SEMINARIO: FUNDAMENTO YPROCEDIMIENTO DE LAS PRUEBAS DEWESTERN BLOTUNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS(Universidad del...
INTRODUCCIÓNEXPOSITOR: VICTOR SALDAÑA ALVA
WESTERN BLOT El Western blot, oinmunoblot, es unatécnica analítica usadapara detectar proteínasespecíficas en unamuestra ...
WESTERNBLOT-METODOS
Secuencia del Western blotElectroforesis de la muestra con las proteinasTransferir las proteinas desde el gel a membrana d...
Secuencia del Western blot – Paso 1Paso 1Electroforesis de las muestras de proteínas:-Las proteínas se desnaturalizan con ...
Transferencia de las proteinas alas membranas Ciertas membranas sintéticas son capaces de unir proteínas de talforma que ...
Transferencia de las proteinas alas membranas
Secuencia del Western blotTransferencia a la membrana de nitrocelulosa: Paso- 2-Las proteínas separadas por tamaño se tran...
Paso 3Incubación con anticuerpos específicos y revelado:Proteína sobre la membranaBloqueo de los sitios no ocupados en lam...
Existen otras tecnicas de revelado de WBsustrato enzima H2O2 productocoloreadoquimioLum Obsluminol HRP si no si muy sensib...
WESTERNBLOT-FUNDAMENTOS
ELECTROFORESIS Para entender la técnica del Western Blot esnecesario comprender que es una electroforesis y enque se basa...
Western Blot La técnica de inmunotransferencia (immunoblotting oWestern blot) es un sistema rápido y muy sensiblepara la ...
TIPOS• Se puede hablar de tipos de western blotsegún el tipo de detección de las proteínas.Directo:• El anticuerpo primari...
MÉTODO DIRECTO
Indirecto• El anticuerpo primario sin marcar reaccionacon el antígeno. Luego, un anticuerposecundario marcado se une al pr...
MÉTODO INDIRECTO
PROCEDIMIENTO
El procedimiento de blottingconsta de 5 etapas:1- Inmovilización de proteínas sobre la membrana, generalmentemedianteelect...
2- Saturación de todos los lugares de unión deproteínas de la membrana no ocupados para evitar launión no específica de an...
4- Incubación del blot con anticuerpos secundarios, oreactivos que actúan de ligando para el anticuerpo primariounido a en...
Lavado de la membrana. Como otros Inmunoensayos, el Western Blot consiste en una seriede pasos de incubación con diferent...
APLICACIONESEXPOSITORA: ANDREA L. ROMÁNSOLANO
diagnóstico Se usa principalmente para determinar lapresencia o ausencia de una proteínaconcreta en una muestra. También ...
- Enfermedades Inflamatorias- Enfermedades Infecto-Contagiosas- Perfil de Citoquinas en Modelos Experimentales- Factores d...
 Prueba de VIH Aunque el VIH suele detectarse mediante la técnica ELISA,el Western Blot se usa como prueba confirmatoria...
 Se emplea como prueba definitiva dela encefalopatía espongiforme bovina,comúnmente llamada "enfermedad de lasvacas locas...
Actualmente, el Western Blot es una de lastécnicas más usadas en el estudio de la biologíamolecular.INVESTIGACIÓN
investigación Con ella se pueden determinar los niveles deuna proteína antes y después de untratamiento, su nivel de fosf...
Pierce ha conseguido optimizar los reactivos que se usan en western,eliminar el paso de bloqueo del western tradicional y ...
técnicas relacionadas La principal razón para transferir yadsorber las proteínas a una membranapara su posterior detecció...
Far-Western Blot Detectiontécnicas relacionadas
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FUNDAMENTO Y PROCEDIMIENTO DE LAS PRUEBAS DE WESTERN BLOT

  1. 1. SEMINARIO: FUNDAMENTO YPROCEDIMIENTO DE LAS PRUEBAS DEWESTERN BLOTUNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS(Universidad del Perú, DECANA DE AMÉRICA)FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICACÁTEDRA DE ANÁLISIS CLÍNICOS IIINTEGRANTES:
  2. 2. INTRODUCCIÓNEXPOSITOR: VICTOR SALDAÑA ALVA
  3. 3. WESTERN BLOT El Western blot, oinmunoblot, es unatécnica analítica usadapara detectar proteínasespecíficas en unamuestra determinada.Mediante unaelectroforesis en gel seseparan las proteínas. Las proteínas sontransferidas desde el gel ala membranaelectroforéticamente.
  4. 4. WESTERNBLOT-METODOS
  5. 5. Secuencia del Western blotElectroforesis de la muestra con las proteinasTransferir las proteinas desde el gel a membrana de nitrocelulosaColoracion de las proteinas para confirmar transferenciaBloqueo de los sitios de union inespecificos remanentes en lamembrana de nitrocelulosaIncubacion con el anticuerpo especifico primarioLavados del anticuerpo no unidoDeteccion del anticuerpo unido utilizando anticuerpos conjugados aperroxidasa de rabano picante (HRP)Revelado con sustrato quimioluminiscente y deteccion con placasradiograficas
  6. 6. Secuencia del Western blot – Paso 1Paso 1Electroforesis de las muestras de proteínas:-Las proteínas se desnaturalizan con calor, SDS y sustancias comobeta mercaptoetanol o ditiotreitol que rompen puentes -S-S--El SDS aporta cargas negativas-Las proteínas corren hacia el ánodo (+) y se distribuyen en el gelde acuerdo a su peso molecularProteínas ya corriendoen el gelFuente de poderMuestra de proteínaspara cargar en el gel
  7. 7. Transferencia de las proteinas alas membranas Ciertas membranas sintéticas son capaces de unir proteínas de talforma que pueden servir como soporte para inmunoensayos,tinciones y otros análisis en fase sólida. Las proteínas unidas adichas membranas mantienen su antigenicidad y son accesibles asondas. En primer lugar las proteínas han de separarse en un gel deacrilamida (1D o 2D PAGE), y antes de teñir el gel, dichas proteínasson electrotransferidas desde el gel hasta una membranaadyacente de nitrocelulosa o PVDF, aplicando un campo eléctrico. La transferencia se puede llevar a cabo en dos tipos de aparatos ypor tanto de dos formas diferentes: transferencia húmeda, enaparatos que poseen cámaras que se llenan de tampón ytransferencia semiseca, en aparatos que no tienen dichas cámarasy por tanto no necesitan tal cantidad de tampón.
  8. 8. Transferencia de las proteinas alas membranas
  9. 9. Secuencia del Western blotTransferencia a la membrana de nitrocelulosa: Paso- 2-Las proteínas separadas por tamaño se transfieren desde el gel a una membrana de nitrocelulosa-Otra vez se aprovecha la carga negativa de las proteínasCassette listo para iniciar transferenciaArmado del cassette de transferenciaEl gel con las proteínas se coloca en el cassette de transferenciaSe quitan las burbujas para asegurarla correcta transferenciaSe detiene la corrida electroforeticaSe desarma con cuidado la cuba electroforetica para liberarel gel con las proteinas separadas por masa
  10. 10. Paso 3Incubación con anticuerpos específicos y revelado:Proteína sobre la membranaBloqueo de los sitios no ocupados en lamembrana con proteína inerte (ej.Albúmina)Incubar con anticuerpo primarioIncubar con anticuerpo secundariomarcado con HRPIncubar con sustrato especificoProteína de interes se ve como una bandaoscuraRevelado quimioluminiscentePaso 4Revelado y análisis:
  11. 11. Existen otras tecnicas de revelado de WBsustrato enzima H2O2 productocoloreadoquimioLum Obsluminol HRP si no si muy sensible3,3´diaminobencidina HRP si marrón no toxicoDAB+niquel HRP si negro no toxico, massensible queDAB3,3´,5, 5´tetrametilbencidinaHRP si azul no productosemisoluble4 cloro naftol HRP si azul-negro no pocosensibleBromocloroindolilfostato +NBTFAL no azul no reaccionlenta yprogresivaNaftol-AS-MX fosfato+ Fast redFAL no rojo no pocosensibleAP/misty purple FAL no purpura no muy estableHRP = peroxidasa / FAL = fosfatasa alcalina
  12. 12. WESTERNBLOT-FUNDAMENTOS
  13. 13. ELECTROFORESIS Para entender la técnica del Western Blot esnecesario comprender que es una electroforesis y enque se basa. Las proteínas suelen tener carga neta; por lo tanto, sise aplica un campo eléctrico a una solución quecontenga una mezcla de proteínas, éstas migrarán auna velocidad que dependerá de su carga neta, formay peso molecular. Esta técnica es conocida comoelectroforesis. Las separaciones electroforéticas se realizan casisiempre en soportes sólidos, generalmente paraseparar una mezcla de proteínas, el soporte deelección son los geles de poliacrilamida.
  14. 14. Western Blot La técnica de inmunotransferencia (immunoblotting oWestern blot) es un sistema rápido y muy sensiblepara la detección y caracterización de proteínas quese basa en la especificidad de reconocimiento entreantígeno y anticuerpo. Implica la separación porelectroforesis en geles de poliacrilamida y unatransferencia cuantitativa e irreversible a unamembrana, de las proteínas de una mezcla compleja(lisado total celular). Los antígenos que se hantransferido a la membrana son reconocidos poranticuerpos monoclonales policlonales específicosde ellos.
  15. 15. TIPOS• Se puede hablar de tipos de western blotsegún el tipo de detección de las proteínas.Directo:• El anticuerpo primario marcado se une alantígeno de la membrana y reacciona con elsustrato originando una señal detectable. Enel método directo de detección, el anticuerpoprimario que se utiliza para detectar elantígeno sobre la superficie de la membrana,debe ir marcado con una enzima
  16. 16. MÉTODO DIRECTO
  17. 17. Indirecto• El anticuerpo primario sin marcar reaccionacon el antígeno. Luego, un anticuerposecundario marcado se une al primario yreacciona con el sustrato. En el métodoindirecto, se añade primero un anticuerpoprimario sin marcar contra el antígeno de lasuperficie de la membrana; posteriormente seañade un anticuerpo secundario marcadocontra el anticuerpo primario.
  18. 18. MÉTODO INDIRECTO
  19. 19. PROCEDIMIENTO
  20. 20. El procedimiento de blottingconsta de 5 etapas:1- Inmovilización de proteínas sobre la membrana, generalmentemedianteelectrotransferencia.Se construye lo que se conocecomo sándwich, donde seapilan sucesivamente unaesponja plana, papelabsorbente, el gel, lamembrana sintética, máspapel y finalmente otraesponja plana.
  21. 21. 2- Saturación de todos los lugares de unión deproteínas de la membrana no ocupados para evitar launión no específica de anticuerpos. “Bloqueo de la membrana”, para prevenir la unión inespecífica delos anticuerpos a otras proteinasla membrana, con el riesgoasociado de tener un elevado “background” o falsos positivos.3- Incubación del blot con anticuerpos primarioscontra la/s proteína/s de interés.Lógicamente, la elección del anticuerpo primario para un Western Blotdependerá del antígeno que se desee detectar y de los anticuerposdisponibles para ese antígeno en concreto.
  22. 22. 4- Incubación del blot con anticuerpos secundarios, oreactivos que actúan de ligando para el anticuerpo primariounido a enzimas u otros marcadores. Como anticuerpos secundarios se suelen emplear anticuerpos quereconocen a las inmunoglobulinas (o sea, el anticuerpo primario).5-Sistema de revelado de las bandas de proteínasmarcadas con el complejo de anticuerpos.
  23. 23. Lavado de la membrana. Como otros Inmunoensayos, el Western Blot consiste en una seriede pasos de incubación con diferentes reactivos (tampones debloqueo, anticuerpos, etc.) separados por pasos de lavado. Estoslavados son necesarios para eliminar los excesos de reactivos nounidos
  24. 24. APLICACIONESEXPOSITORA: ANDREA L. ROMÁNSOLANO
  25. 25. diagnóstico Se usa principalmente para determinar lapresencia o ausencia de una proteínaconcreta en una muestra. También nospuede ser útil para determinar los nivelesde dicha proteína en esa muestra, o eltamaño de esta proteína, ya que endeterminadas enfermedades el problemano es la ausencia total de una moléculasino su reducción o la expresión de unaforma truncada de dicha proteína.
  26. 26. - Enfermedades Inflamatorias- Enfermedades Infecto-Contagiosas- Perfil de Citoquinas en Modelos Experimentales- Factores de Crecimiento- Proteínas de Secreción- Enfermedades Infecto-Contagiosas- Enfermedades Inflamatorias- Perfil de Citoquinas en Modelos Experimentales- Factores de Crecimiento- Proteínas de Secrecióndiagnóstico
  27. 27.  Prueba de VIH Aunque el VIH suele detectarse mediante la técnica ELISA,el Western Blot se usa como prueba confirmatoria cuando elELISA da un resultado positivo en un grupo que no es deriesgo o en una población donde la prevalencia del virus esmuy baja. Mediante el Western blot se buscan los anticuerpos anti-VIHen una muestra de suero humano. Se transfieren a unamembrana las proteínas de células que, se sabe, estáninfectadas por el VIH. Entonces, se incuba el suero que hayque probar con esta membrana. Este paso es equivalente ala incubación con el anticuerpo primario; si hay anticuerposanti-VIH en el suero, serán estos los que realicen el papel deanticuerpo primario. Se lava, para eliminar los anticuerpos nounidos, y la membrana se vuelve a incubar con un anticuerposecundario anti-humano unido a una enzima-señal. Laaparición de bandas indica la presencia de proteínas contralas cuales el suero del paciente contiene anticuerpos, esdecir, el paciente es seropositivo.diagnóstico
  28. 28.  Se emplea como prueba definitiva dela encefalopatía espongiforme bovina,comúnmente llamada "enfermedad de lasvacas locas". Algunas clases de la prueba parala enfermedad de Lyme usan el Westernblot. En veterinaria, ocasionalmente se empleael Western blot para confirmar lapresencia del FIV en gatos.diagnóstico
  29. 29. Actualmente, el Western Blot es una de lastécnicas más usadas en el estudio de la biologíamolecular.INVESTIGACIÓN
  30. 30. investigación Con ella se pueden determinar los niveles deuna proteína antes y después de untratamiento, su nivel de fosforilación u otrasmodificaciones post-traduccionales, etc.
  31. 31. Pierce ha conseguido optimizar los reactivos que se usan en western,eliminar el paso de bloqueo del western tradicional y reducir los tiemposde incubación con los anticuerposFast Western Blot
  32. 32. técnicas relacionadas La principal razón para transferir yadsorber las proteínas a una membranapara su posterior detección con unanticuerpo es que las proteínas en lamembrana se encuentran en la superficiey, por lo tanto, más accesibles a losanticuerpos que si estuvieran imbuidas enun gel de poliacrilamida. No obstante, en los últimos años se hadesarrollado la posibilidad de realizar ladetección de las proteínas dentro delpropio gel sin perdida de sensibilidad; estatécnica conocida como “UnBlot® In-GelDetection” elimina la necesidad de realizarlos pasos de transferencia y bloqueo y,además, permite la detección de proteínasque no se transfieren con eficiencia desdeel gel a la membrana y evita las perdidasde proteínas durante el propio paso detransferencia. Una modificación de la técnica de WesternBlot es su utilización para la búsqueda deinteracciones entre proteínas. La técnica “Far-Western Blot” utiliza unaproteína marcada en lugar de unanticuerpo como sonda en la membrana,la cual reconoce y se une a las proteínasde la membrana a través de interaccionesproteína–proteína, por lo que si se generaseñal en la membrana, indica la presenciade una proteína que interacciona con laproteína-sonda y, además, que dichaproteína posee el peso molecularcorrespondiente a la banda donde seobserva la señal. Este método se suele utilizar para buscarinteracciones desconocidas entreproteínas o para confirmar posiblesinteraccionesDetección en el propio gel(“UnBlot® In-Gel Detection”)Far-Western Blot Detection
  33. 33. Far-Western Blot Detectiontécnicas relacionadas

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