Projecto de Licenciatura (UA)

1. Apresentação do Relatório de Projecto António Ramos Nºmec: 30928 Atriplex patula e o stress ao Mercúrio

2. Sapal É uma zona de transição entre a terra e o mar, em estuários ou baías.

3. Sapal É uma zona caracterizada por: Formas aluvionares Variação periódica das marés Grande diversidade faunística e floristica Elevada produtividade em termos biológicos Elevada Salinidade

4. Sapal – Diversidade Floristíca Flora dominada por espécies halófitas Atriplex patula Arthrocnemum perenne Halimione portucaloides Juncus maritimus

6. Plantas de Sapal - mecanismos de resistência O sapal é uma zona de acumulação de metais, devido a que durante muitos anos foi considerada uma zona de desperdício, e como tal, eram lançados resíduos para as águas dos rios, que mais tarde chegam ao sapal Para resistir a esta contaminação, as plantas desenvolveram mecanismos de resistência

7. Plantas de Sapal - mecanismos de resistência As plantas de sapal possuem mecanismos de resistência a stress causado por excesso de iões tóxicos: Acumulação em glândulas de sal ou em tricomas Acumulação de metais em vacuolos nas partes aereas Ligados a ácidos orgânicos (malato, citrato) Ligados a fitoquelatinas Inibição da absorção de metais do solo Acumulação e imobilização nas paredes celulares

8. Ria de Aveiro

9. Ria de Aveiro É uma lagoa costeira de baixa profundidade Está permanentemente ligada ao oceano através do canal da Barra

10. Ria de Aveiro Principais fontes de água doce são os rios Vouga e Antuã Encontra-se rodeada por áreas habitacionais e industriais que muitas vezes lançam descargas poluentes

11. Ria de Aveiro Nas últimas décadas têm sido lançados residuos ricos em mercúrio para o Rio Antuã que mais tarde chegam à Ria de Aveiro no largo do Larajo

13. Mercúrio Utilizado amplamente: Baterias Barómetros Extracção de ouro Fungicidas Óleos Lubrificantes Lâmpadas Termómetros

14. Mercúrio O estudo da resistência das plantas de sapal à contaminação por Hg é importante para posterior utilização em fitorremediação A espécie Atriplex patula, é de especial interesse pois mostrou ser capaz de produzir elevadas quantidades de ácido oxálico que desempenha funções na tolerância ao stress com metais

15. Atriplex patula O género Atriplex é muito variado e está bem distribuido Contém espécies presentes desde zonas áridas até zonas costeiras Caracterizado por ser extremamente tolerante a elevadas concentrações salinas

16. Atriplex patula Atriplex patula pertence ao grupo das dicotiledóneas e encontra-se na família das Chenopodiaceae É uma planta anual e pode atingir o comprimento de 120 centimetros Em Portugal encontra-se distribuida na zona Centro e Sul litoral, em zonas com terrenos removidos, em solo salinos ou areias de praia

17. Atriplex patula O estudo da resistência desta espécie a várias gamas de concentração de mercúrio é importante no âmbito da sua utilização para fitorremediação de áreas contaminadas

18. Fitorremediação A fitorremediação utiliza sistemas vegetais para recuperar águas e solos contaminados por poluentes orgânicos ou inorgânicos e é considerada uma opção de limpeza de contaminantes de uma área medianamente contaminada a baixo custo e muito eficaz

19. Fitorremediação A ideia é utilizar as plantas como “agente purificador” das águas e solos imobilizando ou acumulando os contaminantes nas suas raízes ou no solo, tornando-os indisponíveis a outras espécies. É uma técnica que visa a melhoria da qualidade das águas e dos solos

20. Fitorremediação Fitorremediação Fitoextracção Fitoestabilização Fitoestimulação Fitovolatilização Fitodegradação Rizofiltração Barreiras hidráulicas

21. Métodos – Culturas in vitro e exposição ao Mercúrio As concentrações de Hg escolhidas para a exposição foram 1 µM, 2 µM e 3µM. Em experiências anteriores, exposições a 5 µM ou superior mostraram ser letais in vitro Condições da cultura in vitro Temperatura: 24ºC Fotoperíodo: 16horas pH: 5,8 Meio MS Devido a: Composição mineral do meio e MS Macronutrientes (g/l) Micronutrientes (mg/100ml) Vitaminas (mg/100ml) KNO 3 – 19 H 3 BO 3 – 620 Ácido Nicotínico – 50 NH 4 NO 3 – 16,5 MnSO 4 .4H 2 0 – 2230 Tiamina.HCl – 50 MgSO 4 .7H 2 O – 3,7 ZnSO 4 .7H 2 O – 860 Mio-inositol – 5000 CaCL 2 .2H 2 O – 4,4 NaMoO 4 .2H 2 O – 25 Piridoxina.HCl – 50 KH 2 PO 4 – 1,7 CuSO 4 .5H 2 O – 2,5 Biotina – 0,5 CaCl 2 .6H 2 O – 2,5 Pantothenate de Calcio - 50

22. Métodos – Culturas in vitro e exposição ao Mercúrio Esterilização das sementes em solução de hipoclorito de cálcio a 4% e posterior lavagem com água destilada esterilizada Preparação do meio de cultura MS e esterilização. Distribuição do meio MS por caixas de petri e frascos Distribuição das sementes por caixas de petri com meio MS Incubar as placas a 24ºC em um foto período de 16 horas Esperar a germinação das sementes e repicar os embrioes para frascos com meio MS Deixar as plantas crescer cerca de duas semanas Repicar as plantas para novos frascos com meio MS tratados com diferentes [Hg] Pesar as plantas expostas ao mercúrio num intervalo de 2 em 2 dias durante cerca de uma semana, calcular a taxa de crescimento Devido a: Todos os procedimentos têm de ser realizados numa câmara de fluxo laminar e ter em conta as condições de assépcia

23. Resultados Foram tiradas fotografias das plantas no final da exposição ao stress (1 semanas) Controlo 1 µM 2 µM 3 µM

24. Resultados Foram tiradas fotografias das plantas no final da exposição ao stress (1 semanas) A planta exposta à maior concentração apresenta-se com os tecidos mortos, resultado da exposição A planta exposta a 2 µM apesar de apresentar sintomas de necrose, ainda possui algumas folhas em bom estado As plantas do controlo e [1 µM] não apresentam sintomas de fitotoxicidade aparente Controlo 1 µM 2 µM 3 µM

25. Resultados Com os valores do peso das plantas foi possível construir um gráfico que representa-se a taxa de crescimento ao longo da exposição Após os dois dias d exposição, as plantas expostas a 2 e 3 µM começaram a apresentar uma taxa de crescimento negativo, que se manteve até ao fim da exposição.

26. Resultados Com os valores do peso das plantas foi possível construir um gráfico que representa-se a taxa de crescimento ao longo da exposição As plantas exposta a 1 µM, apenas após 4 dias de exposição, começaram a mostrar sintomas de stress com uma taxa negativa de crescimento O controlo apresenta um crescimento aberrante, tendo ora taxas de crescimento positivas ora negativas

28. Discussão de Resultados Com base nos resultados obtidos e sabendo que esta espécie utiliza vários mecanismos de resistência à contaminação por mercúrio, podemos dizer que é um espécie com potencial na aplicação para fitorremediação Contudo é necessário continuar o estudo, de modo a saber se acumula mercúrio, que quantidade é capaz de acumular e onde acumula, antes de poder ser aplicado na fitorremediação

29. Fim da primeira parte

30. Comparação de vários protocolos de isolamento de DNA em folha de Vitis vinífera

31. DNA Presente em todos os organismos vivos e sobre várias formas: DNA nuclear, DNA mitocondrial, DNA cloroplastídico, DNA plasmidico Molécula formada por um polímero de nucleótidos em que cada nucleótido possui: Base azotada (Timina, Adenina, Citosina, Guanina) Desoxirribose (açúcar) Grupo fosfato ligado ao açúcar

32. DNA Presente em todos os organismos vivos e sobre várias formas: DNA nuclear, DNA mitocondrial, DNA cloroplastídico, DNA plasmidico Molécula de DNA é formada por duas cadeias de nucleotidos anti-paralelas, Formando uma dupla hélice, onde as bases azotadas de uma cadeia se ligam às da cadeia paralela Este modelo permite a incorporação de toda a informação do funcionamento da célula

35. Vitis vinífera Pertence à família das Vitaceae O nome do género esta relacionado com o fruto que produz: a uva O fruto é geralmente utilizado para a produção de vinho ou uvas de mesa Dependendo do objectivo da produção, utilizam-se diferentes castas (variedades) de Vitis vinífera

36. Vitis vinífera A videira é uma planta arbustiva, trepadeira Cresce bem em zonas com Invernos rigorosos (clima temperado) mas também pode crescer em áreas de clima tropical A propagação da videira é feita por enxertia, pois desta maneira, apresenta vantagens na qualidade e na produtividade

37. Vitis vinífera O isolamento de DNA na videira é complicado por causa da elevada quantidade de contaminantes presentes nas células tais como proteínas, polissacarídeos, polifenois, taninas e pigmentos Para resolver este problema, foram desenvolvidos vários protocolos de isolamento aperfeiçoados Contudo, muitos deles continuam a ter problemas com a pureza do extracto, a quantidade, ou são demorados e complicados

38. Importância de um protocolo standard Isolamento de DNA Sem protocolo standard Com protocolo standard Protocolos diferentes dependendo do objectivo do isolamento Protocolos diferentes para diferentes órgãos Muitos tampões Mais lento devido ao problema de realizar protocolos diferentes Mais caro Maior probabilidade de erro humano Bons resultados, se tudo correr bem Mesmo protocolo para diferentes objectivos Mesmo protocolo para diferentes órgãos Poucos tampões Barato Rápido Probabilidade de erro humano baixa Bons resultados

39. Importância de um protocolo standard Objectivo de um protocolo standard: É proporcionar um método rápido, simples, barato com bons resultados e facilmente repetível caso necessário

40. Métodos Isolamento de DNA: princípios básicos Nesta altura já temos o extracto inicial de DNA. Contudo este tem um elevado numero de contaminantes como proteínas, açúcares, etc. No fim destes passos, devemos ter um extracto de DNA de maior ou menor pureza. Para quantificar o DNA recorremos ao espectofetometro, e/ou recorremos uma electroforese em gel de agarose Para resolver o problema dos contaminantes, alguns métodos utilizam substâncias como PVP que remove polifenois, a adição de NaCl antes de precipitar o DNA com etanol com a função de aumentar a solubilidade dos polissacarídeos no etanol, entre outras substâncias. Nota: Quebrar a parede celular, triturando o material com azoto liquido Membrana celular é desfeita com ajuda de um detergente (ex:CTAB) para que o DNA seja libertado para o tampão de extracção As proteinas são separadas através de desnaturação e precipitação com cloroformio e fenol A precipitação do DNA faz-se com etanol e temperaturas baixas É necessário remover o RNA. Para isto utiliza-se a enzima RNAse

43. Resultados e Discussão Depois de obter os extractos de DNA dos diferentes protocolos, estes foram quantificados espectofotometricamente, e para aqueles que possuíam maior quantidade de DNA, foi corrido uma electroforese em gel de agarose (0,65%)

44. Resultados e Discussão Foram realizadas duas réplicas para cada um dos protocolo, e dado que os resultados entre as réplicas do mesmo protocolo eram diferentes, a avaliação dos resultados vai recair sobre as réplicas com maior quantidade de DNA 1º Protocolo Lodhi 2º Protocolo Stockinger 3º Protocolo Hanania 4º Protocolo Cabrils et al 5º Protocolo Adaptado no laboratório A 260 0,1589 0,0244 0,204 0,3097 0,0989 A 260 /A 280 0,9978 1,3811 0,9438 0,9360 1,1017 Concentração ( µg/g) 264,833 40,667 340 516,167 164,667

45. Resultados e Discussão O 2º protocolo que apresenta baixas quantidades, o que o torna pouco viável quando são necessárias elevadas quantidades Comparando os resultados dos diversos protocolos podemos dizer que: 5º Protocolo obteve a maior pureza, apesar de ter obtido menos quantidade 4º Protocolo obteve o resultado com maior quantidade de DNA, contudo a pureza mantém-se a par com as outras réplicas Os 1º e 2º protocolos, apresentam elevadas quantidades de DNA, mas pouca pureza 1º Protocolo Lodhi 2º Protocolo Stockinger 3º Protocolo Hanania 4º Protocolo Cabrils et al 5º Protocolo Adaptado no laboratório A 260 0,1589 0,0244 0,204 0,3097 0,0989 A 260 /A 280 0,9978 1,3811 0,9438 0,9360 1,1017 Concentração ( µg/g) 264,833 40,667 340 516,167 164,667

46. Resultados e Discussão Observando os índices de pureza para cada protocolo, vemos que nenhum deles se aproxima de 1,8 que é característico de um isolado puro Devido a: Contaminação por proteínas, açucares, etc. A contaminação pode ser devido a: Resultado do próprio protocolo Erro Humano Material mal esterilizado, ou contaminação pós-esterilização Para uma melhor avaliação do estado do extracto de DNA, foram realizadas electroforeses para as réplicas com maior concentração de DNA

47. Resultados e Discussão Bandas de DNA – mostram a presença de DNA Bandas nos poços do gel – causado por contaminações que impediram a completa dissolução do DNA no tampão TE Marcas de arrastamento nas bandas de DNA – a presença indica de DNA fragmentado, causado provavelmente por manuseamento inadequado. 1º Protocolo 2º Protocolo 3º Protocolo 4º Protocolo 5º Protocolo

51. FIM