Cientifica 7 2

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Cientifica 7 2

  1. 1. UNIVERSIDAD CIENTÍFICA DEL SUR DIRECTORIO Ing. Jorge Chávez Salas Ing. José Dextre Chacón Decano de la Facultad de Administración de Turismo Sostenible y Hotelería Presidente del Directorio RECTOR Ing. Juan Guerrero Barrantes Decano de la Facultad de Ingeniería y Gestión Ambiental Dr. Agustín Iza Stoll Dra. Josefina Takahashi Sato AUTORIDADES Decana de la Facultad de Negocios Agro-Forestales Mg. Roland Leidinger Ayllón Dra. Laurietz Seda Ramírez Vicerrector Académico y Gerente General Decana de la Facultad de Artes Escénicas y Literatura Dr. José Amiel Pérez Ing. Zandra Rivera Chávez Vicerrector de Investigación Directora de la Facultad de Ingeniería de Sistemas Empresariales MBA. Rafael Su-Nobrega Arima Gerente Pregrado Mg. Larissa Bálsamo Fasce Directora de la Carrera de Psicología MA. Tulio Pita Chávarri Gerente Postgrado Mg. Humberto Espinosa Ariza Director de la Carrera de Administración MBA. Jaime Tamashiro Tamashiro de Negocios Internacionales Director Central de Administración y Finanzas Mg. Nilda Escobedo Rojas Dr. Agustín Iza Stoll Directora de la Carrera de Marketing y Administración Decano de la Facultad de Medicina Humana Mg. Jenny Canales Peña Directora de la Carrera de Comunicación y Publicidad Ing. Jorge Ponce Urquiza Decano de la Facultad de Ingeniería Abg. Mariano Castro Sánchez-Moreno Económica y de Negocios Director de la Carrera de Derecho Dr. Rodolfo Valdivia Maibach Arq. Ignacio Pacheco Díaz Decano de la Facultad de Estomatología Director de la Carrera de Arquitectura y Urbanismo Ambiental Dra. Luzmila Troncoso Corso Decana de la Facultad de Nutrición y Dietética Lic. Gustavo Luján Zumaeta Director de Propuesta Educativa Dr. Manuel Rosemberg BarrónDecano de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia Lic. Mariza Ríos Olivera Directora de Servicios Académicos Ing. José Carlos Dextre Chacón Decano de la Facultad de Ingeniería Dr. Emilio Guija Poma de Sistemas Empresariales Director del Instituto de Investigación Dra. Sonia Valle Rubio Percy Encinas Carranza Decana de la Facultad de Biología Marina y Econegocios Director del Centro Cultural y del Fondo Editorial
  2. 2. CIENTÍFICA Revista CIENTÍFICA Vol 7 Nº2, mayo-agosto 2010DirectorDr. José Amiel PérezVicerrector de investigaciónUniversidad Científica del Surjamiel@ucsur.edu.peComité EditorialDr. Emilio Guija PomaDirector del Instituto de InvestigaciónUniversidad Científica del Sureguijap@hotmail.comDr. Pedro Mendoza AranaDecano de la Facultad de Medicina HumanaUniversidad Científica del Surdecamed@ucsur.edu.peDr. Felipe Antonio San Martín HowardPresidente del Consejo deGestión de la InvestigaciónUniversidad Nacional Mayor de San Marcosfsanmartinh@unmsm.edu.peDr. Óscar Valiente CastilloDecano de la Facultad de MedicinaUniversidad San Antonio Abad del Cuzcoosvacal18@yahoo.esAsesora de diseño: Erika KohatsuAsistente de prensa: Rodrigo SalazarCorrectora de estilo: Diana Zapata PrattoDiseño y diagramación: Estudio Ojo GráficoCIENTÍFICA, revista de ciencias de la UniversidadCientífica del Sur, publica tres números al año.La revista está dirigida a investigadores científicos,docentes y estudiantes universitarios.La Universidad Científica del Sur no se solidariza necesariamentecon las opiniones expresadas en los artículos publicadosen esta edición de CIENTÍFICA. Se autoriza la reproducciónde los textos siempre que se cite la fuente.revistacientifica@ucsur.edu.peFondo Editorial. Universidad Científica del Sur.Cl. Cantuarias 398. Miraflores. Lima 18, Perú.Tel.: +511 6106400 anexo 164Tiraje: 600 ejemplares.Hecho el depósito legal en la Biblioteca Nacional del Perú:Nº 2008-15522 / ISSN: 1997-700X
  3. 3. CIENTÍFICACONTENIDORevista Científica Vol 7 Nº2, mayo-agosto 2010. COMITÉ CIENTÍFICO 108 EDITORIAL 109 ARTÍCULOS ORIGINALES IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS NATIVAS QUE DEGRADAN HIDROCARBUROS: BIORREMEDIACIÓN EN SUELOS CONTAMINADOS CON «BORRAS» MEDIANTE LA TÉCNICA DE COMPOSTAJE DENTIFICATION OF NATIVE BACTERIA THAT DEGRADE HYDROCARBONS: BIOREMEDIATION IN SOILS CONTAMINATED WITH «BORRAS» USING THE COMPOSTING TECHNIQUE Pierina Guillén 110 PURIFICACIÓN Y PROPIEDADES DE UNA FOSFATASA ÁCIDA DE BAJO PESO MOLECULAR DE HÍGADO DE ALPACA (Lama pacos) PURIFICATION AND PROPERTIES OF A LOW MOLECULAR WEIGHT ACID PHOSPHATASE FROM ALPACA LIVER (Lama pacos) Emilio Guija Poma 122 OCURRENCIA DE ECTOPARASITISMO DE Amblyomma rotundatum KOCH, 1844 (ACARI: IXODIDAE) EN Bufo marinus LINNAEUS, 1758 OCURRENCE OF ECTOPARASITISM OF Amblyomma rotundatum KOCH, 1844 (ACARI: IXODIDAE) ON Bufo marinus LINNAEUS, 1758 Gianmarco Rojas 130 ARTÍCULOS DE REVISIÓN LA INTEGRACIÓN DE LA SALUD Y EL AMBIENTE EN LAS POLÍTICAS PÚBLICAS: EVITANDO LA CONTAMINACIÓN DEL AIRE HEALTH AND ENVIRONMENTAL INTEGRATION IN PUBLIC POLICIES: PREVENTING AIR POLUTION Mariano Castro 138 TENDENCIAS Y DESAFÍOS DE LA INNOVACIÓN Y EL ROL DE LAS UNIVERSIDADES PRIVADAS EN EL PERÚ TRENDS AND CHALLENGES OF INNOVATION AND THE ROLE OF PRIVATE UNIVERSITIES IN PERU Zandra Rivera 148
  4. 4. ISSN 1997-700XLA EDUCACIÓN EN EL PERÚ: LA IMPORTANCIA DE LA INVERSIÓNEN EDUCACIÓN COMO PORCENTAJE DEL GASTO PÚBLICO 1936-2007, UNA CARACTERIZACIÓN EMPÍRICAEDUCATION IN PERU: THE IMPORTANCE OF INVESTMENT INEDUCATION AS A PERCENTAGE OF GOVERNMENT EXPENDITURE.1936 - 2007, AN EMPIRICAL CHARACTERIZATION.José Ignacio Pacheco Díaz 158LA PROPUESTA METODOLÓGICA DE KARL POPPERTHE METHODOLOGICAL PROPOSAL OF KARL POPPERJosé Eduardo Rosales Trabuco 164CARTAS AL EDITORPROYECTO MAMI-DIGITAL: UNA PROPUESTA PARA DISMINUIRLA MUERTE MATERNA Y PERINATAL UTILIZANDO NUEVASTECNOLOGÍAS DE INFORMACIÓN Y COMUNICACIÓN (NTIC)Alberto Zapata 172DIFERENCIAS MORFOLÓGICAS DE NÓDULOS DE Rhizobium Y SURELACIÓN CON LA PRODUCTIVIDAD DE CULTIVOS DE ARVEJAPisum sativumMilvio Casaverde Río 178TESISEL PUNTAJE DE LUND-MACKAY Y SU CORRELACIÓN CLÍNICA SEGÚNEL TIPO DE RINOSINUSITIS, HOSPITAL MILITAR CENTRAL 2009Yanina Bazán Ponte 192SALA CABIESESEL DESAFíOFernando Cabieses 204NOTAS 210INFORMACIÓN PARA LOS AUTORES 214
  5. 5. COMITÉCIENTÍFICODr. Paul SchillerDepartamento de Bioquímica y Biología CelularUniversidad de Miami – EE.UUDr. Emilio GuijaVicerrectorado de InvestigaciónUniversidad Científica del SurDr. Ricardo Caballero MerinoJefe de servicios de Obstetricia y GinecologíaHospiten Rambla-EspañaProf. Ramsés SalasFacultad de Ciencias Naturales y MatemáticasUniversidad Nacional Federico VillarrealDr. Javier EncisoVicerrectorado de InvestigaciónUniversidad Científica del SurDr. James GrahamDepartamento de Farmacognosis. Facultad de FarmaciaUniversidad de Illinois en Chicago – EE.UUDr. Alejandro BurgaFacultad de Medicina HumanaUniversidad Científica del SurDr. Pedro San Martín HowardJefe del Departamento de PediatríaHospital Nacional Dos de MayoIng. Óscar PaibaFacultad de Ingeniería de Sistemas EmpresarialesUniversidad Científica del SurDra. Nancy LozanoFacultad de Farmacia y BioquímicaUniversidad Nacional Mayor de San MarcosIng. Juan Guerrero BarrantesFacultad de Ingeniería y Gestión AmbientalUniversidad Científica del SurIng. José DávilaFacultad de Ingeniería de Sistemas EmpresarialesUniversidad Científica del Sur CIENTÍFICA se encuentra indizada en Latindex
  6. 6. EDITORIALLos métodos de investigación en la cienciaLos procedimientos que utilizan las ciencias para validar los conocimientos que ella reconoce hansido motivo de diversos comentarios y base para la presentación de interesantes teorías acerca de lavalidez de los métodos de la ciencia.En este número de nuestra revista se publica el artículo «La propuesta metodológica de KarlPopper», en el que José Eduardo Rosales Trabuco revisa los conceptos que Karl Popper elaboróy expuso desde sus notas iniciales, en 1934, hasta los trabajos finales que han sido editados ycomentados incluso en el presente siglo.En el artículo mencionado se comentan sus criterios sobre demarcación y conceptos que explicandetalladamente la falsación. Contrariamente al positivismo de Compte, Popper no acepta comoválidos los procedimientos inductivos que aplicamos para comprobar las afirmaciones científicasque queremos demostrar como realmente verídicas. En cambio, propone sus teorías fundadas en losintentos de falsación de las hipótesis que, en vez de verificarse, deben someterse a una exhaustivabúsqueda de fallas para convertirse, así, en «verdades más profundas y permanentes».Con Mario Bunge, aceptamos como método de la ciencia la definición del problema, la formulaciónde la hipótesis de trabajo y su comprobación, utilizando procedimientos que, para el caso de lasciencias fácticas, necesariamente deberán hacerse con hechos y que tienen la virtud de mostrarlas limitaciones de los nuevos conocimientos así adquiridos, confirmando su temporalidad ypermitiéndonos reconocer que, además de transitorios, son contextuales.Este reconocimiento hace posible y estimula el desarrollo de la ciencia, la tecnología e innovación,cuyos aportes se vienen utilizando en favor del bienestar del hombre, quien ve, así, un progresocontinuo y optimista de la condición humana, con la esperanza de un futuro renovado y adecuadoal inexorable crecimiento y expansión del género humano.El desarrollo de la tecnología de información y de los sistemas, que cuentan con un increíble soportede computadoras y sus sorprendentes software, permiten manejar muchas más variables que lasdos fundamentales de siempre, causa y efecto, y ya no es imprescindible reducir tanto el númeroamplio de variables presentes en un problema científico y su solución, a solamente unas cuantasvariables relevantes. Hoy en día, se incorporan múltiples variables, tan importantes y numerosas,que podemos afirmar, sin duda alguna, que las variables constituyen la unidad fundamental delMétodo Científico. Estamos seguros de que este debate, estimulado de manera inequívoca porPopper, continuará. Y nuestra revista está dispuesta a recibir aportes acerca del tema. Dr. José Amiel Pérez Director
  7. 7. ARTÍCULOSORIGINALESIDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS NATIVASQUE DEGRADAN HIDROCARBUROS:BIORREMEDIACIÓN EN SUELOSCONTAMINADOS CON «BORRAS» MEDIANTELA TÉCNICA DE COMPOSTAJEIDENTIFICATION OF NATIVE BACTERIA THAT DEGRADEHYDROCARBONS: BIOREMEDIATION IN SOILS CONTAMINATEDWITH «BORRAS» USING THE COMPOSTING TECHNIQUEPierina Elizabeth Guillén Zubiate1, Juan Guerrero Barrantes 11 universidad nacionaL agraria La MoLina. departaMento de sueLos
  8. 8. Identificación de bacterias nativas que degradan hidrocarburos: biorremediación en suelos contaminados con «borras» mediante la técnica de compostajeRESUMENEn esta investigación se realizaron removal from the soil, while in the seconddos pruebas de biorremediación en bioremediation test —Proof of composting—suelos contaminados con hidrocarburo, was observed that after 86 days, all biopilesprovenientes de la Refinería Conchán. presented between 95% to 99% removal ofInicialmente, en el laboratorio, se logró hydrocarbon and the TPH levels were belowaislar e identificar bacterias y hongos the limits of oils and fats determined by thedel hidrocarburo pesado (con 17 a 19 regulations of the Ministry of Energy andgrados API), se determinó su actividad Mines of Peru. Therefore we can concludedegradativa y emulsificante, así como se that for this research, the compostingseleccionó el «consorcio bacteriano selecto» technique was the best treatment forque fue utilizado en las dos pruebas de hydrocarbon contaminated soil.biorremediación. En cuanto a los resultados, Key words: bioremediation, composting,en la primera prueba de biorremediación terrariums, borras.—Prueba en terrarios—, se observó en elterrario número cinco (T5) que a los 90 días seobtuvo el 79% de remoción del hidrocarburo INTRODUCCIÓNdel suelo; mientras que en la segunda La Refinería Conchán se encuentra ubicadaprueba de biorremediación —Prueba de al sur de la ciudad de Lima, en el kilómetrocompostaje—, se observó que todas las 38 de la carretera Panamericana Sur y estábiopilas a los 86 días presentaron entre 95% orientada a la producción de asfaltos yy 99% de remoción del hidrocarburo y los combustibles.niveles de TPH estuvieron por debajo de loslímites de aceites y grasas determinados Particularmente importante fue quepor la normativa del Ministerio de Energía y los residuos industriales de la refineríaMinas de Perú. Con lo que se puede concluir provinieron de la limpieza del fondo deque, para esta investigación, la técnica de los tanques de almacenamiento de crudocompostaje fue el mejor tratamiento para el y pozas de recuperación, de la mezclasuelo contaminado con hidrocarburo. heterogénea de hidrocarburos con sólidos y agua entrampada como subproducto comúnPalabras clave: biorremediación, compostaje, de la producción de crudos, o mezcladasterrarios, borras. con compuestos inorgánicos formados por arenas, arcillas, lodos provenientesABSTRACT del pozo y polvos finos que llegan al crudo en la superficie por acción del viento,In this research, two tests have been carried en suelos expuestos a concentracionesout concerning to the bioremediation of tóxicas de petróleo, etc. Estos residuoscontaminated soils with hydrocarbon from industriales fueron depositados desde 1989Conchan’s Refinery. At a beginning in the aproximadamente en dos grandes «pozaslaboratory investigation we got to isolate and de borra», dispuestas en el suelo de un cerroidentify bacteria and fungus from the heavy cercano (figura 1).hydrocarbon (with a 17 to 19 API degree).It was determined their degradative and La Refinería Conchán brindó las muestrasemulsifier activity, in the same way the “select de hidrocarburo de las «pozas de borra»bacterial consortium” was selected and used y la investigación estuvo enfocada enin the two bioremediation tests. As for the la obtención de un consorcio de cepasresults, in the first test of bioremediation bacterianas y hongos con el objetivo de—Test in terrariums—, was observed in utilizarlas en la biorremediación de suelosterrarium number five (T5), that after 90 contaminados con borras mediante ladays it was obtained 79% of hydrocarbon técnica de compostaje. Científica 7 (2), 2010 111
  9. 9. Pierina Elizabeth Guillén Zubiate, Juan Guerrero BarrantesARTÍCULOS ORIGINALES Largo promedio: 50,5 m Ancho promedio: Poza 2 15,6 m Profundidad: Poza 1 0,87 m Largo promedio: 48,1 m Ancho promedio: 16,2 m Profundidad: 0,75 m Figura 1. pozas de borra ubicadas dentro de La refinería conchán MATERIALES Y MÉTODOS de cultivo Bushnell-Haas (BH) solidificado con agar (1), y se utilizó luz ultravioleta 1. Pruebas de laboratorio como medio de esterilización durante el a. Aislamiento e identificación de desarrollo de la siembra. Se incubaron a bacterias y hongos de la borra temperatura de 30-34 ºC. Los hongos no fueron centrifugados. Se seleccionaron Se realizó la evaluación fisicoquímica del las placas que tuvieron mayor actividad hidrocarburo. Del hidrocarburo se aislaron degradativa (consorcio bacteriano selecto), bacterias y hongos en caldo Tripticasa según «los criterios cualitativos de actividad Soya (TSB) y fueron incubadas a 42 °C degradativa» determinados durante la por 24 horas hasta obtener crecimiento. observación, por los cambios generados de Luego se ejecutaron diluciones hasta 1:104 las bacterias y hongos en medio de cultivo unidades formadoras de colonias (UFC)/gr BH con hidrocarburo «borra». y fueron sembrados en agar nutritivo y en medios de cultivos selectivos para bacterias Para la calificación de la actividad degradativa, (agar Cetrimide, agar Pseudomona P, agar se dio una calificación alta a las cepas que Pseudomona F, agar Plate-Count y agar presentaron más de tres períodos del proceso Sabouraud) por duplicado, y se incubaron de desarrollo de la actividad degradativa por a 37 ºC por 24-48 h. Para los hongos, se demostrar mayores reacciones degradativas. sembraron en agar Sabouraud incubadas Luego se realizó una comparación de la a 48 horas. Se realizó el conteo de número actividad emulsificante de las bacterias que de colonias, reportándose en UFC/gr. presentaron una alta calificación de actividad Seguidamente, se realizó la caracterización degradativa (2). Seguidamente, se utilizó la microscópica y macroscópica de las cepas técnica API 20 NE para la caracterización de bacterianas y se realizó la evaluación algunas bacterias (3). bioquímica de las cepas bacterianas para 2. Prueba de campo determinar enterobacterias. Se realizó también la característica microscópica y a. Prueba de terrarios en arena macroscópica de las cepas de hongos. Se acondicionaron seis terrarios de arena b. Actividad degradativa, emulsificante sin hidrocarburo (4), con sus respectivas y aplicación de la técnica del American repeticiones y se les agregaron diferentes Petroleum Institute (API 20 NE) proporciones de nutrientes (5) (nitrógeno y fósforo: (NH4)2SO4 y K2HPO4), agua, solución Para la evaluación de la actividad salina (SS) e hidrocarburo (borra). Luego se degradativa, las cepas reactivadas fueron colocaron en el terrario 3, terrario 4, terrario centrifugadas a 7.000 rpm por 10 minutos 5 y terrario 6 diferentes cantidades de pellets a 6 °C. Los pellets obtenidos se inocularon con bacterias y hongos con solución salina en cantidades de 100 µl y 50 µl en el medio (tabla 1 y figura 2). 112 Científica 7 (2), 2010
  10. 10. Identificación de bacterias nativas que degradan hidrocarburos: biorremediación en suelos contaminados con «borras» mediante la técnica de compostaje tabLa 1. contenido de cada terrario Suelo Borra Pellet SS Nutrientes Agua N° Terrarios (gr) (gr) (ml) (ml) (ml) (ml) Terrario N° 1 3.000 75 0 150 0 261,4 Componente N°1 Terrario N° 1,1 3.000 75 0 150 0 261,4 Terrario N° 1 3.000 75 0 150 261,4 0 Componente N°2 Terrario N° 2,1 3.000 75 0 150 261,4 0 Terrario N° 3 3.000 75 150 0 261,4 0 Terrario N° 3,1 3.000 75 150 0 261,4 0 Terrario N° 4 3.000 75 150 0 261,4 0 Terrario N° 4,1 3.000 75 150 0 261,4 0 Componente N°3 Terrario N° 5 3.000 75 150 0 261,4 0 Terrario N° 5,1 3.000 75 150 0 261,4 0 Terrario N° 6 3.000 75 150 0 261,4 0 Terrario N° 6,1 3.000 75 150 0 261,4 0 Figura 2. terrarios en arenaDurante los tres meses que duró la prueba, estiércol de vaca, fermentándolo antes de sucada tres días se agregaron 100 ml de agua uso (tabla 2).a cada terrario y se removió manualmentepara oxigenar al sistema. tabLa 2. cantidad en kg de insuMos requeridos en cada biopiLa de coMpostb. Prueba de compostSe utilizó el sistema de compostaje abierto, Peso por Cantidad de Total de Insumoque es el más tradicional, en el que los carretilla carretillas insumos (kg)sustratos a compostar se disponen en pilas Estiércol de vaca 55 kg 5 275 kgque pueden estar al aire libre o cubiertas. Caña 30 kg 3 90 kgLas biopilas de compost tuvieron un volumen Brócoli 50 kg 2 100 kgde 1 m3 y las medidas de las pozas fueron:2,3 m (ancho) x 8,3 m (largo) y 1 m. El suelo Paja de maleza seca 34 kg 7 238 kgse niveló, compactó y las biopilas fueron Total Insumos 703 kgrevestidas con una geomembrana. Se utilizó Científica 7 (2), 2010 113
  11. 11. Pierina Elizabeth Guillén Zubiate, Juan Guerrero BarrantesARTÍCULOS ORIGINALES La prueba consistió en la formación de seis Para el armado de las biopilas se demarcó biopilas de compost. La primera biopila el área de la base de la biopila con tallos fue el control y a las cinco restantes se les secos de caña (tres carretillas), se colocó aplicaron diferentes proporciones de «borra» en el centro de la base de la biopila un y solamente a dos de estas biopilas se aplicó tronco de bambú y se incorporó como el tratamiento de bioaumentación (tabla 3). base una mezcla de tres carretillas de paja seca, encima dos carretillas de estiércol y tabLa 3. proporciones de borra para cada biopiLa una carretilla de brócoli. Luego, se echaron dos carretillas de estiércol mezclada con Descripción de Biopila (%) Código Borra kg una parte de la borra requerida; sobre esto las biopilas en 1 m3 se colocó una carretilla de estiércol con la Co Biopila control 0 0 última cantidad de la borra. Finalmente, se terminó con tres carretillas de paja, CB1 Biopila con borra 25 kg 2,5% hasta completar la altura de 1 m. Se retiró y mas bioaumentación el tronco de bambú al día siguiente del C1 Biopila con borra 25 kg 2,5% armado de la biopila (figura 3). Biopila con borra CB2 50 kg 5% y mas bioaumentación C2 Biopila con borra 50 kg 5% C3 Biopila con borra 75 kg 7,5% vertido de paja seca, estiércoL, brócoLi vertido deL hidrocarburo (borra) Figura 3. arMado de Las biopiLas Luego, las biopilas se humedecieron bacteriano selecto. Se siguió el mismo quincenalmente y fueron volteadas cada procedimiento para la obtención de pellets 30 días para mejorar la oxigenación y que fue desarrollado en la «prueba de homogenización del material compostado. degradación del hidrocarburo en terrarios», Los resultados estuvieron en función de con la diferencia de que se preparó mayor la medición de la temperatura, pH para la material bacteriano. Se obtuvieron 358 ml obtención del compost, población bacteriana de cada cepa bacteriana en solución salina y la degradación de los hidrocarburos totales y se incorporaron a las biopilas luego del de petróleo (TPH). volteo. Consecuentemente, se regaron las biopilas para controlar la humedad durante Bioaumentación el proceso de volteo (figura 4). Se seleccionaron dos biopilas (CB1 y CB2), a las cuales se les agregó el consorcio 114 Científica 7 (2), 2010
  12. 12. Identificación de bacterias nativas que degradan hidrocarburos: biorremediación en suelos contaminados con «borras» mediante la técnica de compostaje peLLet para La bioauMentación agregado deL consorcio bacteriano a Las biopiLas Figura 4. bioauMentaciónSe volvió a colocar la caña de bambú en la Se identificaron seis cepas de hongosbiopila para mantener aireado el sistema de que fueron clasificadas según génerocompostaje y, al cumplir los 120 días que taxonómico: el género Rhizopus (códigosduró la prueba, el material que componía el h33, h38 y h39) y el género Aspergilluscompost ya se encontraba descompuesto y (códigos h28, h36 y h30).de color marrón oscuro, lo que supone unaaceleración de la descomposición de los De la prueba de actividad degradativa conhidrocarburos. 100 µl de cepas bacterianas en medio Bushnell-Haas se seleccionaron cuatro cepas bacterianas (cepa B9.2 con 1.397RESULTADOS unidades de actividad emulsificante (UAE)/ ml; cepa B1 con 1.029 UAE/ml; cepa B9.1a. Resultado de la prueba de laboratorio con 0.936 UAE/ml y cepa B15 con 0.909Se clasificó al hidrocarburo de las pozas de UAE/ml) que presentaron mayor actividadborra según su peso API (American Petroleum degradativa y emulsificante del hidrocarburo.Institute) y registró en promedio de 17 a 19 También se observó que nueve cepasgrados API. Asimismo, según el método de (cepas B2, B35, B5, B12, B7, B24, B14, B10referencia de la EPA (Environmental Protection y B11) alcanzaron una mediana actividadAgency), el análisis cromatográfico obtuvo degradativa (figura 5). Estas 13 cepas151,495 mg/kg (15%) de hidrocarburos totales bacterianas (consorcio bacteriano selecto),de petróleo, lo cual confirma que las pozas de fueron consideradas para la prueba enborra contienen hidrocarburo pesado. terrarios y prueba de compost. Prueba de actividad degradativa y emulsificante con 100 µl de cepas bacterianas 4 Período de la actividad degradativa 3 2 1,397 1,029 0,936 0,909 1 0,683 0,527 0,466 0,3 0,208 0,214 0,11 0,078 0,088 0 B9.2 B1 B9.1 B15 B2 B35 B5 B12 B7 B24 B14 B10 B11 (alta AD) (alta AD) (alta AD) (alta AD) (media AD) (media AD) (media AD) (media AD) (baja AD) (baja AD) (baja AD) (baja AD) (baja AD) Calificación de la actividad degradativa de las cepas bacterianas Períodos de actividad degradativa (AD) Actividad emulsificante Figura 5. Cepas baCterianas (100 μl) Con mayor aCtividad degradativa y emulsifiCante Científica 7 (2), 2010 115
  13. 13. Pierina Elizabeth Guillén Zubiate, Juan Guerrero BarrantesARTÍCULOS ORIGINALES Al consorcio bacteriano selecto se le aplicó la (H37, H26, H34, H38, H36 y H33) que no técnica API 20 NE, identificándose solo cuatro presentaron ninguna reacción. Del genero especies de cepas bacterianas: las especies Rhizopus, la cepa H39 tuvo baja actividad Aeromonas salm. Masoucida/achromogenes degradativa, y nula actividad degradativa las (cepa B1), Brevundimonas vesicularis (cepa cepas H33 y H38; y, del género Aspergillus B9.2), Agrobacterium radiobacter (cepa B15) con baja actividad degradativa son las y Burkholderia cepacia (cepa B5 y cepa B35). cepas H28 y H30 y, con nula actividad degradativa, la cepa H36. Se determinó también la actividad degradativa de los hongos en medio de b. Prueba de campo cultivo Bushnell Haas (BH) con borra, Prueba en terrarios donde se registraron seis hongos (H27, H28, H29, H30, H31 y H39) que presentaron Teniendo el TPH inicial y TPH final de las una calificación baja, por presentar solo muestras de terrarios evaluadas se determinó un período del proceso de desarrollo de el porcentaje de remoción del hidrocarburo la actividad degradativa; y seis hongos (figura 6). Porcentaje de remoción de TPH en cada terrario 80.00 75.00 70.00 65.00 60.00 55.00 50.00 45.00 40.00 35.00 30.00 25.00 20.00 15.00 10.00 5.00 0.00 Terrario N°1 Terrario N°1.1 Terrario N°2 Terrario N°2.1 Terrario N°3 Terrario N°3.1 Terrario N°4 Terrario N°4.1 Terrario N°5 Terrario N°5.1 Terrario N°6 Terrario N°6.1 Tratamientos de los terrarios TPH inicial (g/kg) TPH final (g/kg) Límites aceites y grasas 5g/kg MEM Porcentaje de remoción Figura 6. porcentaje de reMoción de tph en terrarios vs. norMativa peruana El mayor porcentaje de remoción de TPH una temperatura termofílica similar. A los se observó en los terrarios T5 (79%) y 30 días (primer volteo), la biopila control T5.1 (75%), los cuales fueron inoculados (Co) tuvo la temperatura más alta de 69,8 con el consorcio bacteriano selecto. Los °C; a diferencia de las demás biopilas, resultados fueron comparados con la que aumentaron su temperatura a los 52 normativa nacional vigente, con el criterio días (primer volteo), la biopila C1 a 58 °C del nivel de saneamiento de 5.000 mg/kg de y la CB1 a 68,7 °C. A los 66 días (segundo TPH (6). volteo) la temperatura bajó en la biopila Co (45,7 °C) y a los 122 días alcanzó 23,2 °C. Prueba de compost Las biopilas C1 y CB1 tuvieron una segunda El tiempo del seguimiento, control y fase termofílica a los 87 días en la biopila medición de la temperatura fue de 122 días. C1 (49,1 °C) y bajó más a los 101 días en la biopila CB1 (39,8 °C). Luego, a los 120 días En las biopilas Co, C1 y CB1: a los 15 días de la temperatura disminuyó más para las dos compostado, las tres biopilas presentaron biopilas (figura 7). 116 Científica 7 (2), 2010
  14. 14. Identificación de bacterias nativas que degradan hidrocarburos: biorremediación en suelos contaminados con «borras» mediante la técnica de compostaje Valor observado de temperatura en la biopila control, biopila C1 y biopila CB1 80 70 Valor observado de temperatura 60 50 40 30 20 10 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 Días de compostado T promedio (C°) control Fase Termofílica T° prom. en C1 T° prom. en CB1 Figura 7. variaCión temporal de la temperatura en las biopilas Co, C1 y Cb1En las biopilas Co, C2, CB2 y C3: a los 15 días volteo), en la biopila Co la temperatura llegóde compostado, las biopilas presentaron una a 45,7 °C y luego bajó a 23,2 °C a los 122temperatura termofílica similar. A los 30 días días. La biopila C2 a los 73 días presentó la(primer volteo) la biopila control (Co) tuvo la segunda fase termofílica con una temperaturatemperatura más alta de 69,8 °C, seguida por de 47,67 °C y, la biopila C3, a 42,4 °C. A losla biopila C2 (61,97 °C), y las demás biopilas 94 días, la biopila CB2 recién tuvo la faserecién aumentaron su temperatura a los 38 termofilica con una temperatura de 47,7 °C.días (primer volteo); en la biopila C3 (50,6 Luego, a los 120 días, la temperatura bajó°C) y CB2 (52 °C). A los 66 días (segundo para las dos biopilas (figura 8). Valor observado de temperatura en la biopila control, biopila C2, biopila CB2 y biopila C3 80 70 Valor observado de temperatura 60 50 40 30 20 10 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 Días de compostado T prom. (C°) control Fase Termofílica T° prom. en C2 T° prom. en CB2 T° prom. en C3 Figura 8. variaCión temporal de la temperatura en las biopilas C2, Cb2 y C3 Científica 7 (2), 2010 117
  15. 15. Pierina Elizabeth Guillén Zubiate, Juan Guerrero BarrantesARTÍCULOS ORIGINALES La variación de pH durante los días de 85 días reveló un aumento en la densidad compostado estuvo en el rango de 5,9 a poblacional de bacterias y una disminución 7,2 en las biopilas C1 y CB1; y de 5,9 a 7,5 en el nivel de TPH. El nivel de TPH alcanzó en las biopilas C2, CB2 y C3. La variación niveles menores de 5.000 mg/kg de TPH a de pH durante los días de compostado los 120 días (figura 8). Por tanto, se registró presentó similares valores. La evaluación el porcentaje de remoción a los 120 días y de TPH y de la densidad poblacional a los estuvo entre 98% a 99% de remoción del hidrocarburo (figura 9). Valor observado de TPH en cada biopila y el nivel de intervención de TPH del MEM 40000 35000 Valor observado de TPH 30000 25000 20000 15000 10000 5000 Biopila C Biopila CB1 Biopila C2 Biopila CB2 Biopila C3 Tipos de biopilas 31/03/2004 31 días 25/05/2004 86 días 28/06/2004 120 días Nivel de Intervención MEM Figura 9. variación teMporaL de La concentración de tph en cada biopiLa de coMpostaje Porcentaje de remoción de TPH en cada biopila 105% 100% Porcentaje de Remoción 95% 90% 85% 80% 75 % 31 días 86 días 120 días Tiempo del proceso de compost Biopila C1 Biopila CB1 Biopila C2 Biopila CB2 Biopila C3 Figura 10. porcentaje de reMoción de tph en cada biopiLa DISCUSIÓN requiere de una concentración mínima de Se aislaron bacterias y hongos de tres microorganismos específicos degradadores muestras de borra sólida, borra líquida 10 x 103 a 10 x 104 UFC/gr de suelo y de y borra con arena, obtenidas de dos organismos heterótrofos totales de 10 x 105 pozas de hidrocarburos ubicadas por a 10 x 106 UFC/gr de suelo (7). muchos años en la Refinería Conchán. La Para determinar si la bacteria puede supervivencia de bacterias puras en la fase usarse en la biorremediación, se evaluó de selección en condiciones de laboratorio la capacidad emulsificante y actividad sugiere que poseen capacidad para utilizar degradativa mediante la prueba en medio hidrocarburos alifáticos y aromáticos como Bushnell Haas (BH). En cuanto a su donadores de electrones. En el caso de capacidad emulsificante, se obtuvieron suelos contaminados con hidrocarburos, se cuatro mejores cepas bacterianas (cepas 118 Científica 7 (2), 2010
  16. 16. Identificación de bacterias nativas que degradan hidrocarburos: biorremediación en suelos contaminados con «borras» mediante la técnica de compostajeB9.2, B1, B9.1 y B15) con mayor actividad con la utilización de microorganismosdegradativa que también presentaron mayor autóctonos, previamente aislados desde elactividad emulsificante, determinándose medio contaminado, para ser reintroducidoscuantitativamente a través de la conversión masivamente (9).de la absorbancia en unidades actividademulsificante/ml. Asimismo, se obtuvieron El incremento en la densidad poblacionaldos cepas del género Chryseomonas que se considera una medida indirecta de lamostraron mejor actividad emulsificante actividad metabólica de la población (10,11),con 0,51 y 0,48 UAE/ml respectivamente. debido a que los hidrocarburos constituyenEn la tesis «Aislamiento e Identificación la fuente de carbono necesaria para elde cepas bacterianas biorremediadoras crecimiento microbiano, tal como lo señalay su evaluación sobre suelo contaminado Viñas (9), quien evaluó la capacidad decon petróleo crudo», de Prudencio (2002) degradación de hidrocarburos provenientes(8), se obtuvieron seis cepas con valores del petróleo mediante la caracterizaciónmayores de UAE con tres cepas de Bacillus microbiológica, química y ecotoxicológica.con 0,718; 0,679; 0,679 UAE/ml; una cepa La disminución del contenido de losde Pseudomonas con 0,683 UAE/ml; hidrocarburos totales se corresponde con elAcinetobacter con 0,707 UAE/ml y una cepa incremento de la densidad poblacional de losno identificada con 0,683 UAE/ml. heterótrofos mesófilos en los tratamientos.En nuestro trabajo se obtuvieron tres Es así que la densidad poblacional evaluadacepas con valores mayores de actividad durante tres etapas del proceso deemulsificante que fueron identificadas según compostaje permitió confirmar el aumentosu taxonomía: cepa de Brevundimonas poblacional de bacterias con la disminuciónvesicularis (cepa B9.2) con 1,397 UAE/ de TPH a los 85 días de transcurrido elml; cepa Aeromonas salm. Masoucida/ proceso de compostaje.achromogenes (cepa B1), con 1,029 UAE/ Se puede dar una aproximación según losml; y cepa Agrobacterium radiobacter (cepa resultados obtenidos en el presente trabajo:B15), con 0,909 UEA/ml. Así como una cepa con la incorporación de 75 kg de borra para 1no identificada (cepa B9.1), con 0,936 UAE/ m3 de biopila a los 120 días se obtuvo un nivelml. No se evaluó la actividad emulsificante de de TPH de 4.459 mg/kg, concentración quelos hongos porque no presentaron actividad está muy cerca de los niveles establecidosdegradativa en borras. por la normativa del MINEM. Es importanteDe las 27 cepas bacterianas aisladas de la destacar que, si se utilizara mayor cantidadborra se seleccionaron 13 cepas bacterianas en kilogramos de borra para un tratamientocon mejor actividad degradativa y mediante compostaje, podría sobrepasar losemulsificante, las cuales fueron sometidas a la límites establecidos por MINEM de 5.000prueba de degradación de borras en terrarios mg/kg de TPH (6).y a la prueba de degradación de borras con Con la prueba en terrarios se pudo determinarcompost, sin y con bioaumentación. que los niveles de hidrocarburos aromáticosLa prueba de los terrarios con arena policíclicos se encuentran presentes endeterminó la buena acción degradativa de cantidades muy altas, así como en la pruebalas 13 cepas bacterianas, que luego de 90 de compostaje se determinó que los nivelesdías bajaron la concentración de TPH en la de metales pesados se encuentran presentesarena. pero en pequeñas cantidades.En esta investigación, la prueba decompostaje que dio mejores resultados en CONCLUSIONESla disminución de TPH fue por el método de 1. El recuento bacteriano presentó unabioaumentación en compostaje. Al agregar dinámica poblacional distinta, en lamicroorganismos exógenos provenientes muestra de borra líquida (superficie de laespecialmente de la borra líquida con poza de borra) con 1,00 x 105 hasta 1,83una adecuada actividad degradativa y x 106 UFC/gr y en la muestra de borraemulsificante, se estimuló que el consumo sólida (profundidad de la poza de borra)del hidrocarburo fuera visible a los 31 días, con 7,30 x 105 hasta 1,74 x 106 UFC/gr.y a los 86 días ya los niveles de TPH seencontraron por debajo de los establecidos 2. La prueba de actividad degradativa parapor el Ministerio de Energía y Minas (MINEM). bacterias fue mayor cuando se inocularonPor tanto, una aproximación muy interesante 100 µl de cepas bacterianas en medioconsistió en combinar la bioestimulación de cultivo Bushnell Haas, de las cuales Científica 7 (2), 2010 119
  17. 17. Pierina Elizabeth Guillén Zubiate, Juan Guerrero BarrantesARTÍCULOS ORIGINALES se seleccionaron 13 cepas bacterianas hidrocarburo y, en la prueba de terrarios, con mayor actividad degradativa y a los 90 días solo se obtuvo entre 75 y emulsificante (UAE) identificadas como 79% de remoción del hidrocarburo. «consorcio bacteriano selecto». 6. En la prueba de terrarios no se logró 3. Se caracterizaron cuatro cepas disminuir, a los 90 días, los niveles de bacterianas con la técnica API 20 NE TPH para obtener un saneamiento menor y se las clasificó taxonómicamente: a los 5.000 mg/kg según la normativa cepa de Brevundimonas vesicularis, peruana para suelos contaminados con cepa Aeromonas salm. Masoucida/ TPH. Por tanto, el único terrario que achromogenes, cepa Agrobacterium presentó una mayor disminución de TPH radiobacter y la cepa Burkholderia fue el terrario T5 con 5.600 mg/kg, el cual cepacia. Así como dos géneros de se inoculó con el consorcio bacteriano hongos: Aspergillus y Rhizopus. selecto. 4. La prueba de terrarios y la prueba 7. En la prueba de compostaje, los niveles de compostaje demostraron mayor de TPH disminuyeron a los 86 días en degradación del hidrocarburo del suelo tres biopilas: la biopila CB1 (3.008 mg/ contaminado agregando el «consorcio kg), biopila C2 (3.879 mg/kg) y biopila bacteriano selecto» a las muestras, CB2 (4.310 mg/kg), presentándose por cuyos microorganismos fueron aislados debajo de los límites de aceites y grasas; del mismo hidrocarburo «borra». y a los 120 días se logró alcanzar en todas las biopilas evaluadas un nivel de 5. Utilizando el consorcio bacteriano saneamiento por debajo de 5.000 mg/ selecto se observó que, en la prueba kg para suelos contaminados con TPH de compostaje, a los 86 días, se (MINEM). obtuvo entre 95 y 99% de remoción del 120 Científica 7 (2), 2010
  18. 18. Identificación de bacterias nativas que degradan hidrocarburos: biorremediación en suelos contaminados con «borras» mediante la técnica de compostajeREFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS1. Hurtado JE, Díaz AM, Cañari AR, Alegre LM. Biorremediación de suelos contaminados porhidrocarburos empleando microorganismos: estudio a nivel de columnas. Lima: UniversidadPeruana Cayetano Heredia. Laboratorio de Biotecnología Ambiental; 1999.2. Merino F. Estudio de microorganismos nativos productores de emulsificantes de petróleo.[Tesis de Maestría]. Lima: UNMSM; 1998.3. http://perso.wanadoo.es/microdominguez/API.htm4. Belloso C, Carrario J, Viduzzi D. Biodegradación de hidrocarburo en suelos contaminadosen terrarios. En: XXVI Congreso Interamericano de Ingeniería Sanitaria y Ambiental; SanLorenzo 1998.5. Hueseman MH, More KO. The effects of oil type and loading, oxygen and commercialbacteria on crude oil bioremediation. USA: CRC Press; 1994. p. 58-71.6. MINEM. Dirección General de Asuntos Ambientales del Ministerio de Energía y Minas. GuíaAmbiental para el manejo de desechos de las refinerías de petróleo. Vol. VII; 1994.7. Ercoli EC y otros. Tratamiento biológico de lodos de refinería. En: 2º Simposio de Producciónde Hidrocarburos; 1995: 497-506.8. Prudencio GC. Aislamiento e identificación de cepas bacterianas biorremediadoras y suevaluación sobre suelo contaminado con petróleo crudo. [Tesis de Licenciatura en Biología].Lima: Universidad Pedro Ruiz Gallo; 2002.9. Viñas Canals M. Biorremediación de suelos contaminados por hidrocarburos, caracterizaciónmicrobiológica, química y ecotoxicológica. [Tesis doctoral]. Barcelona: Facultad de Biología.Departamento de Microbiología; 2005.10. Atlas R. Microbial degradation of Petroleum Hydrocarbons an Environmental Perspective.American Society for Microbiology 1981; 45: 180-209.11. Boopathy R. Factors limiting bioremediation technologies. Bioresource Technology 2000;74: 63-77.*trabajo de investigación presentado por pierina guiLLén zubiate para obtener eL grado de Magíster scientiae en cienciasaMbientaLes. universidad nacionaL agraria La MoLina. escueLa de postgrado juan guerrero correspondencia: jguerrerob@LaMoLina.edu.perecepción: 02/08/2010aceptación: 30/08/2010 Científica 7 (2), 2010 121
  19. 19. PURIFICACIÓN Y PROPIEDADES DE UNAFOSFATASA ÁCIDA DE BAJO PESO MOLECULARDE HÍGADO DE ALPACA (Lama pacos)PURIFICATION AND PROPERTIES OF A LOW MOLECULAR WEIGHTACID PHOSPHATASE FROM ALPACA LIVER (Lama pacos)Emilio Guija Poma1*, Hielke Haak Mares†, Fernando Arauco Villar2† EstE trabajo sE publica como un homEnajE póstumo al Dr. hiElkE haak marEs, profEsor principal DE lafacultaD DE mEDicina DE la univErsiDaD nacional mayor DE san marcos. lima-pErú.1* univErsiDaD nacional mayor DE san marcos. facultaD DE mEDicina. cEntro DE invEstigación DE bioquímica ynutrición. av. grau 755 lima-1 pErú.2 univErsiDaD nacional mayor DE san marcos. facultaD DE mEDicina. uniDaD DE postgraDo.
  20. 20. Purificación y propiedades de una fosfatasa ácida de bajo peso molecular de hígado de alpaca (Lama pacos)RESUMEN fosfatasas ácidas de cerdo (3), placentaSe ha purificado 1.306 veces una fosfatasa humana (4), hígado de bovino (5), cerebroácida de bajo peso molecular de hígado de bovino (6), etc.de alpaca. El procedimiento incluye Esta enzima se presenta en múltiplesfraccionamiento con sulfato de amonio, formas en un mismo tejido, las que difierentratamiento ácido, cromatografía de exclusión en razón de sus pesos molecularesmolecular y cromatografía de intercambio y propiedades cinéticas; así mismo,iónico utilizando SE-sephadex. La enzima muestran especificidades distintas frentepurificada tiene un peso molecular de 16,4 a diversos sustratos. Se han separadoKDa, que se determinó utilizando electroforesis tres formas distintas de fosfatasa ácidaen gel de poliacrilamida en presencia de en hígado de bovino (5); de maneradodecil sulfato de sodio. La enzima cataliza similar, se ha observado que el hígado depreferencialmente el p-nitrofenil fosfato y humano contiene tres formas molecularesmuestra un pH óptimo de 5,0; el valor Km de fosfatasa ácida, habiéndose purificadoobtenido a pH 5,0 para el p-nitrofenil fosfato aquella de más bajo peso molecular (7).fue de 4,0 x 10-5 M y de 1,1 x 10-3 M para Los iones metálicos afectan de una manerael fenil fosfato. El magnesio, bario y cobalto muy diversa la actividad catalítica de estasno afectaron significativamente la actividad enzimas; las fosfatasas ácidas de bajo pesoenzimática, pero la enzima fue fuertemente molecular son afectadas por reactivos deinhibida por mercurio. grupos sulfhidrilo, en cambio, las fosfatasasPalabras clave: fosfatasa ácida, ácidas de alto peso molecular son inhibidaspurificación, alpaca, hígado. por tartrato y fluoruro. Análogamente, el pH ejerce efecto sobre el valor Km, el cual es dependiente de la naturaleza del sustratoABSTRACT utilizado. En el presente trabajo se describe la purificación de una forma de fosfatasaA low molecular weight alpaca liver acid ácida de bajo peso molecular y algunas dephosphatase has been purified 1.306-fold. sus propiedades cinéticas.The procedure involves ammonium sulfatefractionation, acid treatment, molecularexclusion chromatography and SE-sephadex MATERIALES Y MÉTODOSion exchange chromatography. Material biológicoThe purified enzyme has a molecular weightof 16,4 KDa as determined by polyacrilamide Se utilizó hígado de alpaca (Lama pacos) degel electrophoresis in the presence of animales sacrificados en el Camal Municipalsodium dodecyl sulphate. The enzyme de Huancavelica, el que se sometió a unacatalyzes preferencially p-nitrophenyl inspección veterinaria macroscópica con elphosphate and shows an optimum pH of propósito de detectar y descartar órganos5,0; the Km value obtained at pH 5,0 for con anomalías patológicas; inmediatamentep-nitrophenyl phosphate was 4,0 x 10-5 M después se procedió a la limpieza yand 1,1 x 10-3 M by using phenyl phosphate debridación para eliminar la mayor parte delas substrate. Magnesium, calcium, barium tejido conectivo y grasa, luego se congelóand cobalto had no effect on the enzyme se trasladó a Lima y se guardó a unaactivity significatively, but the enzyme was temperatura de -20 ºC.strongly inhibited by mercury. Reactivos químicosKey words: acid phosphatase, purification, El sulfato de amonio, sephadex G-75 (45-alpaca, liver. 120), sulfoetil sephadex C-50, p-nitrofenol, fenol, etilendiaminotetraacético (EDTA),INTRODUCCIÓN D-glucosa-6-fosfato, D-fructosa-6-fosfato, D,L-a-glicerolfosfato y seroalbúmina bovinaLas fosfatasas ácidas (fosfohidrolasas de se adquirieron de la Sigma Chemicalmonoésteres ortofosfóricos EC 3.1.3.2.) Company; el p-nitrofenil fosfato (salson enzimas de amplia distribución en disódica), fenil fosfato (sal disódica), ácidola naturaleza, que tienen la propiedad acético glacial, Folin-Ciocalteu, etanolde hidrolizar una diversidad de ésteres absoluto, metanol y glicerol se compraronmonofosfóricos y de catalizar reacciones a la Merck Darmstadt. Todos los otrosde transfosforilación (1,2). Se han purificado reactivos fueron de grado analítico. Científica 7 (2), 2010 123
  21. 21. Emilio Guija Poma, Hielke Haak Mares, Fernando Arauco VillarARTÍCULOS ORIGINALES Medida de la actividad enzimática la albúmina sérica de bovino como estándar. La presencia de proteínas en La actividad de la enzima se determinó las fracciones que se colectaron de las midiendo la liberación de p-nitrofenol columnas cromatográficas se evaluaron utilizando como sustrato el p-nitrofenil fosfato. espectrofotométricamente midiendo la El medio de ensayo, en un volumen de 2.0 mL absorción a 280 nm. contenía 50 mmoles de tampón acetato de sodio pH 5,0, EDTA 0,2 mmoles, p-nitrofenil Electroforesis en gel de poliacrilamida fosfato 2 mmoles y enzima. La reacción se con SDS realizó a 37 ºC durante 2 minutos y se detuvo mediante la adición de 1 mL de NaOH 1 N. El La electroforesis se realizó utilizando un p-nitrofenol liberado se midió a 400 nm en un sistema vertical en placa de acuerdo con espectrofotómetro Gilford 240. Para realizar la técnica descrita por Laemmli (11). Las los cálculos (6) se utilizó un coeficiente de concentraciones finales para el gel de extinción molar de 1,8 x 104 M-1 cm-1. Bajo resolución fueron: acrilamida 15%, Tris- estas condiciones experimentales, el sustrato HCl 1.5 M pH 8,8, SDS 0,4%, Temed hidrolizado no excedió el 3%. Una unidad 0,05% y persulfato de amonio 0,0075%. de actividad enzimática se define como El gel de stacking tenía las siguientes la cantidad de enzima que libera 1 mmole concentraciones: acrilamida 3%, Tris-HCl de p-nitrofenol por minuto. La actividad 0,125 M pH 6,8, SDS 0,1%, Temed 0,024% específica se expresa como unidades de y persulfato de amonio 0,0075%. El tampón actividad enzimática por mg de proteína. para los electrodos contenía: Tris-HCl 0,025 M, glicina 0,192 M y SDS 0,1% pH 8,3. La actividad enzimática también se midió utilizando como sustrato fenil fosfato. El Determinación del peso molecular de la medio de ensayo en un volumen de 2 mL enzima contenía 50 mmoles de acetato de sodio La determinación del peso molecular de pH 5,0, EDTA 0,2 mmoles, fenil fosfato 10 la fosfatasa ácida se realizó en un gel de mmoles y enzima. La medición se realizó resolución de manera similar al descrito a 37 ºC y el tiempo de reacción fue de 10 anteriormente, habiéndose utilizado una minutos, a cuyo término se detuvo la reacción concentración de acrilamida de 10% y por adición de 1 mL de NaOH 1 N. El fenol un kit de proteínas estándar (Dalton Mark liberado se midió a 290 nm y el coeficiente VI), lisozima de clara de huevo 14,3 KDa, de extinción molar utilizado(8) para realizar b-lactoglobulina de leche de vaca 18,4 los cálculos fue de 2,52 x 103 M-1cm-1. KDa (subunidad), tripsinógeno de páncreas Especificidad de sustrato de bovino 24 KDa, pepsina de mucosa estomacal de cerdo 34,7 KDa, albúmina de Se utilizaron diversos ésteres monofosfóricos huevo 45 KDa y albúmina de plasma bovino a una concentración final de 2,0 x 10-3M, en 66 KDa. un medio de ensayo que en un volumen de 2,0 mL contenía 50 mmoles de tampón acetato de sodio pH 5,0, EDTA 0,2 mmoles RESULTADOS Y DISCUSIÓN y enzima, siendo la temperatura de 37 °C; el tiempo de incubación fue de 20 minutos, Purificación de la fosfatasa ácida con excepción del medio que contenía Para el proceso de purificación se pesaron p-nitrofenil fosfato, que fue de 2 minutos. 250 g de hígado de alpaca y se homogenizaron Las reacciones se detuvieron por adición con 4 volúmenes de tampón acetato de sodio de 1 mL de ácido tricloroacético al 10% y 0,01 M pH 5,0, EDTA 0,001 M en un Waring se midió el fosfato liberado (9), para cuyo Blendor, en 3 sesiones de 30 segundos con propósito se midió una alícuota de 1,0 mL, 1 minuto de reposo en un cuarto frío a 4 ºC. se añadieron 3,0 mL de agua y 4,0 mL del El homogenizado se centrifugó a 11.600 g reactivo de color, se incubaron a 37 °C por durante 30 minutos utilizando una centrífuga 90 minutos, a cuyo término se leyeron a 820 refrigerada Sorvall RC-2B y al sobrenadante nm en el espectrofotómetro, habiéndose resultante se le adicionó sulfato de amonio preparado una curva estándar para realizar para llevarlo a un 25% de saturación; luego los cálculos. se centrifugó a 11.600 g por 30 minutos y Determinación de la concentración de el sobrenadante finalmente se llevó a 60% proteína de saturación con sulfato de amonio y se centrifugó como en el caso anterior. El La determinación de proteína se realizó precipitado se suspendió con el tampón por el método de Lowry (10), usando de homogenización y se ajustó el pH a 4,5 124 Científica 7 (2), 2010
  22. 22. Purificación y propiedades de una fosfatasa ácida de bajo peso molecular de hígado de alpaca (Lama pacos)mediante la adición de ácido acético diluido; que la reacción para sulfato de amonio fuese dejó agitando durante 30 minutos, a cuyo negativa, luego se procedió a centrifugar entérmino se centrifugó de manera similar a la las condiciones antes descritas.etapa anterior y el sobrenadante se llevó apH 5,0 con una solución diluida de hidróxido Se aplicó el sobrenadante de la etapade amonio. anterior a una columna de Sephadex G-75 (110 x 4,5 cm) previamente equilibradaEl sobrenadante anterior se llevó a 70% de con el tampón de homogenización, luegosaturación con sulfato de amonio y luego se se eluyó utilizando el mismo tampón decentrifugó de manera análoga a las etapas elusión y se colectaron fracciones de 10 mLanteriores. El precipitado se resuspendió en a las que se midió la actividad enzimáticael tampón de homogenización y se dializó y la presencia de proteínas a 280 nm. Secon el mismo tampón durante 15 horas, juntaron las fracciones con significativacambiando de tampón tres veces, hasta actividad enzimática. 0.6 1.6 1.4 0.5 400 Mm Actividad Enzimática 1.2 0.4 1 200 Proteínas 0.3 0.8 0.6 0.2 D.O. 0.4 D.O. 0.1 0.2 0 0 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1.020 1.080 1.140 1.200 1.260 1.320 1.380 1.440 1.500 450 510 570 630 690 750 810 870 930 990 1.050 1.110 1.170 1.230 1.290 1.350 1.410 1.470 Volumen mL Figura 1. croMatografía en sephadex g-75El volumen de elusión de la etapa anterior se una gradiente lineal de NaCl (0,0-0,2 M).aplicó a una columna de sulfoetil sephadex De manera similar a la etapa anterior,C-50 (4,0 x 1,1 cm) equilibrada previamente los tubos que mostraron alta actividadcon el tampón de homogenización el que enzimática se combinaron y se procediósirvió para eluir la muestra. Cuando la a concentrarlos. Este proceso se realizódensidad óptica a 280 nm fue menor a 0,025 en dos etapas: primero se dializó contrase aplicó una gradiente discontinua de el tampón de homogenización y se aplicófosfato en concentraciones comprendidas a una columna de sulfoetil sephadex C-50entre 5 x 10-4 M y 1 x 10-2 M en tampón de (4,0-1,1 cm) equilibrada con el tampónhomogenización a pH 6,0; se colectaron de homogenización y se eluyó con NaClfracciones de 5 mL a las que se determinaron 0,2 M en el mismo tampón, colectándoseactividad enzimática y densidad óptica a las fracciones con elevada actividad280 nm como en la columna anterior. Los enzimática; luego se sometió a un procesotubos que contenían razonable actividad de ultrafiltración usando presión positivaenzimática se mezclaron y se llevaron a de nitrógeno en un aparato diseñado porpH 5,0 mediante adición de ácido acético Amicon Corporation, utilizando para estediluido. propósito el filtro UM 2, a fin de concentrar la enzima a un volumen de 3 mL; todas lasEl eluido de la etapa anterior se aplicó a etapas de purificación se realizaron a unauna columna de Sulfoetil sephadex C-50 temperatura no mayor de 4 ºC. Un resumen(4,0 x 1,1 cm) equilibrada con tampón de la purificación de la enzima se muestrade homogenización, luego se eluyó con en la tabla 1. Científica 7 (2), 2010 125

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