Cientifica 6

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Cientifica 6

  1. 1. CIENTÍFICA RECTOR Dr. Agustín Iza Stoll Dr. Fernando Cabieses Molina Rector Emérito DIRECTORIO Ing. José Dextre Chacón Presidente del Directorio Eco. Rolando Vallejo Vicepresidente Ejecutivo AUTORIDADES Dr. José Amiel Pérez Vicerrector de Investigación Ing. Jorge Ponce Urquiza Decano de la Facultad de Ingeniería Económica y de Negocios Dr. Augusto Sato Tsuji Decano de la Facultad de Estomatología Dr. Pedro Mendoza Arana Decano de la Facultad de Medicina Humana Lic. Milagros Agurto Arca Decano de la Facultad de Nutrición y Dietética Dr. Manuel Rosemberg Barrón Decano de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia Ing. José Carlos Dextre Chacón Decano de la Facultad de Ingeniería de Sistemas Empresariales Ing. Jorge Chávez Salas Decano de la Facultad de Turismo Ambiental Ph. D. Lisveth Flores Del Pino Decana de la Facultad de Ingeniería y Gestión Ambiental Dra. Sonia Valle Rubio Decana de la Facultad de Biología Marina y Econegocios Mg. Larissa Bálsamo Fasce Coordinadora de la Facultad de Psicología Ing. Zandra Rivera Chávez Coordinadora de la Facultad de Ingeniería de Sistemas Empresariales
  2. 2. Dr. Emilio Guija Poma Director del Instituto de Investigación Ing. José Pérez Fernández Director Administrativo Lic. Gustavo Luján Zumaeta Director de Educación Fernando Paredes Director Comercial Percy Encinas Director del Centro Cultural y del Fondo Editorial REVISTA CIENTÍFICA Dr. José Amiel Pérez Director Comité Editorial Dr. José Amiel Pérez Percy Encinas Carranza Rubén Quiroz Ávila ÁRBITROS Dr. Antolín Sánchez Cuervo Dr. Ricardo Cheesman Consejo Superior de Investigaciones Científicas (España) U. Científica del Sur - Facultad de Medicina Humana Dra. Laurietz Seda Dr. Alejandro Burga Universidad de Connecticut U. Científica del Sur - Facultad de Medicina Humana Magíster Eco. Iván Rivarola Dr. Jorge Gutarra U. Científica del Sur - Facultad de Ing. Económica U. Científica del Sur - Facultad de Medicina Humana Ing. José Dávila Prof. Ramsés Salas U. Científica del Sur - Facultad de Ing. Sistemas Empresariales U. Científica del Sur - Facultad de Nutrición y Dietética Dr. Raúl Urquizo Dr. Emilio Guija U. Científica del Sur - Facultad de Medicina Humana U. Científica del Sur - Vicerrectorado de Investigación Dr. Francisco Vásquez Dr. Javier Enciso U. Científica del Sur - Facultad de Medicina Humana U. Científica del Sur - Vicerrectorado de Investigación Fondo Editorial de la Universidad Científica del Sur / Diagramador: Giovanni Bedoya Asesora de Diseño: Erika Kohatsu / Corrector de estilo: Niki Tito
  3. 3. SUMARIO Editorial 4 ARTÍCULOS CIENTÍFICOS: Actividad Antimicrobiana de Plantas 6 Jorge Araujo Díaz, Ramsés Salas Asencios Determinación de la Capacidad Antioxidante de Néctares de Frutas 19 Oscar Reátegui Arévalo, Emilio Guija Poma, Percy Soldevilla Collazos, María José Castillo Sotomayor y Silvana Pérez-Reyes Beltrán Células Madre: Pluripotencia y Diferenciación Celular 27 David Amiel Peña, Jose Amiel Pérez INFORME TÉCNICO: Indicadores Ambientales de las Aguas de las Lagunas del Campus de la Universidad Científica del Sur 37 Oscar Reátegui Arévalo, Emilio Guija Poma, Victor Gallegos Rejas, Jayson López Lasteros, Mirella Tomatis Korrodi HUMANIDADES: Una Triada Inconsistente: Nación, Modernidad y Literatura en el Perú 43 José Antonio Mazzotti ENSAYO: Un Aporte de la Universidad Privada a la Educación y al Desarrollo Nacional 52 Ing. José Carlos Dextre TESIS: Obesidad, Hipertensión Arterial, Dislipidemia y Complicaciones Cardiovasculares en la Población Diabética del Hospital Dos de Mayo 59 Angélica María Lombardi Salas RESEÑAS: 63 CARTAS AL EDITOR: 65 Convocatorias a concurso de proyectos 67 NOTAS: 75
  4. 4. REVISTA CIENTÍFICA EdITORIAl Este 2008 nuestra universidad continúa y afirma su rol de centro de producción científica y, con ello, avanzamos hacia la vanguardia en esta tarea en el país. No dejaremos de insistir en que la naturaleza universitaria concibe a la investigación como uno de sus ejes fundamentales y como tal la define. El ejercicio científico constante es, por ello, un deber también moral. Científica Nº 6 asume esa necesaria perspectiva y nos da la oportunidad de brindar a la comunidad los horizontes epistemológicos que se despliegan en nuestra universidad. Así, este número de la revista Científica se inicia con un artículo de Jorge Araujo y Ramsés Salas que reitera y aumenta la tendencia del corpus académico de darle un soporte sistemático al estudio de las plantas medicinales. Los derivados de esta farmacopea, cuyo uso es cada vez más difundido con efectividad, se insertan ya en el canon médico. Recordemos que el sabio peruano Fernando Cabieses, rector emérito de la Universidad Científica del Sur, es uno de los científicos fundacionales en esta área. El segundo artículo, que une en la investigación a docente y alumnos, encabezados por Oscar Reátegui y Emilio Guija, determina la capacidad antioxidante de néctares de frutas en diversas marcas comerciales del mercado nacional. David Amiel y José Amiel describen las posibilidades terapéuticas de las células madre y abordan también el debate ético sobre el uso de ellas en seres humanos. Adjuntamos también un valioso informe técnico realizado por nuestros docentes y alumnos sobre los indicadores ambientales de las aguas de las lagunas del Campus de la Universidad Científica del Sur. 4
  5. 5. Para el área de humanidades tenemos como invitado al prestigioso académico peruano de Tuffs University, José Antonio Mazzotti, quien reflexiona sobre la nación, modernidad y literatura en el Perú, revelando la fractura histórica que atraviesa el país. Asimismo, contamos con un ensayo de José Carlos Dextre que reconfigura el debate sobre la importancia y el aporte de la universidad privada en la educación y el desarrollo nacional. Dextre examina con minuciosidad el rol de la universidad peruana y critica el modelo en el que derivó en gran parte del siglo XX. Propone a partir de ello una relectura del tema. Como ya es tradicional en esta revista, se publica una tesis, antiguo y necesario protocolo para legitimar la pulsión científica y exponer a la comunidad académica los aportes de los nuevos investigadores. Esta vez Angélica Lombardi diserta sobre la relación entre obesidad, hipertensión arterial, complicaciones cardiovasculares y la diabetes Mellitus en el Hospital Dos de Mayo. Este primer número del año de la revista Científica culmina con reseñas bibliográficas y las meritorias cartas al editor cuyo impacto a veces ha hecho girar el rumbo de la historia de la ciencia. Como parte final publicamos los documentos de nuestro concurso de proyectos de investigación para que nuestra propia comunidad universitaria pueda participar activamente en él. Los resultados cimentarán lo hasta ahora avanzado. Estimados lectores y amigos, además de invitarlos también a la edición virtual de la revista, quedan ustedes estimulados a participar con nosotros en el conocimiento. Agustín Iza Rector 5
  6. 6. REVISTA CIENTÍFICA ARTÍCUlOS CIENTÍFICOS ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE PLANTAS Jorge ArAuJo DíAz1; rAmsés sAlAs Asencios2 RESUMEN Se realiza una revisión de los principales compuestos con actividad antimicrobiana que se pueden obtener a partir de extractos de plantas y derivados de ellas. Además, se describen las características y algunos resultados obtenidos a partir del uso de los dos principales métodos de evaluación de la actividad antimicrobiana: el turbidimétrico y el ensayo por difusión en placa. Palabras clave: Actividad antimicrobiana, extractos de plantas, ensayo turbidimétrico, difusión en placa. ABSTRACT A review is made about the main antimicrobial compounds from plant extracts and from plant by-products. Besides, features and some experimental results are presented about the two main methods evaluating antimicrobial activity: turbidity measure and Petri-dish diffusion. Key words: Antimicrobial activity, plant extracts, turbidity assay, Petri-dish diffusion. INTRODUCCIÓN Desde hace unos años, el empleo de plantas medicinales y de productos derivados de las mismas está aumentando de manera importante. Esto se debe a una serie de factores, entre los cuales debemos destacar en muchos casos el conocimiento preciso de su composición química, y el hecho de que en la actualidad dicha utilización se fundamenta en numerosos ensayos farmacológicos in vivo como in vitro, así como en ensayos químicos. De esta forma, el uso de las especies vegetales medicinales que se ha venido haciendo en forma empírica y basada en la tradición tiene hoy una base científica. Una planta medicinal es considerada como un complejo laboratorio de síntesis y degradaciones en el que generalmente coexisten componentes con diversas estructuras químicas, y su efecto en muchas ocasiones se debe a varios de estos componentes. Además de los principios activos que son en su mayor parte metabolitos secundarios, en las plantas se encuentran los metabolitos primarios y una serie de sustancias consideradas inertes con función plástica. La farmacopea peruana tiene muchas plantas con aplicaciones curativas. Diversos investigadores han señalado que existen más de 3,000 especies, por lo que la cantidad abrumadora de medicinas originadas por este tipo de plantas 1 Universidad Nacional Federico Villarreal / e-mail: jaraujodiaz@hotmail.com 2 Universidad Científica del Sur / e-mail: ramses_salas@yahoo.com 6
  7. 7. ARTÍCUlOS CIENTÍFICOS debiera convencer a los científicos del valor y alcance de la investigación etnobotánica, ecológica, fitogeográfica, fitoquímica y farmacológica, a fin de lograr su validación científica. El objetivo del presente trabajo es resaltar la importancia de las plantas como productoras de compuestos antimicrobianos, presentando los principales componentes químicos que se pueden aislar con esta actividad, así como la principal metodología para analizarla experimentalmente. I. PLANTAS ANTIMICROBIANAS Aproximadamente, el 60% de la población mundial utiliza plantas y productos derivados de ellas en su medicación. Estos productos naturales hoy en día son considerados como una de las “medicinas” de gran importancia por su efectividad terapéutica. De las 520 nuevas drogas aprobadas entre 1983 y 1984, el 39% fueron productos naturales o derivados de productos naturales, y el 60 a 80% de drogas antibacterianas y de anticancerígenos son derivados de productos naturales. Por ejemplo, del desarrollo de drogas no proteicas se han obtenido derivados generados de productos naturales como la sinvastatina, lovastatina, enalapril, ciprofloxacina y ciclosporina, entre otros, y agentes anticancerígenos como el taxol y docetaxol (Harvey, 2000). Sin embargo, la actividad terapéutica no sólo se puede conseguir luego de procesos de extracción y purificación de principios activos, sino directamente de la planta misma o de algunos extractos relativamente simples de obtener. Por ejemplo, el jugo de arándano tiene una acción de prevención de las recurrencias sintomáticas de infección al tracto urinario; el consumo diario de 300 ml reduce la bacteriuria en mujeres post-menopáusicas pero no en niñas con vejiga neurogénica (Kontiokari y col., 2001). En un estudio de acción inhibitoria de crecimiento antimicrobiano, se mostró que la asociación de extractos acuosos de 2 plantas, Erythroxilum novogranatense variedad truxillense “Hoja de Coca de Trujillo” y Plantago major, presentaron sinergismo, comparado con el estudio realizado por separado de cada uno de los extractos; se realizaron las determinaciones fitoquímicas en muestras de ambas especies y los extractos acuosos fueron esterilizados separadamente mediante filtros Milipore para realizar las determinaciones de acción inhibitoria de crecimiento frente a bacterias y hongos, encontrándose una proporción de asociación para los dos extractos acuosos empleados de 50:50, considerándose como óptimo para este estudio (Bazalar y col., 1998). Ocinum micranthum W., planta conocida como “sanialbahaca”, es utilizada para tratar infecciones respiratorias en regiones amazónicas de América del Sur, México y el Caribe. Se determinó la composición química del aceite esencial de las hojas de dicha planta, y también se la enfrentó a bacterias como Klebsiella pneumoniae, S. aureus, E. coli, Bacillus cereus, Shigella sp., y hongos del género Aspergillus, confirmándose que dicho aceite puede ser considerado como un buen agente antibacteriano y antifúngico (Fuertes y col., 1997). Los ácidos ceanótico y ceanotérico, provenientes de la planta Ceanothus americanus, han demostrado efectos inhibidores del crecimiento de Streptococcus mutans, Actinomyces viscosus, y Porphyromonas gingivalis; y los extractos etanólicos del propóleo han mostrado buena actividad antimicrobiana contra estos mismos microorganismos orales (Katsura y col., 2001). Los extractos crudos de Psoralea corylifolia, un árbol nativo de China, poseen actividades reportadas antimutagénicas, antimicrobianas y de hormona juvenil de insectos; además, un extracto aceitoso en hexano obtenido a partir de sus semillas presentó actividad antimicrobiana contra Staphylococcus aureus. Se ha considerado que el responsable de estas actividades es el bakuchiol, un isoprenoide fenólico aislado de las semillas y hojas de esta planta (Katsura y col., 2001). Es común el empleo de partes vegetales con la finalidad de obtener varios efectos terapéuticos y que han sido respaldados por estudios científicos. Entre las variadas aplicaciones terapéuticas de los vegetales se incluye la acción antibacteriana. Los hallazgos obtenidos del estudio de vegetales con potencial terapéutico podrán servir como instrumento de apoyo médico-social para un mayor grupo poblacional, principalmente el más carente, estando también la industria farmacéutica más interesada en los conocimientos de esta área (De Paula y Martínez, 2000). Nuevas fuentes de productos antimicrobianos, especialmente fuentes vegetales, están siendo investigadas. El público hoy en día tiene más problemas con la sobreprescripción y el mal uso de antibióticos tradicionales. Además, mucha gente está interesada en tener más autonomía sobre su cuidado médico. Una multitud de componentes vegetales se encuentra fácilmente disponible a través de los comercializadores de plantas y productos naturales, tiendas naturistas, con lo que la automedicación con estas sustancias se hace cada vez más común. El uso de extractos de plantas, como también de otras formas alternativas de tratamientos médicos, tomó gran popularidad a finales de la década de 1990. En 1996 se reportó que las ventas de medicinas botánicas se incrementaron en un 37% con respecto a 1995 (Cowan, 1999). 7
  8. 8. REVISTA CIENTÍFICA II. GRUPOS PRINCIPALES DE COMPONENTES ANTIMICROBIANOS DE LAS PLANTAS Las plantas tienen una casi ilimitada habilidad de sintetizar sustancias aromáticas, gran cantidad de ellas son fenoles o sus derivados de oxígenos sustituidos. Muchos son metabolitos secundarios de los cuales por lo menos 12000 han sido aislados, un número estimado menor en un 10% del total. En numerosos casos estas sustancias sirven como mecanismos de defensa de las plantas contra la predación por microorganismos, insectos y herbívoros. Algunos, tales como los terpenoides, dan a las plantas sus olores; otros (quinonas y taninos) son responsables del pigmento de las plantas. Muchos componentes son asimismo responsables del sabor de las plantas (el terpenoide capsaicina en caso del ají), y algunas de las hierbas y especies usados por los humanos para sazonar los alimentos producen compuestos medicinales útiles. Los compuestos fitoquímicos antimicrobianos útiles pueden ser agrupados en varias categorías, como las siguientes: a. Fenoles y Polifenoles: El ácido cafeico (Fig. 1) y el cinámico son representantes de estos grupos, ambos con acción antimicrobiana, antiviral y antifúngica. También se pueden mencionar a los fenoles simples y ácidos fenólicos, catecoles (Fig. 1) y eugenoles (estos últimos considerados bacteriostáticos). La actividad antimicrobiana del catecol y del pirogallol está directamente relacionada con el número de grupos hidroxilos que tiene el derivado fenólico. También están las quinonas (como las antraquinonas con acción bactericida para Pseudomonas), flavones, flavonoides, flavonoles y catequinas. Parte de los flavonoides inhiben in vitro el crecimiento de V. cholerae, Streptococcus y otras bacterias. Los flavonoides también exhiben actividad antiviral; los taninos presentan actividad astringente. Se considera que la acción de los fenoles y polifenoles contra los microorganismos se debe a la inhibición enzimática posiblemente por acción sobre los grupos sulfihidrilos de sus aminoácidos de cisteína o por medio de reacciones más inespecíficas con proteínas bacterianas. Los compuestos fenólicos que poseen una cadena lateral a nivel de C3 en un bajo nivel de oxidación y que no contienen oxígeno, son clasificados como aceites esenciales y a veces se citan como agentes antimicrobianos bacteriostáticos contra hongos y bacterias (Cowan, 1999). Katsura y col. (2001) purificaron bakuchiol (Fig. 1) a partir de semillas de Psoralea corylifolia y en solución con DMSO al 5%. El análisis de la actividad antimicrobiana se realizó leyendo absorbancias a 610 nm (turbidez) de cultivos microbianos incubados por 24 hrs. Para determinar un posible crecimiento posterior al enfrentamiento con bakuchiol (conteo de células viables), se tomaron alícuotas de estas muestras diluidas en presencia de Tween 80 (para inactivar el bakuchiol) y se sembraron en placa, incubándose por 48 horas para leer Unidades Formadoras de Colonias (UFC). Hubo una inhibición de crecimiento de S. mutans directamente proporcional a la concentración de bakuchiol, encontrándose una actividad bacteriostática in vitro a una concentración de 5 µg/ml y una actividad bactericida in vitro a 20 µg/ml. El efecto bactericida del bakuchiol fue dependiente del tiempo y la producción de glucanos insolubles en agua (principal factor de virulencia para S. mutans) fue prácticamente inhibida. También se analizó la actividad antimicrobiana del bakuchiol contra diferentes especies de bacterias, incluyendo Streptococcus mutans, S. sobrinus, Porphyromonas gingivalis, Enterococcus faecalis, E. faecium, Lactobacillus acidophilus, L. plantarum, L. casei, S. sanguis, S. salivarius, Actinomyces viscosus, generando diversos valores del MIC que van desde 1.0 hasta 4.0 µg/ml y una concentración esterilizante entre los 5.0 hasta los 20.0 µg/ml. Figura 1. Estructura de algunos fenoles. 8
  9. 9. ARTÍCUlOS CIENTÍFICOS b. Quinonas: Son anillos aromáticos con dos sustituciones cetónicas. Se encuentran en amplia distribución en la naturaleza y son altamente reactivos en reacciones de óxido-reducción. Producen radicales libres y generan complejos irreversibles con aminoácidos nucleofílicos de las proteínas, generando su inactivación. El rango de la actividad antimicrobiana de las quinonas (Fig. 2) es amplio, actuando posiblemente sobre las adhesinas expuestas en la superficie de las bacterias, sobre los polipéptidos de la pared celular y sobre las enzimas unidas a membranas (Cowan, 1999). Por ejemplo, una antraquinona proveniente de Cassia italica, un árbol de Paquistán, tiene acción bacteriostática sobre Bacillus anthracis, Corynebacterium pseudodiphthericum y Pseudomonas aeruginosa, y tiene acción bactericida sobre Pseudomonas pseudomalliae. La Hipericina (Fig. 2) es una antraquinona extraída de Hypericum perforatum que ha sido descrita como un antidepresivo, pero tiene también actividades antimicrobianas. Plantas de la familia Borraginácea se han caracterizado por producir naftoquinonas en sus raíces, las cuales han sido utilizadas en numerosas culturas indígenas como colorantes en cosméticos y alimentos, y para aplicaciones medicinales por su actividad antitumoral, antiinflamatoria y antimicrobiana (Brigham y col., 1999). Figura 2. Estructura de algunas quinonas. c. Flavonas, flavonoides y flavonoles: Son estructuras fenólicas que contienen un solo grupo carbonilo. Estos compuestos son sintetizados por las plantas en respuesta a la infección antimicrobiana, y su actividad sobre las bacterias probablemente se deba a su capacidad de generar complejos con proteínas extracelulares y proteínas solubles, así como una actividad sobre la pared celular muy similar a la de las quinonas. Los flavonoides lipofílicos pueden perturbar la integridad estructural de la membrana celular (Fuertes y col., 1997). Las catequinas (Fig. 3), derivados de los flavonoides, han sido estudiadas como los compuestos que generan la actividad antimicrobiana in vitro en el té verde, sobre Vibrio cholerae O1, Streptococcus mutans y Shigella, principalmente. Las catequinas tienen una actividad inactivadora sobre la toxina de Vibrio cholerae e inhibe las glicosil transferasas en S. mutans. Ratas de laboratorio que recibieron en su dieta 0.1 % de catequinas del té, redujeron en un 40% la presencia de caries inducida (Cowan, 1999). Figura 3. Estructura de la catequiza, una flavona. 9
  10. 10. REVISTA CIENTÍFICA d. Taninos: Conforman un grupo de sustancias fenólicas poliméricas capaces de precipitar gelatina en solución, una propiedad conocida como astringente. Están divididas en dos grupos: hidrolizables y condensados. Los taninos hidrolizables están basados en el ácido gálico, usualmente como ésteres múltiples con la D-glucosa, mientras que los taninos condensados más importantes (a veces llamadas proantocianidinas) son derivados de monómeros flavonoides. Se ha considerado que los taninos, en muchas bebidas como el té verde y el vino, tienen actividades reforzadoras de la salud (estimulación de la actividad fagocitaria, actividad antitumoral mediada por el hospedero y un amplio rango de actividad antiinfecciosa). En las plantas, los taninos tienen una acción inhibitoria del crecimiento de insectos y perturban la digestión de rumiantes. Se cree que la actividad antimicrobiana de estos compuestos se debe a su interacción sobre las adhesinas, proteínas de la pared celular, y a su capacidad de unirse a polisacáridos (Cowan, 1999). Las plantas de las especies de Vaccinium contienen taninos condensados llamados proantocianidinas. Estas sustancias son compuestos fenólicos estables que pueden prevenir la expresión de las fimbrias P de E. coli dentro de sus actividades antibacterianas, y además tienen actividades antivirales, antiadherentes o antioxidantes (Kontiokari y col., 2001). e. Cumarinas: Son compuestos de los cuales se conoce muy bien su acción antitrombótica, antiinflamatoria y vasodilatadora. Un gran ejemplo de estos compuestos es la warfarina (Fig. 4), usada como un anticoagulante oral y como un rodenticida. Se ha visto que tiene acción antiviral, asimismo, otras cumarinas tienen actividad antimicrobiana sobre Candida albicans en trabajos in vivo en conejos. Estos trabajos fueron realizados en vista de las crónicas que, en 1954, indicaban el uso de cumarinas en lavados vaginales para el tratamiento de candidiasis en mujeres gestantes. Sin embargo, su uso interno es discutido por sus efectos contraceptivos en animales (Cowan, 1999). Figura 4. Estructura de la warfarina, una cumarina. f. Terpenoides y aceites esenciales: Los terpenos o terpenoides son activos contra bacterias, virus, hongos y protozoarios. Se ha reportado que los terpenoides actúan contra Listeria monocytogenes. Se cree que esta actividad antimicrobiana se debe a una perturbación de la estructura de la membrana celular por su naturaleza lipofílica. La capsaicina (Fig. 5) tiene actividad bactericida sobre Helicobacter pylori; aunque tiene un poder muy irritante sobre la mucosa gástrica, se ha demostrado que afecta el sistema nervioso, el cardiovascular y el digestivo. Se ha sugerido que la capsaicina también podría incrementar el crecimiento de Candida albicans. El ácido betulínico es un triterpenoide que muestra actividad inhibitoria del virus VIH. El petalostemumol presenta una actividad excelente contra Bacillus subtilis y Staphylococcus aureus, aunque tiene una menor actividad sobre bacterias Gram negativas y Candida albicans. Por otro lado, los terpenos previenen la formación de úlceras gástricas y disminuyen la severidad de las úlceras existentes, aunque no se sabe a ciencia cierta si esta actividad se debe o no a su acción antimicrobiana (Cowan, 1999). Figura 5. Estructura de la capsaicina, un terpenoide. 10
  11. 11. ARTÍCUlOS CIENTÍFICOS g. Alcaloides: Los Glicoalcaloides de especies de Solanum podrían ser útiles contra la infección por VIH y también contra las infecciones intestinales relacionadas con el SIDA. Otros alcaloides tienen efecto contra parásitos como Giardia y Entamoeba. La berberina (Fig. 6) es un alcaloide representativo por su actividad potencialmente efectiva contra Tripanosoma y Plasmodium. Se ha descrito que tiene actividad microbicida (por ejemplo, sobre Giardia y Entamoeba), pero se cree que su acción antidiarreica probablemente se deba a sus efectos sobre el tiempo de tránsito del bolo alimenticio en el intestino delgado (Cowan, 1999). Figura 6. Estructura de la berberina, un alcaloide. h. Lectinas y Polipéptidos: La actividad antimicrobiana de los péptidos fue descrita por primera vez en 1942. Tienen a veces grupos con carga positiva y contienen enlaces disulfuro entre residuos de cisteína. Su mecanismo de acción principalmente se explica como la formación de canales iónicos en la membrana del microorganismo o la inhibición competitiva de la adhesión de proteínas a los receptores polisacáridos del hospedero. Un reciente interés se ha enfocado en estudiar la actividad anti–VIH de péptidos y lectinas. Las tioninas son péptidos tóxicos para levaduras y bacterias Gram positivas y Gram negativas, como por ejemplo las Fabatinas que inhiben el crecimiento de Pseudomonas, E. coli, Enterococcus, etc. Los péptidos cíclicos son pequeños en tamaño y número de aminoácidos (por lo general menos de 15 aminoácidos) y son sintetizados por bacterias y plantas. También se han encontrado péptidos grandes cíclicos unidos por los extremos de 29 a 31 aminoácidos en plantas de la familia Rubiaceae (café). Estos péptidos contienen seis residuos de cisteína que pueden ser alineados y comparten un 45% de homología de secuencia (Fig. 7). Entre ellos se tiene a la circulina A y B del árbol tropical africano Chassalia parviflora, la ciclopsicotride de la planta tropical de Sudamérica Psychotria longipes, y la kalata de la planta africana Oldenlandia affinis (Tam y col., 1999). Figura 7. Comparación de secuencias de algunos péptidos cíclicos provenientes de plantas, según el programa Clustal-W. En la figura se muestra en colores amarillos los residuos de cisteína conservados en estos péptidos y en color celeste algunos residuos aminoácidos conservados. Los péptidos mostrados son Kalata (de Oldenlandia affinis), Cicloviolacina-O22 (de Viola odorata), Circulina-B (Chassalia parviflora), Circulina-A (de Chassalia parviflora) y Ciclopsicotride-A (de Psychotria longipes). 11
  12. 12. REVISTA CIENTÍFICA Estos péptidos macrocíclicos tienen también en común un tipo inhibidor de motivo estructural nudo de cisteína, el cual contiene un patrón de enlaces disulfuro entre los residuos de cisteína I-IV, II-V, y III-VI. Estos motivos estructurales, junto con una estructura de hoja beta con tres cadenas, también han sido hallados en toxinas peptídicas e inhibidores de proteasas de diversos orígenes. Las circulinas A y B fueron descubiertas durante un programa de pruebas de actividad anti-VIH de diversos compuestos, al igual que la kalata y la ciclopsicotride en pruebas de nuevas sustancias antibióticas. Aunque la kalata presentó acción uterotónica y la ciclopsicotride presentó inhibición de la unión de la neurotensina a su receptor, no se sabe mucho de la función que cumplen estos péptidos en las plantas. La kalata mostró una fuerte actividad antimicrobiana contra bacterias Gram positivas, particularmente S. aureus (MIC 0.26 µM), mientras que su actividad fue moderada contra Gram negativas del género Klebsiella y hongos del género Candida. La circulina A tuvo una actividad similar a la kalata, pero mostró una acción más potente contra S. aureus (MIC 0.19 µM), aunque no tuvo actividad contra Micrococcus luteus. Estos péptidos macrocíclicos son diferentes a las defensinas vegetales de cadena abierta, que son de mayor tamaño. Los macrocíclicos son más pequeños, compactos y rígidos en cuanto a estructura (Friedrich y col., 1999). III. OTRAS ACTIVIDADES ANTIMICROBIANAS Recientemente, investigaciones químicas llevadas a cabo sobre algas marinas (rodofitas o algas rojas, feofitas o algas pardas, clorofitas o algas verdes, cianofitas o cianobacterias, y dinoflagelados) han demostrado que estos organismos producen una amplia variedad de metabolitos secundarios biológicamente activos, con estructuras moleculares únicas, no encontradas en otros organismos, los cuales han mostrado ser capaces de inhibir el crecimiento de ciertas bacterias, virus y hongos. En cuanto a la actividad antibiótica de las microalgas, se pueden nombrar algunos de estos compuestos que ya han sido identificados: ácido acrílico obtenido en la microalga Phaeocystis, ácido λ-linolénico en los extractos metanólicos de Spirulina platensis, Chlorococcum, Dunaliella primolecta, amfidinol 2, hidroxilpolieno en el extracto del dinoflagelado Amphidinium klebsii. Las microalgas, y más específicamente las cianobacterias (algas azul-verdosas), constituyen una importante fuente de compuestos antivirales. Un estudio reciente de 600 especies de cianofitas mostraron que cerca del 10% de los extractos probados tuvieron actividad contra el virus Herpes simplex tipo 2 (VHS-2) y contra el virus de inmunodeficiencia tipo 1 (VIH-1). Entre los compuestos responsables de esta actividad se puede nombrar a una molécula similar a la clorofila (feofórbido) aislada de Dunaliella primolecta, a un sulfolípido obtenido de Lyngbya lagerheimii y a una proteína de bajo peso molecular (cianovirín) aislada de Nostoc ellipsosporum. Un grupo de científicos japoneses aisló de Spirulina platensis un polisacárido sulfatado, el calcio-spirulán, que presentó actividad contra el VHS-1 y el VIH-1. La actividad antiviral de esta molécula fue comparada con un sulfatodextrano mostrando una actividad superior. El calcio-spirulán inhibe la replicación del virus, creando una perturbación en las interacciones iónicas entre las membranas glicoproteícas del virus y los fosfolípidos presentes en las membranas de la célula del huésped, inhibiendo así la fusión celular de ambos. Asimismo, el calcio-spirulán mostró un tiempo de vida media en la sangre de ratón significativamente más largo (150 minutos) que el sulfatodextrano (30 minutos). Los resultados de este estudio son prometedores. El calcio-spirulán presenta todas las características necesarias de un buen antiviral: no estimula la replicación del virus, tiene actividad a bajas concentraciones, posee elevado tiempo de vida media en la sangre y tiene poca actividad anticoagulante. Aunado a esto, la tecnología del cultivo del género Spirulina está totalmente desarrollada, por lo que el abastecimiento de materia prima no presenta problema. Queda, sin embargo, la puesta a punto de los procedimientos de extracción a nivel industrial de este principio activo. Un ejemplo de esto último lo tenemos en los trabajos realizados desde 1996 por un grupo de investigadores italo-franceses sobre la variación estacional de la actividad de los extractos de Schizymenia dubyi contra el virus VIH-1. Esta macroalga es una alga roja colectada en las costas de Sicilia cuya particularidad es la de poseer un elevado contenido de ácido gulurónico, un tipo de ácido no propio de las algas rojas. Esta alga contiene efectivamente un polisacárido denominado glucorono-galacto-sulfato, responsable de la actividad antiviral. Esta actividad disminuye en ciertas épocas del año (otoño-invierno) y llega al máximo de abril a julio, con la correspondiente disminución en el contenido de galactosa y sulfatos en el polisacárido (Freile, 2001). IV. APROXIMACIONES EXPERIMENTALES Existen sustancias generalmente de origen natural cuya efectividad biológica no puede ser determinada por sus propiedades químicas o fisicoquímicas. En ese caso, para evaluar su actividad, se emplean métodos de dosificación biológica. En estos se compara cuantitativamente el efecto de una muestra sobre un sistema biológico con el efecto producido por una preparación estándar en las mismas condiciones. Se obtiene así un valor de potencia relativo a un estándar de referencia. 12
  13. 13. ARTÍCUlOS CIENTÍFICOS Los dos métodos más comúnmente usados para evaluación de actividad antimicrobiana son: a) Método turbidimétrico o ensayo en tubo: Se basa en la incubación de un medio de cultivo líquido inoculado con un microorganismo sensible al antibiótico en presencia de una concentración conocida del agente antimicrobiano. Luego de un tiempo adecuado se detiene el crecimiento y se evalúa el mismo por medidas turbidimétricas. El uso de un espectrofotómetro o un fotocolorímetro para medir los cambios de densidad óptica en base a la mayor o menor turbidez producida por el crecimiento microbiano, evita la posible subjetividad de lecturas en una escala nefelométrica de McFarland. La base cuantitativa del ensayo es la relación entre la concentración del antibiótico y la densidad óptica del medio de cultivo en donde hubo crecimiento microbiano. Figura 8. Fundamento del método turbidimétrico, con lecturas en el espectrofotómetro, mostrando la relación directa entre las lecturas y la población microbiana. 13
  14. 14. REVISTA CIENTÍFICA En los estudios de actividad antibacteriana de propóleo, para hallar la Concentración Mínima Bactericida (CMB), Ota y col. (1998) trabajaron a partir del liofilizado de dicha sustancia, el cual se suspendió en una solución hidroalcohólica con una concentración final de 50 mg/ml; de esta suspensión se dispensaron, en diferentes tubos, volúmenes de 0.1, 0.2, 0.3 hasta 1.0 ml y se completó a 5 ml con el medio de cultivo, obteniendo así concentraciones de propóleo desde 1 mg/ml hasta 10 mg/ml; luego se procedió a agregar a cada tubo 0.1 ml de inóculo bacteriano y se incubó a 37°C por 24 horas. Como la adición del propóleo ocasiona una turbiedad en el medio de cultivo, no fue posible observar el crecimiento bacteriano, por lo que de cada tubo se extrajo 0.1 ml y se sembró en tubos con caldo de cultivo puro que se incubaron a 37° C por 24 horas para observar si hubo crecimiento microbiano. Se concluyó que el propóleo presenta actividad antibacteriana in vitro siguiendo este orden de sensibilidad: Streptococcus mutans > Lactobacillus sp. > Sthaphylococcus aureus > Sthaphylococcus epidermidis. En un trabajo de péptidos antimicrobianos, el MIC de cada péptido fue determinado por el uso de un ensayo de dilución en caldo del método de Amsterdam modificado. Diluciones seriadas de cada péptido fueron preparadas con ácido acético 0.01% en microplacas de 96 pocillos. Cada pocillo fue inoculado con 0.1 ml del organismo de prueba en Caldo MH a una concentración final de 2 x 104 a 105 UFC/mL (Friedrich y col., 1999). Este procedimiento permite cuantificar el MIC o concentración mínima inhibitoria como la primera dilución del extracto en la cual el crecimiento se inhibe después de un período de incubación (generalmente 18 horas a 37 ºC), y a la concentración mínima bactericida como la primera dilución en la cual ya no se detecta presencia de bacterias (Araujo y col., 2004). Figura 9. Fundamento de la determinación de la mínima concentración inhibitoria y de la mínima concentración bactericida, mostrando las diferencias entre estas dos variables. 14
  15. 15. ARTÍCUlOS CIENTÍFICOS b) Método de difusión en placa: Se basa en la difusión radial de una solución de extracto o de antibiótico desde un reservorio a través de una capa de agar que ha sido inoculada con un microorganismo sensible al antibiótico. Se confrontan diferentes medidas de la sustancia a ensayar en placas con medios de cultivo sólido inoculado con microorganismos adecuados. Las placas se incuban para permitir el desarrollo del microorganismo. Durante la incubación, el antibiótico difunde desde su reservorio (que puede ser un disco de papel filtro, un pozo excavado en el mismo medio de cultivo con inóculo bacteriano, o pequeños cilindros colocados en la superficie del medio) mientras la población microbiana aumenta por división celular. La respuesta obtenida es una zona clara o halo de inhibición del crecimiento bacteriano en torno a los reservorios (Fig. 10). El límite de la zona de inhibición se forma cuando se alcanza la concentración crítica del antibiótico, es decir, la mínima concentración que inhibe el crecimiento de la población microbiana presente. Los halos de inhibición se miden con la mayor precisión posible: se utiliza regla, vernier ó un sistema de ampliación de imagen y proyección sobre una pantalla. La base cuantitativa del ensayo es la relación entre el diámetro de la zona de inhibición y la concentración del antibiótico. La determinación de sensibilidad por difusión en agar es habitualmente suficiente; sin embargo, en ciertas situaciones se recomienda la determinación del MIC por métodos turbidimétricos (Harvey, 2000). Figura 10. Fundamento del método de difusión en placa, indicando con las flechas la formación de los halos de inhibición en el “césped bacteriano”. 15
  16. 16. REVISTA CIENTÍFICA El gradiente de concentración es inversamente proporcional a la distancia de la fuente y depende del volumen de la sustancia en ella, y el crecimiento de microorganismos depende de la población inicial y de la velocidad de crecimiento. Estudios con Rubus urticaefolius “mora”, utilizada en Centro y Sur América para el tratamiento de afecciones de la cavidad oral, demostraron una gran acción antibacteriana al efectuar extractos hidroalcohólicos, en especial del fruto. El método empleado para la determinación de la actividad fue el de Difusión en Agar con orificios. La extracción consistió en macerar separadamente hojas, tallo y frutos en solución hidroalcohólica al 70% durante 5 días a temperatura ambiente, y luego se eliminó el alcohol por evaporación (De Paula y Martínez, 2000). Para un estudio de actividad antibacteriana y antifúngica de flavonoides y alcaloides de Lupinus ballianus c.p. smith “jera”, se obtuvieron extractos etanólicos de las hojas desecadas, de las cuales se extrajeron los principios activos mediante cromatografía. La determinación de la actividad antimicrobiana de flavonoides y alcaloides se realizó mediante el método de excavación en placa-cultivo utilizando el medio TSA y los microorganismos S. aureus, Bacillus cereus, Micrococcus luteus y Klebsiella pneumonae, además del hongo Aspergillus níger (Fuertes y col., 1997). Mbwambo y col. (2007) trabajaron con extractos de raíz y tronco de Terminalia brownii. La prueba se realizó con el método de difusión en disco, usando extractos con solventes de diferente polaridad, yendo desde el éter de petróleo hasta agua. El resultado fue una nula actividad antimicrobiana en los extractos obtenidos con los solventes menos polares (éter de petróleo), y una actividad antimicrobiana incrementada en intensidad y número de especies bacterianas susceptibles conforme aumenta la polaridad del solvente. Lo más notorio de este trabajo es que el extracto acuoso mostró la mayor actividad antimicrobiana de todos los demás extractos, pero una menor acción toxigénica en bioensayos usando camarones de mar (los extractos acuosos son los más frecuentemente usados por los curanderos y naturistas). Se usaron discos de papel filtro (Whatman Nº1) de 5 mm de diámetro, impregnado con extractos crudos (5 µg/disco) o antibióticos estándar (10 mg/ml de gentamicina) o antimicóticos (20 µg/disco de clotrimazol), usando TSA o Sabouraud glucosado según el caso. La incubación se realizó a 37ºC por 24 horas. Se hace cada prueba por triplicado tanto para los extractos y los estándares, se toman promedio. Los reportes se realizan usando las medias de las zonas de inhibición (diámetros de inhibición menos diámetro del disco de papel, o sea 5 mm). El índice de actividad (IA) se calcula como la media de la zona de inhibición del extracto entre la media de la zona de inhibición producida por la droga estándar. Estudios en aceites esenciales han demostrado actividad antibacteriana. En la UNMSM se extrajeron los aceites esenciales de tres plantas: Tagetes pusilla, Senecio tephrosiodes y Lepechinia meyenii, utilizando bacterias Gram- positivas como S. aureus y Gram–negativas como Salmonella typhi, S. typhimurium, V. cholerae. Los aceites fueron extraídos por arrastre de vapor, y la actividad antimicrobiana fue llevada a cabo mediante el método modificado del cromatograma, realizándose las lecturas por medio de los halos de inhibición de los discos impregnados con el aceite. Los resultados mostraron acción antibacteriana frente a las bacterias evaluadas (Morales, 1996). La alicina (allyl 2-propeno tiosulfinato) se produce durante la molienda de los dientes de ajo. Su formación depende de la enzima aliinasa presente en las células de la cáscara sobre la aliina de las células del mesófilo. La destilación al vapor de machacados de ajo durante la producción del aceite gárlico, usado con fines terapéuticos, producen metil y alil sulfoderivados de la alicina. Se ha considerado que la alicina es la responsable de la actividad antimicrobiana de los homogenizados de dientes de ajo (y del aceite gárlico) sobre Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Helicobacter pylori. Se usó la técnica de difusión radial en placa usando agar TSA, con una incubación de 48 horas a 37º C. Las placas, previamente al uso de los extractos, fueron preparadas conteniendo el cultivo bacteriano y fueron dejadas en reposo dentro de un extractor de aire seco a fin de evitar la pérdida de actividad del ajo por volatilización. Además, este trabajo ha demostrado que al enfrentar el aceite gárlico con el cultivo bacteriano se debe tener en cuenta la naturaleza hidrofóbica del aceite, por lo que estudios anteriores no mostraron actividad antibacteriana (Ross y col., 2001). En Cuba se estudió la actividad antimicrobiana de diferentes concentraciones de un extracto fluido (etanol 80%) de hojas de “copal” Schinus terebinthifolius. Se utilizaron cepas ATCC de microorganismos que incluyen a Staphylococcus aureus como Gram-positivas y Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosa como Gram-negativas, y la levadura Candida albicans. El método utilizado fue el de excavación en placa y difusión en agar para adicionar los extractos. El inóculo de microorganismos precultivados en medio líquido permitió un crecimiento en césped en el agar con una concentración de 108 cel/mL. Las placas se incubaron a 37ºC durante 24 horas, y luego se evaluaron los resultados mediante la lectura en milímetros del diámetro del halo de inhibición de crecimiento. Los resultados obtenidos mostraron que aun a la menor concentración (1%) se aprecia inhibición del crecimiento de todo microorganismo y la respuesta es incrementada gradualmente con la concentración hasta el 80% (Martínez y col., 2000). Los resultados de un trabajo sobre actividad antibacteriana de propóleos argentinos demostraron la influencia de la vegetación en la composición química y, como consecuencia de ello, en la actividad biológica; es decir, la 16
  17. 17. ARTÍCUlOS CIENTÍFICOS composición de los propóleos varía de acuerdo a su origen botánico y fitogeográfico. El objetivo de este estudio fue determinar la validez del uso popular de propóleos como agentes antibióticos. Para dicho ensayo, se obtuvo un extracto etanólico de propóleos en el cual se embebieron discos de papel Whatman Nº 4 (5 ml) y luego se colocaron en placas con agar MH conteniendo la suspensión bacteriana apropiada. Los discos contenían cantidades variables del extracto de propóleo; las placas se incubaron a 37ºC por 24 horas, y se probaron cepas de bacterias como S. aureus, Streptococcus pyogenes, Enterococcus faecalis, K. pneumoniae, P. aeruginosa, E. coli, entre otras. Los resultados se interpretaron por los halos de inhibición de crecimiento bacteriano, y el MIC se determinó con un software basado en la ecuación de Michaelis-Menten. Se observó que todos los propóleos mostraron actividad antimicrobiana sobre las bacterias Gram-positivas y no sobre las Gram-negativas (Ota y col., 1998). Para obtener un ensayo de acción bactericida, Friedrich y col. (1999) tomaron por toda la noche un cultivo de E. coli y lo diluyeron hasta 10-2 en caldo MH fresco, dejándolo crecer hasta la fase logarítmica (D.O600 0.6) o estacionaria (D.O600 de 2) para luego diluirlo en medio fresco, produciendo una concentración de trabajo de 108 cel/mL. Los péptidos o antibióticos a ensayar fueron adicionados a 4 veces sus MICs, y estas suspensiones fueron incubadas a 37ºC después de la adición del péptido. Las muestras fueron removidas a intervalos regulares, diluidas y plaqueadas sobre placas de agar MH para obtener un conteo viable. La investigación de tioglicósidos en plantas del género Tropaeolum demostró que dichos metabolitos poseen actividad antimicrobiana y antifúngica. Para determinar la actividad antimicrobiana, se aplicó la técnica de dilución en placas de Agar, con diferentes concentraciones del extracto etanólico puro obtenido de hojas, flores y frutos de Tropaeolum majus (los extractos contienen el tioglicósido y sus productos de hidrólisis determinados mediante cromatografía y la formación de derivados). Las pruebas antibacterianas se efectuaron con cepas de S. aureus, E. coli, Bacillus subtilis, Klebsiella pneumonae y Proteus vulgaris. Para comprobar la actividad antifúngica, se hicieron pruebas cualitativas utilizando la técnica de difusión en placas de agar, y en tubos para determinar la concentración mínima inhibitoria. Se utilizaron cepas de hongos dermatofitos y Candida albicans. Se concluyó que los extractos etanólicos y acuosos de hojas, flores y frutos tienen un metabolito secundario (mayor en frutos) que se agrupa dentro de los glicósidos. Las hojas, flores y frutos presentaron actividad antimicrobiana y antifúngica (Cumpa y col., 1991). La Tabla I muestra en forma resumida la comparación de los dos métodos de ensayo antimicrobiano descritos en este artículo. Tabla I: COMPARACIÓN DE AMBOS MÉTODOS DE EVALUACIÓN DE ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DIFUSIÓN EN PLACA TURBIDIMETRÍA - Mayor facilidad de operación - Mayor complejidad de operación - Igual tiempo de incubación - Igual tiempo de incubación - Placas iguales fondo plano - Tubos con igual diámetro y espesor - Placas se preparan en superficie - La medición del volumen del medio plana debe ser muy cuidadosa - La muestra (antibiótico) debe - Antibiótico (muestra) debe difundir solubilizarse - La muestra no debe precipitar ni - La muestra no debe dar color o absorberse turbidez - En caso de mezclas se pueden - No deben emplearse evitar interferencias ajustando las microorganismos que formen condiciones de difusión aglomerados - Error subjetivo de lectura - La contaminación del inóculo es crítica 17
  18. 18. REVISTA CIENTÍFICA REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. ARAUJO, J.; CÓRDOVA, B.; RODRÍGUEZ, M.; SALAS, R. 2004. “Cuantificación de la actividad antimicrobiana de Caesalpinia spinosa contra Staphylococcus aureus”. Resúmenes del III Congreso Peruano de Plantas Medicinales y Fitoterapia. 2. BAZALAR, D.; CHOQUESILLO, F.; MILLA, H.; HERRERA, O.; FELIX, M. 1998. Acción inhibitoria de crecimiento de la asociación de los extractos acuosos de Erythroxilum novogranatense var. Truxyllense y Plantago major frente a bacterias y hongos. Ciencia e Investigación. 1 (2). 24 – 30. 3. BRIGHAM, L.A.; MICHAELS, P.J.; FLORES, H.E. 1999. Cell-specific production and antimicrobial activity of naphthoquinones in roots of Lithospermum erythrorhizon. Plant Physiology. 119: 417 – 428. 4. COWAN, M. 1999. Plant Products as antimicrobial agents. Clinical Microbiological Reviews. 12(4): 564 – 582. 5. CUMPA, N; GUERRA, M; VEJAR, V; FUENTES, C. 1991. Avances en la investigación de tioglicósidos en plantas del género Tropaeolum, actividad antibacteriana y antifúngica. Boletín de la Sociedad Química del Perú. 6. DE PAULA, J.; MARTÍNEZ, A. 2000. Acción antibacteriana de extractos hidroalcohólicos de Rubus urticaefolius. Rev. Cubana Plant. Med. 5(1): 26-9. 7. FREILE, Y. 2001. Algas en la “botica”. Avance y Perspectiva. 20: 283 – 292. 8. FRIEDRICH, C.; SCOTT, M.; KARUNARATNE, N.; YAN, H.; HANCOCK, R. 1999. Salt-resistant alpha-helical cationic antimicrobial peptides. Antimicrobial agents and chemotherapy. 42 (8): 1542-1548. 9.FUERTES, C.; ROQUE, M.; TRISTAN, M. 1997. Flavonoides y alcaloides de Lupinus ballianus con actividad antibacteriana y antifúngica. Instituto de Microbiología UNMSM. 10. HARVEY, A. 2000. Strategies for Discovering Drugs from Previously Unexplored Natural Products. Drug Discovery. 5(7). Review. 11. KATSURA, H.; TSUKIYAMA, R.; SUZUKI, A.; KOBAYASHI, M. 2001. In vitro antimicrobial activities of bakuchiol against oral microorganisms. Antimicrobial agents and chemotherapy. 45 (11): 3009–3013. 12. KONTIOKARI, T.; SUNDQVIST, K.A.J.; NUUTINEN, M.; POKKA, T.; KOSKELA, M.; UHARI, M. 2001. Randomised trial of cranberrylingonberry juice and Lactobacillus GG drink for the prevention of urinary tract infections in women. British Medical Journal. 322 (30): 1 – 5. 13. MARTINEZ, M; LOPEZ, M; MOREJON, Z y RUBALCABA, Y. 2000. Actividad antimicrobiana de un extracto fluído al 80% de Schinus terebinthifolius raddi “copal”. Rev. Cubana Plant. Med. 5(1): 23-25. 14. MBWAMBO, Z.H.; MOSHI, M.J.; MASIMBA, P.J.; KAPINGU, M.C.; NONDO, R.S. 2007. Antimicrobial activity and brine shrimp toxicity of extracts of Terminalia brownii roots and stem. BMC Complementary and Alternative Medicine. 2007, 7:9. 15. MORALES, L. 1996. Estudio in vitro de la actividad antimicrobiana de aceites esenciales de tres plantas del Perú. Tesis para optar el grado de biólogo. UNMSM. 16. OTA, C.; MUZETTI, P.; SCHIMIDIT, C.; TSUNEZI, M. 1998. Actividade da própolis sobre bacterias isoladas da cavidade bucal. LECTA, Braganca Paulista. 16 (1). 73-77. 17. ROSS, Z.M.; O’GARA, E.A.; HILL, D.J.; SLEIGHTHOLME, H.V.; MASLIN, D.J. 2001. Antimicrobial properties of garlic oil against human enteric bacteria: evaluation of methodologies and comparisons with garlic oil sulfides and garlic powder. Applied and environmental microbiology. 67 (1): 475–480. 18. TAM, J.P.; LU, Y.A.; YANG, J.L.; CHIU, K.W. 1999. An unusual structural motif of antimicrobial peptides containing end-to-end macrocycle and cystine-knot disulfides. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96: 8913–8918. 18
  19. 19. ARTÍCUlOS CIENTÍFICOS DETERMINACIÓN DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE NÉCTARES DE FRUTAS Oscar Reátegui Arévalo1, Emilio Guija Poma2, Percy Soldevilla Collazos2, María José Castillo Sotomayor3 y Silvana Pérez-Reyes Beltrán4 RESUMEN Se ha determinado la capacidad antioxidante de néctares de manzana, mango y durazno de varias marcas comerciales que se expenden en el mercado local. Los valores de la capacidad antioxidante de las muestras estuvieron comprendidas entre 3.17 y 14.75 mmoles/L. Así mismo, se determinó el contenido de vitamina C, habiéndose observado que la concentración de esta vitamina en las muestras analizadas mostraron valores entre 152 y 656 mg/L. También se determinó el contenido de polifenoles totales, cuyos valores estuvieron en un rango de 224 y 927 mg equivalentes de ácido gálico/L. Además, pudo observarse que existe una relación directa entre el contenido de polifenoles totales y la capacidad antioxidante de los néctares analizados y que dicha capacidad también tiene correlación con la concentración de vitamina C. Palabras clave: Radicales libres, antioxidantes, néctar, polifenoles, vitamina C ABSTRACT The antioxidant capacity of some apple, mango and peach nectars has been determined for several commercial brands in the local market. The antioxidant capacity values of the samples ranged among 3.17 and 14.75 mmoles/L. Vitamin C content was also determined. Total polyphenols concentration was also determined after observing the vitamin content in the samples analyzed showed values among 152 y 656 mg/L. The total polyphenols concentration values ranged among 224 and 927 mg equivalent to galic acid/L. Likewise, the direct relation with the total polyphenol concentration and the antioxidant capacity of the nectars analyzed which is connected to vitamin C concentration was observed. Key words: Free radicals, antioxidants, nectar, poliphenols, C Vitamin 1 Profesores Del DePArtAmento De cienciAs BásicAs - lABorAtorio De QuímicA ucsur 2 Alumno De lA fAcultAD De meDicinA HumAnA. 3 AlumnA De lA fAcultAD De nutrición y DietéticA. 4 AlumnA De lA fAcultAD De VeterinAriA y zootecniA. 19
  20. 20. REVISTA CIENTÍFICA INTRODUCCIÓN Diversos estudios epidemiológicos muestran que la ingesta de alimentos con elevada acción antioxidante está vinculada con una baja incidencia de enfermedades cardiovasculares (12). Se ha propuesto que los polifenoles y la vitamina C que se encuentra en las frutas y verduras jueguen un rol importante en las propiedades antioxidantes de dichos alimentos y, por extensión, en la prevención de diversas enfermedades vinculadas al estrés oxidativo, condición que se define como el balance que existe entre los compuestos que generan radicales libres y aquellos que impiden su acción nociva, con predominio de las primeras (3). Los radicales libres son compuestos caracterizados por tener uno o más electrones desapareados, situación que los torna altamente reactivos (4). En el organismo humano se generan radicales libres de muy distintas maneras: se forman a partir del oxígeno de la respiración, mediante la reacción del peróxido de hidrógeno con metales de transición como fierro ó cobre, a través de la reacción del ascorbato con Cu+ ó Fe2+, mediante la acción de radiaciones ionizantes, etc. (5,6). Debido a que los radicales libres que se generan en el ser humano tales como el anión superóxido (O•-), radical hidroxilo (OH•), radical alcoxilo, etc. poseen oxígeno en su composición, se les ha denominado “especies reactivas de oxígeno” (ROS), a diferencia de compuestos como el óxido nítrico (NO•) ó peroxinitrito, a los que se les denomina “especies reactivas de nitrógeno” (RNS) (7). Las especies reactivas de oxígeno tienen la propiedad de reaccionar con proteínas, carbohidratos, lípidos y ácidos nucleicos (5), por cuyo motivo el ser humano ha desarrollado, a través del proceso evolutivo, un sistema antioxidante que le permite protegerse del efecto dañino de los ROS. Dicho sistema está constituido por sustancias de tipo enzimático (catalasa, superóxido dismutasa, glutation peroxidasa, etc.) y no enzimático (ceruloplasmina, albúmina, transferrina, ácido úrico, etc.), pero debido a que este sistema antioxidante es insuficiente para protegerlo de la acción dañina de los radicales libres, es necesario que ingiera sustancias antioxidantes que no puede sintetizar, tales como: vitamina C, vitamina E, flavonoides, etc. (5,8). En tal sentido, el objetivo del presente trabajo es evaluar la capacidad antioxidante de néctares de frutas, determinar la concentración de vitamina C y el contenido de polifenoles. MATERIALES y MÉTODOS REACTIVOS El 2,4,6-Tris(2-piridil)-s-triazina, se adquirió de la Sigma Chemical Company, el ácido acético, ácido ascórbico, reactivo de Folin-Ciocalteu, ácido tricloroacético se compraron a la Merck Darmstadt. Todos los reactivos fueron de grado para análisis. DETERMINACIóN DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE La capacidad antioxidante de las diferentes bebidas se determinó utilizando la técnica descrita por Benzie y Strain adaptada por Szollosi y Varga (9). En forma breve, la determinación se realizó midiendo 1.0 mL del reactivo 2,4,6- Tris(2-piridil)-s-triazina, 0.1 mL del néctar previamente diluido y 0.9 mL de agua destilada. Se preparó el blanco respectivo y todos los tubos se colocaron en baño maría a 37° C durante 15 minutos, a cuyo término se leyó la densidad óptica a 593 nm en un espectrofotómetro Spectronic modelo Genesys 6. Todas las determinaciones se realizaron por triplicado. Se preparó una curva de calibración, utilizando diversas concentraciones de sulfato ferroso, que sirvió para realizar los cálculos. DETERMINACIóN DE POLIfENOLES TOTALES El contenido de polifenoles en las muestras de los néctares se determinó utilizando el método de Spanos y Wrolstad (10), para cuyo propósito se midió 0.1 mL del néctar motivo del estudio, se adicionó 1.0 mL del reactivo de Folin- Ciocalteu diluido 1:10 con agua destilada, y finalmente 1.5 mL de una solución de carbonato de sodio al 7.5 %. Los tubos se colocaron en baño maría a 45° C durante 15 minutos, a cuyo término se leyeron en el espectrofotómetro a 765 nm. Paralelamente se preparó el blanco correspondiente que no tenía muestra. Para realizar los cálculos se preparó una curva estándar utilizando concentraciones conocidas de ácido gálico. 20
  21. 21. ARTÍCUlOS CIENTÍFICOS DETERMINACIóN DE VITAMINA C La concentración de vitamina C en las muestras se determinó utilizando la técnica propuesta por Jagota y Dani (11), para cuya finalidad se midió 0.1 mL de la muestra, 0.5 mL de ácido tricloroacético al 10%, 0.2 mL del reactivo de Folin-Ciocalteu y agua en cantidad suficiente para un volumen de 2.0 mL. Se dejó en reposo durante 10 minutos a temperatura ambiente, a cuyo término se leyó la densidad óptica a 760 nm. Se preparó el blanco correspondiente que no contenía muestra; así mismo, se preparó una curva estándar utilizando diversas concentraciones de ácido ascórbico. RESULTADOS La capacidad antioxidante se determinó en néctares de tres frutas distintas, en la tabla N° 1 se observa que el néctar de mango de la marca Frugos mostró una mayor capacidad antioxidante que las otras marcas motivo del presente estudio, correspondiéndole el valor más bajo al néctar de la marca Laive; así mismo, en esta misma tabla puede apreciarse que el néctar que posee una mayor concentración de polifenoles, expresados como miligramos equivalentes de ácido gálico/L, es el de la marca Frugos, que también mostró el más elevado contenido de vitamina C. Con referencia a los néctares de manzana puede observarse que la mayor capacidad antioxidante correspondió al néctar de la marca Frugos con un valor de 9.21 mmoles/100 mL de muestra, tal como se observa en la tabla N° 1; así mismo, esta misma muestra tuvo la mayor concentración de polifenoles conforme se aprecia en dicha tabla y también el más elevado contenido de vitamina C. Los néctares de manzana de las marcas Gloria, Watts y Laive mostraron valores más bajos en el orden indicado. El néctar de durazno de la marca Frugos también mostró el valor más elevado de la capacidad antioxidante frente a las otras marcas, correspondiéndole un valor algo menor al néctar de la marca Gloria y en orden decreciente a las marcas Watts y Laive, cuyos valores se aprecian en la tabla N° 1; así mismo, la concentración de polifenoles totales fue mayor en el néctar de la marca Frugos, la que también posee valores de vitamina C mayores que el resto de las marcas analizadas, las cuales, como en el caso anterior, tienen valores menores de polifenoles y vitamina C en orden decreciente y proporcional a la capacidad antioxidante. Tabla Nº 1 CAPACIDAD ANTIOXIDANTE FRAP (mmoles/L) Marca Mango Manzana Durazno Frugos 14.75 9.21 13.47 Gloria 12.29 6.60 8.64 Watts 6.58 3.83 3.83 Laive 3.58 3.17 4.45 CONTENIDO de POLIFENOLES (mg equivalentes de ácido gálico/L) Marca Mango Manzana Durazno Frugos 927.5 668.0 791.5 Gloria 742.0 448.0 503.5 Watts 377.5 355.5 323.5 Laive 224.5 308.0 274.0 CONTENIDO de VITAMINA “C” (mg/L) Marca Mango Manzana Durazno Frugos 656 400 438 Gloria 532 296 346 Watts 312 152 168 Laive 192 128 150 21
  22. 22. REVISTA CIENTÍFICA Se ha observado que existe una relación entre la capacidad antioxidante y el contenido de polifenoles; en los gráficos Nº 1, 2 y 3 se muestra la relación lineal existente entre la capacidad antioxidante y la concentración de polifenoles de las frutas: mango, manzana y durazno. 22
  23. 23. ARTÍCUlOS CIENTÍFICOS Así mismo, en los gráficos Nº 4, 5 y 6 se observa que la capacidad antioxidante de los néctares antes mencionados mantiene una relación lineal con el contenido de vitamina C. 23
  24. 24. REVISTA CIENTÍFICA 24
  25. 25. ARTÍCUlOS CIENTÍFICOS DISCUSIÓN La ingesta de alimentos con un elevado contenido de sustancias antioxidantes ayuda a prevenir diversas enfermedades crónicas no transmisibles (1, 2, 14, 15), por lo que actualmente se recomienda el consumo diario de tres a cinco porciones de frutas y verduras. En países como Estados Unidos, Australia e Inglaterra las enfermedades cardiovasculares constituyen una de las que mayor número de muertes causa anualmente (1-2). Se ha observado que la ingesta de alimentos como frutas y verduras incrementan la actividad antioxidante total del suero (12,13, 16), esta capacidad antioxidante mantiene una estrecha relación con su contenido en compuestos antioxidantes, entre los que se consideran a la vitamina C, vitamina E, β caroteno, licopeno, flavonoides, entre otros (17, 18). La ingesta de néctares de frutas constituye una manera fácil de acceder a los beneficios que eventualmente nos proporcionan estos alimentos, por cuyo motivo, la determinación de sus propiedades antioxidantes permite disponer de un referente apropiado para evaluar y adoptar una decisión para su uso. Es necesario considerar que en el proceso de manipulación industrial de las frutas, se alteran los contenidos de vitamina C, polifenoles y antocianinas, y como consecuencia de ello parte de sus propiedades antioxidantes, hecho que torna necesaria una adecuada determinación cuantitativa de sus constituyentes más relevantes y de la capacidad antioxidante (19, 20, 21). En el presente trabajo hemos observado que la capacidad antioxidante de los néctares de las frutas analizadas depende fundamentalmente de su contenido en polifenoles. Así mismo, hemos podido apreciar que los néctares con mayor concentración de polifenoles exhiben una elevada capacidad antioxidante, como es el caso de los néctares de mango y durazno de la marca Frugos; un efecto similar se observa con el néctar de mango de la marca Gloria, cuya concentración en polifenoles es un poco menor que las frutas anteriores y paralelamente muestra una capacidad antioxidante más baja. Cuando se comparan las concentraciones de polifenoles de los néctares de cada una de las cuatro marcas estudiadas, se observa que el néctar de mango tiene una mayor concentración de polifenoles totales que los de manzana y durazno de la marca respectiva. Los néctares de mango, manzana y durazno de la marca Laive mostraron una menor concentración de polifenoles que las otras marcas analizadas y paralelamente una menor capacidad antioxidante. Se ha descrito que cuando las frutas son sometidas a procesos tecnológicos para obtener jugo, néctar, puré y vino, se afectan los contenidos de vitamina C, modificación que ocurre especialmente durante el tratamiento térmico (23). Así mismo, durante las diferentes etapas del procedimiento de obtención de los productos antes mencionados se conduce a una pérdida de compuestos antioxidantes. Resultados similares pudieron apreciarse con relación a la concentración de vitamina C. Los néctares de mango de las marcas Frugos y Gloria tuvieron las concentraciones más elevadas de esta vitamina, correspondiendo los valores más bajos al néctar de manzana de las marcas Watts y Laive, por lo que es posible sugerir que existe relación entre el contenido de vitamina C y la capacidad antioxidante de cada uno de los néctares analizados. La contribución de la vitamina C al efecto antioxidante de la pulpa de ciertas frutas es considerablemente variable, se ha descrito que dicho valor puede estar comprendido entre 2.43% a 107.75%; frutas como la manzana, el plátano y la uva contribuyen con menos de 20%, mientras que aquellas como el mango, el dátil y la toronja lo hacen con valores mayores al 80% (22). Al respecto, existe cierta controversia con referencia al poder antioxidante total y el contenido de vitamina C de frutas como el limón, la naranja y el mango, cuyos valores son diferentes a los observados en otros trabajos (21). REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. American Heart Association. Heart Disease and Stroke Statistical Update. 2003. American Heart Association, Dallas, TX. 2. Liu, S., Lee, I., Agani, U., Cole, S.R., Buring, S.R., Buring, J.E. y Manzon, J.E. “Intake of vegetables rich in carotenoids and risk of coronary disease in men: The Physicians Health Study”. Int. J. Epidemiol, 2001;30:130135. 3. Sies, H. “Oxidative stress: oxidants and antioxidants”. Exp. Physiol. 1997;82:291-295. 4. Halliwell, B. y Gutteridge, J.M.C. “Role of free radicals and catalytic metal ions in human disease”. Methods Enzymol. 1990; 186:1-85. 5. Cheeseman, K.H.Y. y Slater, T.F. (1993) Free radicals in medicine. Churchill Livingstone. London. 6. Cascales, M. Bioquímica y Fisiopatología del estrés oxidativo. 1997.- Fundación José Casares Gil. Madrid. 7. Guija, E. y Troncoso, L. Radicales libres y envejecimiento. Boletín de la Sociedad química del Perú. 2000; LXVI:33-50. 25
  26. 26. REVISTA CIENTÍFICA 8. Lotito, S.B. y Frei, B. “Consumption of flavonoid-rich foods and increased plasma antioxidant capacity in humans: Cause, consequence or epiphenomenon?” Free Radic. Biol. Med. 2006; 41:1727-1746. 9. Szollosi, R. y Varga, I. “Total antioxidant power in some species of Labiatae (Adaptation of FRAP method)” Acta Biol. Szeg. 2002; 46(3-4):125-127. 10. Spanos, G.A. y Wrolstad, R.E. “Influence of processing and storage on the phenolic composition of Thompson seedless grape juice”. J. Agric. Food Chem. 1990; 38:1565-1571. 11. Jacota, S.K. y Dani, H.M. “A new colorimetric Technique for the estimation of vitamin C using Folin Phenol reagent”. Anal. Biochem. 1982; 127:178182. 12. Cao, G. y Prior, R. “Postprandial increases in serum antioxidant capacity in older women. J. Appl. Physiol. 2000; 89:877883. 13. Samman, S., Sivarajah, G.,Man, J., Ahmad, Z., Petocz, P. y Caterson, I. “A mixed fruit and vegetable concentrate Increases plasma antioxidant vitamins and folate and lowers plasma homocysteine in men”. J. Nutr. 2003; 133: 21882193. 14. World Health Organization. Diet, Nutrition and the Prevention of Chronic Diseases: Report of a WHO Study Group-Technical Report Series 797 1990. World Health Organization. Geneva, Switzerland. 15. Ames, B.N., Shigenaga, M.K. y Hagen, T.M. “Oxidants, antioxidants and the degenerative diseases of aging”. Proc Natl. Acad. Sci. USA 1997; 90: 7915-7922. 16. Cao, G., Russell, R.M., Lischner, N. y Prior, R.L. “Serum antioxidant capacity is increased by consumption of strawberries, spinach, red wine or vitamin C in elderly women”. J. Nutr. 1998; 128: 2383-2390. 17. Lampe, J.N. “Health effects of vegetables and fruits; assessings mechanisms of action in human experimental studies”. Am J. Clin. Nutr. 1999; 70 (suppl) 475s-490s. 18. Guo, C.J. y Yang, J.J. “Progress in the study of antioxidant capacity of fruits and vegetables”. China Public Health. 2001; 17: 87-88. 19. Dragland, S., Senoo, K., Wake, K., Holte, K. y Blomhoff, R. “Several culinary and medicinal herbs are important sources of dietary antioxidants”. J. Nutr. 2003; 133:1286-1290. 20. Wolfe, K., Wu, X. y Liu, R.H. “Antioxidant activity of apple peels”. J. Agric. Food Chem. 2003; 51:609-614. 21. Szeto, Y.T., Tomlinson, B. y Benzoe, I.F.F. “Total antioxidant and ascorbic acid content of fresh fruits and vegetables: implications of dietary planning and food preservation”. Br. J. Nutr. 2002; 87:55-59. 22. Guo, C., Yang, J., Wi, J., Li, J., Xu, J. y Jiang, Y. “Antioxidant activities of peel, pulp and seed fractions of common fruits as determined by FRAP assay”. Nutr. Res. 2003; 23: 1719-1726. 23. Klopotek, Y., Otto, K. y Bohm, V. “Processing Strawberries to different products alters contents of vitamin C, total phenolics, total anthocyanins and antioxidant capacity”. J. Agric. Food Chem. 2005; 53:5640-5646. 26
  27. 27. ARTÍCUlOS CIENTÍFICOS CÉLULAS MADRE: PLURIPOTENCIA y DIFERENCIACIÓN CELULAR DAViD Amiel PeñA1, José Amiel Pérez2 RESUMEN Aunque se ha hecho un gran progreso en el aislamiento y cultivo de células madre, el futuro de las terapias basadas en células madre y su uso productivo en el descubrimiento de drogas y medicina regenerativa depende de dos factores clave: encontrar fuentes fiables de células pluripotentes y multipotentes, así como la capacidad para controlar su diferenciación y generar los derivados deseados. En esta revisión hemos descrito brevemente el origen de las células madre. También hemos enumerado sus características más importantes y hemos descrito los diversos enfoques para obtener células madre embrionarias y células madre provenientes de células somáticas. Finalmente hemos enumerado los avances logrados en la obtención de células madre en el tratamiento de enfermedades crónicas degenerativas y su uso en la investigación y descubrimiento de nuevas drogas. Palabras clave: células madre, células madre embrionarias, pluripotencia, reprogramación, factores de crecimiento, factores de transcripción SUMMARy Although great progress has been made in the isolation and culture of stem cells, the future of stem-cell based therapies and their productive use in rug discovery and regenerative medicine depends on two key factors; finding reliable sources of multipotent and pluripotent cells and the ability to control their differentiation to generate desired derivatives. In this review we described briefly the origin of stem cells, their most remarkable features and described the different approaches for the isolation of embryonic stem cells and stem cells derived from somatic cells. Finally we have described the advances in the isolation and characterization of stem cells applied to the treatment of chronic and degenerative diseases and its use in the research and discovery of new drugs. Key words: stem cells, embryonic stem cells, pluripotency, reprogramming, growth factors, transcription factors La biología del estudio de las células madre se encuentra en una fase de dinámica expansión y cada vez se encuentra más interconectada con un amplio rango de disciplinas básicas y aplicadas. Debido a que existe una vasta terminología relacionada exclusivamente a este campo, debemos comenzar esta revisión con un glosario que nos ayudará a captar los conceptos con mayor facilidad. Célula madre: Célula procedente del óvulo fertilizado o de cualquier tejido de un organismo determinado, que puede producir de manera continua células hijas inalteradas y también células hijas diferenciadas. 1 inVestigADor AsociADo A lA ucsur. 2 Vicerrector De inVestigAción De lA ucsur. 27
  28. 28. REVISTA CIENTÍFICA Células madre embrionarias: Células extraídas de la masa celular interna del embrión en estado de blastocisto, y que tienen la capacidad de formar cada una de las tres capas germinales del embrión, es decir, pueden diferenciarse hasta constituir cualquier tipo celular constitutivo de un organismo (osteoblasto, hepatocito, neurona, etc.). Compromiso: Adopción de un programa que lleva a la diferenciación celular. En el caso de una célula madre, esto significa que la célula va a dejar de autorenovarse, y en cambio va a originar células más diferenciadas. Potencia: Rango de opciones de compromiso disponibles para una célula: Totipotente.- Célula capaz de formar un organismo entero, así como la placenta y tejidos anexos necesarios para el desarrollo del feto. La totipotencia se da en el huevo o cigoto en animales y en las células meristemáticas de las plantas. Pluripotente.- Capaz de formar todas las líneas celulares del cuerpo, incluyendo las células germinales, y algunas o incluso todos los tipos de células extraembrionarias. Estas células no son capaces de formar la placenta a diferencia de las células pluripotentes. Ejemplo: células madre embrionarias. Multipotente.- Capaz de formar diversas líneas celulares constitutivas de un único tejido o tejidos. Ejemplo: células madre hematopoyéticas. Oligopotente.- Capaz de dar orígen a un número más restringido de líneas celulares constitutivas de un tejido que las células multipotentes. Ejemplo: célula madre neural que puede crear una subserie de neuronas en el cerebro. Unipotente.- Forma una única línea celular. Ejemplo: células madre espermatogónicas. Reprogramación: Es el incremento en la potencia. Esto quiere decir que una célula ya diferenciada y funcional (por ejemplo un linfocito), mediante la reprogramación, se va a transformar en una célula menos diferenciada (por ejemplo en una célula madre hematopoyética) y con potencial de desarrollar otra línea celular (la célula madre hematopoyética de nuestro ejemplo podría diferenciarse en linfocito, neutrófilo o eosinófilo). Es inducida experimentalmente en células de mamíferos mediante manipulación genética, cultivo in vitro, transferencia nuclear o fusión celular. División asimétrica: Generación de diferentes líneas celulares a partir de una única mitosis o división celular. Por ejemplo, en una división asimétrica de una célula madre, una célula hija será una réplica exacta de la madre y la otra será una célula más diferenciada que dará origen a toda una línea celular constitutiva de algún tejido. Factores de transcripción: Proteínas que controlan qué gen debe ser activado o inactivado. Los factores de transcripción se unen a regiones regulatorias del genoma y ayudan a controlar la expresión génica. Factores de crecimiento: Compuestos químicos o biológicos que promueven la diferenciación y crecimiento a partir de las células madre y dan origen a otros tipos de células. INTRODUCCIÓN Para entender el origen de las células madre, debemos describir brevemente el desarrollo del embrión humano. Creado por fertilización in vitro o por el acto sexual, el embrión atraviesa una serie de etapas predecibles de desarrollo. Luego de la fertilización, el óvulo fertilizado es denominado zigoto. El zigoto se divide rápidamente y luego de 3 a 5 días de la fertilización se forma en primer lugar una esfera compacta de alrededor de 12 células, llamada mórula. Luego de 5 a 7 días de la fertilización, las células en división van a originar un embrión consistente en un pequeño cúmulo hueco de aproximadamente 100 células denominado “blastocisto”. El área de interés para los investigadores consiste en la pequeña masa de aproximadamente 30 células que se encuentra en la cara interna del blastocisto, denominada masa celular interna. Estas células son la fuente de las células madre embrionarias (ES cells) (1). Hace más de 25 años, se obtuvieron por primera vez células madre embrionarias de ratón por dos grupos de investigación independientes (2) (3). Sin embargo, no fue hasta los subsecuentes trabajos de Thomson (4) y 28
  29. 29. ARTÍCUlOS CIENTÍFICOS Shamblott (5) que se catalizó el creciente interés en las potenciales aplicaciones terapéuticas de la investigación de las células madre. Las células madre pueden clasificarse de modo general en células madre embrionarias (ES cells) y células madre derivadas de órganos o no embrionarias. Las células madre embrionarias (ES cells) pueden, por procedimientos in vitro, diferenciarse a líneas celulares especializadas pertenecientes a las tres capas germinales embrionarias – ectodermo, mesodermo y endodermo– en presencia de factores inductores físicos y biológicos, y es esta cualidad (pluripotencia) la que puede generar las posibles aplicaciones terapéuticas. LA CIENCIA DE LA PLURIPOTENCIA Las células madre pluripotentes fueron reconocidas como un tipo distinto de célula en los teratocarcinomas. Estos son raros tumores gonadales que presentan una amplia gama de tejidos derivados de las tres capas germinales primarias que constituyen un embrión. Las células diferenciadas del tumor se forman a partir células de carcinoma embrionario (EC cells), las que a su vez se derivan de las células germinales primordiales (PGCs), que son los precursores embrionarios de los gametos. En contraste, las células madre embrionarias (ES cells) se derivan de la pluripotente masa celular interna del embrión en fase de blastocisto y su preimplantación. Y finalmente, las células EG (germinales embrionarias), que se derivan de PGCs cultivadas (6). Fig. 1.- Origen de las células madre pluripotentes humanas. En el esquema observamos las fuentes naturales de las células madre pluripotentes: a) células madre embrionarias, originarias del blastocisto, b) células germinales embrionarias, originarias del feto, y células de carcinoma embrional, originarias de los teratocarcinomas. (Tomado de Nature, Vol. 414, pág. 93, 2001. Traducido por David Amiel). 29
  30. 30. REVISTA CIENTÍFICA RECONOCIMIENTO Las células madre pluripotentes presentan varios atributos en común, que son útiles para su reconocimiento en el laboratorio. Estos incluyen: a) Isozima de la fosfatasa alcalina b) Factor de transcripción Oct4 de dominio POU c) Elevada actividad de telomerasa d) Marcadores de superficie celular específicos reconocidos mediante anticuerpos monoclonales, tales como SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81 (4) CULTIVO DE CÉLULAS MADRE PLURIPOTENTES Una importante propiedad de las células madre pluripotentes es su capacidad de dividirse simétricamente en un cultivo y dar origen a 2 células hijas que son copias exactas de la célula madre de la que provinieron. Usualmente, las líneas de células madre pluripotentes son aisladas y mantenidas sobre capas nutritivas de fibroblastos mitóticamente inactivos. Se sugiere que estas células nutritivas proveen de un factor que suprime la diferenciación o promueve la auto-renovación de las células madre pluripotentes. Originalmente, esta actividad se denominó “actividad inhibitoria de diferenciación” (DIA, en inglés) (7). Al mismo tiempo, otro grupo de investigación liderado por Williams demostró que el factor inhibitorio de leucemia (LIF en inglés), miembro de la familia de las citokinas relacionadas a interleukina-6, era lo mismo que el DIA (8). En el caso de las células madre embrionarias humanas, se han hecho avances concernientes a la mejora de las condiciones de cultivo. Como se sabe, el primer criterio para la investigación sobre las células madre embrionarias humanas es aprovechar su uso en la medicina regenerativa y a diferencia de los agentes farmacológicos, no pueden ser esterilizadas en su etapa final. La mayoría de las líneas celulares de células madre embrionarias han estado expuestas a productos animales, lo cual podría ser una fuente potencial de contaminación (9). Stojkovic, P. et al. reportaron el cultivo de células madre embrionarias humanas (hESCs) en un nuevo sistema nutritivo basado en células semejantes a fibroblastos derivadas de la diferenciación espontánea de hESCs, brindando un sistema genotípicamente homogéneo y más seguro (10). Y por otra parte, el grupo de Lu, J. et al. propuso un enfoque diferente, prescindiendo totalmente de la capa de células nutritivas y en vez de ello se suplementó al medio de cultivo con componentes (April/BAFF, bFGF, Wnt, Insulina, Transferrina, Albúmina y Colesterol) que permitían y mejoraban la libre proliferación de las células hESCs (11). OBTENCIóN DE CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS: EL DEBATE Tal como se ha indicado en líneas anteriores, el trabajo sobre células madre embrionarias humanas involucra la manipulación de embriones humanos. En el trabajo de Thomson, como parte del protocolo, se utilizaron embriones humanos producidos por fertilización in vitro para propósitos clínicos, que fueron donados por individuos luego de su consentimiento firmado y luego de la aprobación por el comité de ética institucional (4); y en el trabajo de Shamblott, se obtuvieron los tejidos gonadales y mesentéricos de embriones humanos postfertilización, de 5 a 9 semanas, provenientes de la finalización terapéutica del embarazo (5). La objeción más importante a la investigación de células madre embrionarias humanas es que se priva a embriones de la capacidad de desarrollarse para formar un ser humano completo (12). Es en ese sentido que la investigación se ha orientado a brindar enfoques alternativos para generar células madre embrionarias, y así reducir o eliminar esta preocupación ética. Se han propuesto las siguientes líneas de investigación: - Células madre embrionarias humanas (ESCs) a partir de blastómeros únicos: Una solución propuesta para el desafío de producir ESCs humanas sin destruir al embrión es retirar una única célula (blastómero) de un embrión en la etapa de 8 células, mediante un procedimiento de biopsia denominado diagnóstico genético pre-implantación (PGD). Este procedimiento es de uso común para el diagnóstico genético del embrión sin dañarlo. El grupo de trabajo de Klimanskaya, I. et. al. logró generar células madre embrionarias humanas a partir de un único blastómero extraído mediante la técnica antes descrita (13). Sin embargo, se requiere de estudios adicionales para robustecer este enfoque. - Transferencia nuclear alterada: Un segundo enfoque, denominado transferencia nuclear alterada, está basado conceptualmente en la transferencia nuclear de células somáticas. Una célula somática es alterada genéticamente antes de ser transferida a un ovocito 30
  31. 31. ARTÍCUlOS CIENTÍFICOS enucleado, de modo tal que la entidad resultante carezca de las propiedades esenciales de un embrión humano. Por ejemplo, se han creado embriones de ratón a partir de células donantes con un gen silenciado que codifica a la Cdx2, proteína necesaria para la implantación (14). Esta propuesta ha ganado gran aceptación en la comunidad pro-vida. Sin embargo, han surgido interrogantes al considerar a este artefacto biológico tan solo como un cúmulo de células o como un embrión defectuoso. - Embriones con crecimiento restringido: Otra sugerencia es derivar células madre de embriones que hayan presentado un arresto en el crecimiento. Estos embriones (generados principalmente durante la fertilización in vitro) son considerados frecuentemente no viables y desechados. Sin embargo, Zhang, T. et al. utilizaron recientemente dichos embriones humanos descartados y a partir de ellos obtuvieron ESCs humanas que cumplían con todos los criterios de pluripotencia y presentaban un cariotipo normal (15). Este trabajo demuestra que no obstante un embrión pierda su capacidad de desarrollo posterior, aún retiene blastómeros viables para generar una línea de ESC. - Reprogramación celular: La reprogramación celular sería una solución alternativa a la derivación de células madre embrionarias a partir de embriones humanos y una solución tanto a los problemas éticos como de compatibilidad inmune. Debido a que esta es la corriente sobre la que se ha trabajado más extensamente, la revisaremos en una sección aparte. REPROGRAMACIóN Y PLURIPOTENCIA La clonación de mamíferos a partir de células donantes diferenciadas ha permitido refutar el viejo dogma que afirma que el desarrollo es un proceso irreversible. Se ha demostrado que un ovocito puede reprogramar un núcleo adulto a un estado embrionario que puede dirigir el desarrollo de un nuevo organismo (16). La importancia del enfoque de reprogramación celular es la posibilidad de generar células madre pluripotentes a fin de ser utilizadas terapéuticamente. Existen 4 enfoques distintos de abordar la reprogramación: a) Reprogramación por transferencia nuclear (clonación) La reprogramación por transferencia nuclear ha sido una herramienta única para evaluar funcionalmente la potencia nuclear, y para hacer la distinción entre las alteraciones genéticas y epigenéticas de diversas células donantes (17). Asimismo la clonación de ratones a partir de neuronas olfatorias postmitóticas genéticamente marcadas ha permitido demostrar que la diferenciación terminal no restringe el potencial de un núcleo de sostener el desarrollo de un animal (18). Sin embargo, la generación de animales por transplante nuclear es extremadamente ineficiente, resultando en la pronta muerte de los clones luego de la implantación, y los pocos clones que sobreviven más allá del nacimiento son con frecuencia afectados de severas anormalidades, tales como la obesidad (19) y muerte prematura (20). Adicionalmente, luego de una serie de estudios realizados en diferentes especies animales, se demostraron tres hechos: a) que los núcleos celulares de mamíferos, al igual que los de anfibios, se vuelven más refractarios a la reprogramación con la diferenciación, b) que la formación de blastocistos y derivación de células madre embrionarias, en contraste al desarrollo fetal, es menos restringida por anormalidades genéticas y epigenéticas, y c) que la derivación de células madre embrionarias a partir de blastocistos clonados es significativamente más eficiente que el potencial de blastocistos clonados de crecer y nacer. Los defectos de desarrollo observados en la clonación reproductiva indican una fallida reprogramación epigenética que se debería manifestar por sí misma en una expresión genética aberrante (17). Cabe destacar a modo anecdótico la expectativa que se originó en la comunidad científica entera cuando Hwang, Y. et al. anunciaron la creación de múltiples líneas de células madre embrionarias humanas específicas de un paciente mediante tecnología de transferencia (21), resultando luego dicho estudio ser un fraude. Fue recién el trabajo de Byrne, J. et al. que pudo demostrar con toda la confiabilidad y validación necesaria luego del antecedente antes mencionado, que la reprogramación por transferencia nuclear de células somáticas era posible en una especie primate, obteniéndose, aunque con una baja eficiencia del 0.7%, la derivación de células madre embrionarias. Byrne hizo también la salvedad de que este estudio demuestra que se deben mejorar las técnicas existentes a fin de lograr una mayor eficiencia antes de su implementación clínica en humanos (22). b) Reprogramación por fusión celular La fusión entre diferentes tipos celulares ha sido usada para estudiar la plasticidad del estado diferenciado. En la mayoría de híbridos, el fenotipo de la célula menos diferenciada es dominante sobre el fenotipo de otra célula más 31

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