvanich P, Banlunara W, Thunyakitpisal P. Stimulates Gingival Fibroblast Proliferation; Expressions of Keratinocyte Growth Factor-1, Vascular Endothelial Growth Factor, and Type I Collagen; and Wound Healing. Journal Pharmacol Sci 2009; 109: 525-31.2. Vogler BK, Ernst E. Aloe vera: a systematic review of its clinical effectiveness. British Journal of General Practice 1999; 49: 823-8.3. Sampaio FA, Passarini JR, Marretto M, Mendonça J, Franchini C, Tech dos Santos G. Effects of the application of Aloe vera and microcurrent on the healing of woundssurgically induced in Wistar rats. Acta Quirúrgica Brasileira 2009; 24 (2).4. Calixto Cotos M. Plantas medicinales utilizadas en odontología. Disponible en: http://cpu.usmp.edu.pe/odonto/servicio/2006rv2/Kiru3.pdf5. Mejía K y Rengifo E. Plantas medicinales de uso popular en la Amazonía peruana. Lima: AECI, 2000.6. Segura L. Aplicaciones farmacodinámicas y farmacocinéticas del Aloe vera. Rev. Acofar, 1994 david prOsOpiO cOrrespOndencia: perio_implantes98@hotmail.comrecepción: 05/07/2011 aceptación: 12/08/2011 Científica 8 (2), 2011 103
  22. 22. EVALUACIÓN DE TRES DILUTORES PARA LA REFRIGERACIÓN DE SEMEN DE CABALLO PERUANO DE PASO Y SUS EFECTOS SOBRE LA MOTILIDAD ESPERMÁTICA E INTEGRIDAD FUNCIONAL DE LA MEMBRANA EvALUATION OF THRE EXTENDERS FOR THE SEMEM REFRIGERATION PROCESS OF PERUvIAN PASO HORSES, AND HIS EFFECTS ON THE MOTILITY SPERM AND FUNCTIONAL MEMBRANE INTEGRITY Verónica Orozco Chávez1, Manuel Rosemberg Barrón2, Alexei Santiani Acosta2, Humberto Rodríguez Landeo2 rESUMEN 48 horas luego de la refrigeración, indican que el dilutor EP (43 y 12%) La utilización de la inseminación brinda mejores resultados (P ≤ 0,05) artificial en el mejoramiento genético en comparación con los dilutores del caballo peruano de paso es cada EZ (32 y 7%) y LD (23 y 2%). Los vez más frecuente. Existen diversas porcentajes de espermatozoides con técnicas de inseminación en equinos, adecuada integridad de membrana las cuales utilizan semen fresco, fueron similares entre los tres tipos de refrigerado o congelado. Para realizar dilutores. Estos resultados nos permiten un adecuado manejo del semen, es concluir que el dilutor más adecuado necesario diluir los espermatozoides para conservar espermatozoides en medios que provean las condiciones refrigerados de semen de caballo adecuadas para su supervivencia. peruano de paso sería el EquiPRO Existen diversos dilutores comerciales - Minitüb. Por otro lado, la utilización o caseros formulados en base a leche de leche descremada no brindaría descremada; sin embargo, son pocos ventajas respecto de los dilutores los estudios que indiquen el efecto de comerciales para la refrigeración de dichos dilutores en la conservación semen equino. del semen equino. El objetivo del presente trabajo fue evaluar el efecto Palabras clave: caballo peruano de diferentes dilutores desarrollados de paso, biotecnología, dilutor, para semen equino refrigerado en la refrigeración, semen funcionalidad de espermatozoides de caballo peruano de paso. Se SUMMarY refrigeraron siete muestras de semen The use of artificial insemination in equino, provenientes de dos potros. the breeding of the Peruvian Paso Cada muestra fue dividida en tres Horse is becoming increasingly partes y diluida con los dilutores E-Z common. There are several equine Mixin - ARS (EZ), EquiPRO - Minitüb insemination techniques using fresh (EP) y leche descremada (LD). Las semen, chilled or frozen. For proper muestras fueron almacenadas a 5 handling of semen, sperm must be °C y la evaluación se realizó a las diluted in media provide the right 0, 24 y 48 horas. Se evaluaron la conditions for their survival. There are motilidad progresiva y la integridad several commercial or homemade funcional de membrana espermática, diluter formulated based on skim milk, mediante el test hiposmótico (HOST). however few studies showing the effect Los resultados de la evaluación de of these diluter in the preservation of motilidad espermática a las 24 y 1 universidad científica del sur. facultad medicina veterinaria y zOOtecnia. unidad de zOOtécnica y tecnOlógica. lima 2 universidad científica del sur. facultad medicina veterinaria y zOOtecnia. lima104 Científica 8 (2), 2011
  23. 23. Evaluación de tres dilutores para la refrigeración de semen de caballo peruano de paso y sus efectos sobre la motilidad espermática e integridad funcional de la membranastallion semen. The aim of this study equino refrigerado (5 °C) (4), ya quewas to evaluate the effect of different a temperatura ambiente desciende lasperm diluter developed for equine motilidad espermática (5). Tambiénsperm functionality Peruvian Paso contiene sólidos no grasos y sulfatoHorse under refrigeration processes. 7 de amikacina. No se especifican mássamples were refrigerated for stallion compuestos en su fórmula. El Equiprosemen, from 2 foals. Each sample was - Minitüb (EP) está formulado en basedivided into 3 parts and diluted with EZ- a caseinatos específicos, proteínasMixin diluter-ARS (EZ)-Minitüb Equipro de suero de leche y un amplio rango(EP) and skim milk (LD). The samples de azúcares. No contiene antibióticoswere stored at 5 ° C and the evaluation ni leche descremada (6). No sewas performed at 0, 24 and 48 hours. especifican más compuestos en suProgressive motility was evaluated fórmula. Pagl y col. (2006) (7) indicanand the sperm membrane functional que dilutores (como el EquiPRO -integrity by the hypo-osmotic test Minitub) formulados en base a estos(HOST). The results of the evaluation compuestos son superiores a laof sperm motility at 24 and 48 hours leche descremada (3). Pese a esto,after cooling, indicating that the EP los dilutores usados generalmentediluter (43 and 12%) provides better están formulados en base a lecheresults (P ≤ 0.05) compared with the descremada y yema de huevo, ydiluter EZ (32 and 7%) and LD (23 and ofrecen variados resultados en relación2%). The percentages of spermatozoa a la motilidad espermática (8, 9).with membrane integrity proper weresimilar among the 3 types of diluter. Son pocas las investigacionesThese results demonstrate that the dirigidas a la evaluación de diferentesmost appropriate diluter to keep chilled dilutores de semen de caballo peruanosemen sperm Peruvian Paso Horse- de paso para su conservación. PorMinitüb would Equipro. The use of skim ejemplo, Donayre (1987) (10) y Ruizmilk would provide no advantages over (2001) (11) no encontraron diferenciascommercial diluter for cooling stallion significativas entre dilutores empleadossemen. en semen equino, y obtuvieron pobresKeywords: Peruvian Paso Horse, resultados (27.50% de motilidad a lasbiotechnology, diluter, cooling, semen 19,5 horas de refrigeración). Por tal motivo, es de suma importancia seguir evaluando los dilutores existentes enINTrOdUCCIóN el mercado, a fin de poder optimizar lasLos dilutores son medios apropiados técnicas de preservación de semen decapaces de mantener la viabilidad caballo peruano de paso.espermática del semen fresco,refrigerado o congelado, a corto MaTErIalES Y MÉTOdOSo largo plazo. Se caracterizan por 1.1 Período de estudiodisminuir la contaminación bacteriana,mantener la viabilidad espermática (1) El trabajo se realizó durante el mes dey obtener mayor volumen del semen septiembre del 2009. Tuvo una duración(2), con lo que aumentan la tasa de cuatro semanas, y se destinaron dosreproductiva del macho al inseminar días de la semana (martes y jueves enartificialmente a un mayor número de horas de la mañana) para realizar lasyeguas. Existen dilutores comerciales colecciones seminales de los potroscomo el E-Z Mixin (CST) - Animal seleccionados.Reproduction Systems, Equipro -Minitüb y caseros como la leche fresca 1.2 Lugar de estudiodescremada UHT Gloria Súper Light(ultra pasteurizada, 0% grasas). El EZ Esta etapa se realizó en un criaderoMixin (CST) - ARS (EZ) está formulado ubicado en el km 40 de la Antiguaen base a leche descremada en polvo Panamericana Sur. Luego de habery glucosa (3). Generalmente, es colectado a los potros, las muestrasempleado para conservar el semen de semen fueron transportadas Científica 8 (2), 2011 105
  24. 24. Verónica Orozco Chávez, Manuel Rosemberg Barrón, Alexei Santiani Acosta, Humberto Rodríguez LandeoartÍculOs Originales ventocraneal (figura 2). Con la vagina artificial armada y lista para su uso, al laboratorio CIRE. (Centro de se aproximaba el potro a la yegua. El Investigación y Reproducción Equina), potro se estimulaba y, una vez que el ubicado en Mamacona (Lurín), para pene estaba totalmente protruido, se le realizar los respectivos análisis. alejaba de la yegua para poderle lavar y secar el pene. Esto permitió eliminar 1.3 Potros esmegma u otros detritus presentes en la superficie peneana. Finalmente, se Se seleccionaron dos potros de la volvía a acercar al potro a la yegua, y raza caballo peruano de paso (CPP), una vez que el pene estaba totalmente los cuales tenían 8 años (potro 1) y 10 protruido y erecto, se dejaba que monte años (potro 2) de edad, con 280 y 290 a la yegua y el pene era desviado hacia kg de peso, respectivamente. la vagina artificial (figura 3). Al término de la eyaculación, se llevaba el semen 1.4 Colección de semen al laboratorio. Para realizar las colecciones seminales, 1.5 Manejo, dilución y se seleccionaron potros según su refrigeración de semen comportamiento y aceptación de la vagina artificial, tal como se muestra a Las muestras de semen obtenidas continuación: fueron filtradas para separar la fracción gel del eyaculado. Para ello, se vertió el eyaculado obtenido en otra bolsa colectora que contenía el filtro de nailon (malla con poros de 37 μm), que permitía el pasaje de la porción menos Para realizar las colecciones densa del eyaculado. La primera seminales, se utilizó una vagina artificial evaluación seminal se realizó con el tipo Missouri (figura 1). Dado que semen fresco inmediatamente después se utilizaba una sola vagina artificial de la colección. Solo las muestras con para los dos potros, previamente a motilidad > 50% fueron consideradas su armado, se procedía a colocarle aptas para el presente estudio. Las y retirarle (antes y después de cada muestras seleccionadas fueron diluidas colección) un guante de palpación en 1:1 con el dilutor respectivo, a fin de el interior (entre las fundas de látex). transportar las muestras refrigeradas Se llenaba la vagina artificial con agua (caja de tecnopor con packs de hielo) a una temperatura inicial, que oscilaba al laboratorio (duración del viaje: 20 entre 48 °C y 49 °C, hasta obtener una min). Los grupos formados fueron: temperatura final de 41 °C-42 °C. En el extremo de la vagina artificial se colocó 1) Grupo EZ-24: 5 ml de semen + 5 ml de un whire pack (bolsa de colección), el dilutor EZ para ser evaluado a las 24 horas; cual fue protegido por una membrana 2) Grupo EP-24: 5 ml de semen + 5 ml de oscura y aseguradas ambas con un dilutor EP para ser evaluado a las 24 horas; cinta. Finalmente, se lubricó la vagina artificial en la porción distal con gel no 3) Grupo LD-24: 5 ml de semen + 5 ml de espermicida. dilutor LD para ser evaluado a las 24 horas; 4) Grupo EZ-48: 5 ml de semen + 5 ml de Momentos antes de la colección, se dilutor EZ para ser evaluado a las 48 horas; identificaba una yegua en celo a fin de que el potro se estimulara con mayor 5) Grupo EP-48: 5 ml de semen + 5 ml de rapidez. A la yegua se le colocaba una dilutor EP para ser evaluado a las 48 horas; traba a nivel de la cuartilla de uno de los 6) Grupo LD-48: 5 ml de semen + 5 ml de miembros posteriores y se le vendaba dilutor LD para ser evaluado a las 48 horas. y amarraba la cola en dirección 106 Científica 8 (2), 2011
  25. 25. Evaluación de tres dilutores para la refrigeración de semen de caballo peruano de paso y sus efectos sobre la motilidad espermática e integridad funcional de la membranaUna vez en el laboratorio, se 1.7.1 Motilidad espermáticaprocedió a evaluar la motilidad,concentración e integridad funcional Se utilizó el método subjetivode membrana. Tras determinar la para determinar el porcentaje deconcentración espermática, se realizó espermatozoides motiles. Con unala segunda dilución en cada uno de pipeta pasteur, se tomó una pequeñalos grupos, hasta llegar a 25 – 50 x 106 muestra de semen y se la colocó enespermatozoides/ml correspondiente una lámina portaobjetos temperadaa la dosis espermática para en una platina a una temperaturainseminación artificial en equinos con aprox. de 37 °C. Sobre esta muestrasemen refrigerado (12). Para refrigerar se colocó una lámina cubreobjetoslas muestras seminales diluidas, se (también temperada) y se observó alempleó el Equitainer®, el cual es un microscopio a 100X. Los resultadoscontenedor que permite el enfriamiento fueron expresados en porcentajeinicial lento (a 0,3 °C/min) hasta llegar de espermatozoides motiles cona una temperatura final de 4 °C a 6 °C respecto al total de espermatozoidesdurante 48 horas (13). observados en diversos campos.1.6 Dilutores 1.7.2 Integridad funcional de membranaLos dilutores utilizados fueron: 1)EZ (E-Z Mixin - Animal Reproduction Para evaluar la integridad funcional deSystem), formulado en base a leche membrana se realizó el test hiposmóticodescremada en polvo, glucosa, sólidos (HOST). Se preparó un medio deno grasos y sulfato de amikacina; sacarosa diluido en agua bidestilada2) EP (Equipro - Minitüb), formulado (18 g/l) (14). En un tubo Eppendorf, seen base a caseinatos específicos, colocaron 1 ml de la solución preparadaproteínas de suero de leche, amplio y 100 μl de semen, para ser incubadosrango de azúcares, sin antibióticos en una estufa durante 30 minutos ani leche descremada; y 3) LD (Leche 37 °C. Posteriormente, se contaron endescremada Gloria), leche fresca promedio 100 espermatozoides, losUHT, descremada, súper light, 0% cuales fueron clasificados como HOS+grasas, con vitaminas A, C, D y E. El (membrana citoplasmática funcional,efecto de dilutores sobre la motilidad con la cola espermática hinchadaespermática y la integridad funcional y/o doblada) o HOS- (membranade membrana fue evaluado a las 0, 24 citoplasmática dañada, con la colay 48 horas de refrigeración. espermática recta) (figura 4). Los resultados se expresan en porcentaje1.7 Evaluación del semen de espermatozoides HOS+, es decir, con la membrana espermática funcional.Tabla 1. Porcentaje de motilidad espermática posrefrigeración con diferentes dilutoresa las 0, 24 y 48 horas Muestras seminales Con dilutor Horas Sin dilutor Leche descremada E-Z Mixin - ARS (CST) EquiPRO - Minitüb Gloria X ± DS X ± DS X ± DS X ± DS 0 74.29 ± 1.82 - - - 24 - 32.71 ± 20.29 (ab) 43.29 ± 20.84 (a) 23.36 ± 19.00 (b) 48 - 7.93 ± 6.78 (ab) 12.50 ± 12.05 (a) 2.71 ± 3.20 (b)** En las comparaciones horizontales, letras diferentes implican diferencias significativas (P ≤ 0,05). Científica 8 (2), 2011 107
  26. 26. Verónica Orozco Chávez, Manuel Rosemberg Barrón, Alexei Santiani Acosta, Humberto Rodríguez LandeoartÍculOs Originales rESUlTadOS Y dISCUSIóN descremada (0% grasas) y vitaminas El objetivo del presente estudio fue A, C, D y E; no se le añadió ningún evaluar el efecto de tres tipos de otro compuesto extra. Los resultados dilutores sobre la calidad seminal, luego obtenidos coinciden con los de Pagl de ser sometidas las muestras a un y col. (2006) (7), quienes observaron proceso de refrigeración por 48 horas. que el dilutor EP fue superior a Los parámetros evaluados fueron la dilutores formulados en base a leche motilidad espermática y la integridad descremada en los procesos de funcional de la membrana celular, refrigeración de semen de caballos medida mediante el test hiposmótico. (3), como consecuencia de sus compuestos. Cabe destacar que las proteínas presentes en la leche otorgan Inicialmente, tras colectar el semen de protección a los espermatozoides los potros seleccionados, se evaluó la frente a las bajas temperaturas (17, calidad del semen momentos antes 18). Por tal motivo, es un compuesto de realizar las primeras diluciones. común en la formulación de dilutores Los principales parámetros evaluados de semen. Pese a esto, la disminución fueron la motilidad espermática, de la motilidad espermática a partir de la concentración espermática y el las 24 horas de refrigeración pudo ser volumen seminal libre de gel, en consecuencia de la ausencia de otros los cuales se obtuvieron valores de compuestos tales como antibióticos, 72%, 130 x 106 espermatozoides/ glucosa, bicarbonato de sodio u otros, ml y 56 ml, respectivamente. Estas los cuales permitirían cumplir la función características son similares a las de un dilutor eficiente (3, 19, 20, 21) descritas anteriormente para muestras al crear un medio capaz de conservar seminales de caballo peruano de paso la motilidad progresiva, así como de obtenidas por Donayre (1987) (10), ofrecer mejores índices de concepción Borgesa (2004) (15), Vásquez (2005) frente a la leche descremada sin otro (16) y Ruiz (2001) (11). compuesto (22). Todas las muestras de motilidad Existen diversos estudios en los que espermática obtenidas en el presente se indica la eficiencia del dilutor EZ. estudio, al inicio, tuvieron un porcentaje Frand y col. (1987) (23) almacenaron adecuado de alrededor del 75%. Se una muestra de semen diluido con el observó una notoria disminución de dilutor E-Z Mixin a 20 °C por 24 horas, motilidad a las 24 y 48 horas. y obtuvieron una motilidad del 19%. Pickett y Amann (1987) (24) evaluaron En la evaluación a las 24 horas, dos tratamientos de semen diluido la motilidad del grupo EP fue con E-Z Mixin a 20 °C, los cuales significativamente mayor (P < 0.01) fueron almacenados durante 34 y 48 en comparación con el grupo LD. Esta horas, y obtuvieron una motilidad del misma tendencia se observó a las 48 23% y el 15%, respectivamente. En horas. El grupo EZ fue similar (P > ambos estudios, los autores señalaron 0.05) al grupo EP y LD, tanto a las 24 que las diferencias obtenidas entre como a las 48 horas. Esta semejanza experimentos pueden deberse a la entre los dilutores EP y EZ, a partir de edad de los animales y/o a la inherente las 24 horas de refrigeración, pudo ser variación que puede haber en las consecuencia de la similitud de los metodologías experimentales. En compuestos con los cuales han sido relación con los resultados obtenidos formulados. El EZ está formulado en en el presente estudio, a las 24 horas, base a leche descremada en polvo fue mayor la motilidad espermática y glucosa (3), sólidos no grasos y obtenida por Frand y col (1987) (23); sin sulfato de amikacina. El dilutor EP, embargo, existe una ligera disminución por su parte, está formulado en base a las 48 horas de refrigeración si se a caseinatos específicos, proteínas de compara con los resultados obtenidos bajo peso molecular y un amplio rango por Pickett y Amann (1987) (24). de azúcares. No contiene antibióticos Esto pudo ser consecuencia de la ni leche descremada (6). El dilutor temperatura de refrigeración, ya que LD, en cambio, solo contenía leche 108 Científica 8 (2), 2011

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