1. 小胞体モデル異常タンパク質△pro に対する O 型糖鎖付加の試験管内再構成（卒業研究）
http://www.slideshare.net/teapipin/proo-13958755 の台本
注）★は、クリックポイント！！
小胞体品質管理
小胞体は分泌経路における最初のオルガネラです。分泌タンパク質や中央空胞系オルガネ
ラのタンパク質は、リボソームで合成されたのち、小胞体内に取り込まれます。小胞体に
はタンパク質の品質管理機構が存在し、適切なプロセシングを受けて正しい高次構造を形
成したタンパク質のみが、小胞体からゴルジ体以降へ輸送されます。一方、遺伝的変異、
熱ショック、確率論的なミスフォールディングなどが原因で、正しい高次構造を獲得でき
なかった異常タンパク質については、分子シャペロンがその凝集体形成を阻止し、高次構
造の形成を促進するという、修復が試みられます。しかし、最終的に正しい高次構造を形
成できなかった異常タンパク質は、膜透過チャネルである Sec61p 複合体を通じて、サイト
ゾルへ逆向きに輸送され、プロテアソームによって分解されます。★この分解系は小胞体
関連分解 ERAD と呼ばれています。
O 型糖鎖付加
最近酵母で、ERAD の基質となる異常タンパク質の一部が、サイトゾルへ逆向き輸送さ
れずに小胞体内にとどまると、O 型糖鎖付加を受けることが見いだされました。O 型糖鎖
付加は、小胞体内で、プロテイン マンノシル トランスフェラーゼ（Pmt）によって、タ
ンパク質のセリン/スレオニン残基に直接マンノース残基が付加される反応です。この修飾
は、親水性残基である糖鎖を付加することによって、本来は、凝集しやすい性質をもつ異
常タンパク質を可溶化して無毒化する、新しい対処方法である可能性が示唆されています。
★例えば、デルタ ジー プロ アルファファクターという ERAD の基質となる異常タ
ンパク質を基質として用いた場合、in vivo、および、in vitro のアッセイにおいて、O 型糖
鎖付加を受けることが明らかにされています。
また、同様の現象が、pro を基質として用いた in vivo のアッセイで観察されます。pro
とは、糸状菌由来の、アスパルティック プロテアーゼ ワンのプロ配列を欠失させた変
異体であり、ERAD の基質となる異常タンパク質です。しかし、pro を用いた in vitro の
in vitro ERAD /O 型糖鎖付加 アッセイ系は確立していません。
in vitro のアッセイ系のメリットは、様々な物質や因子を添加または除去することで反応
を分割することができるという点にあります。そのため、細胞内で起こる複雑な現象を解
析する手段として、in vitro のアッセイは極めて有効です。現在、ERAD、O 型糖鎖付加に
ついて in vitro でアッセイが行えるのはデルタ ジー プロアルファファクターのみです。
そのため、複数の基質について比較、解析することが重要です。★
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2. 以上のことを踏まえて、本研究では、pro を基質として、酵母の系を用いた in vitro ア
ッセイ系を構築することを目的としました。
in vitro ERAD /O 型糖鎖付加 assay 系
デルタ ジー プロ アルファーファクターにおいてのみ、確立されている in vitro の
ERAD O 型糖鎖付加 アッセイ系を紹介します。方法は、まず、デルタ ジー プロ ア
ルファーファクターを in vitro で合成し、ミクロソームに取り込ませます。★そしてミクロ
ソームを洗浄後、サイトゾル画分と ATP 再生系を加え、★30℃のインキュベートでチェイ
ス反応を行います。すると、ミクロソームに取り込まれたデルタ ジー プロ アルファ
ーファクターが、サイトゾルへ逆向きに輸送され、プロテアソームによって分解される
ERAD が起こります。★このとき、ERAD と同時に、Pmt によって O 型糖鎖付加も起こり
ます。
プレpro の翻訳反応
酵母から調製したミクロソームに、in vitro でタンパク質を取り込ませることに成功した例
は多くはありません。アルファファクターは、in vitro で翻訳終了後にミクロソームに取り
込まれることが示されています。そのため、本研究ではまず最初に、プレpro を酵母ライ
セート中で翻訳し、アルファファクターと同様に、翻訳終了後にミクロソームへ取り込ま
せることを試みました。
この図は、in vitro で 35S メチオニン存在下で、酵母ライセートによってプレpro を合
成した結果です。35ｋDa 付近に期待通りの分子量のタンパク質が合成されました。
プレpro の翻訳終了後の膜透過反応
次に in vitro で合成した、プレpro についてミクロソームへの、膜透過反応を行いました
（レーン 2-5）
。★その後、トリプシン消化を行い、ミクロソームに取り込まれてプロテア
ーゼ耐性になる分子種の検出を試みました（レーン 6-13）
。しかし、このように、プロテア
ーゼ耐性になるバンドは観察されませんでした。このことから、in vitro においてプレpro
は、翻訳が完全に終了した後では、ミクロソームに取り込まれないと判断しました。
プレpro の翻訳と共役した膜透過反応
次に、酵母ライセートによる翻訳系にミクロソームを共存させ、翻訳と膜透過を共役させ
た反応によって、プレpro がミクロソームに取り込まれる可能性について調べました。そ
の結果、このように、プレ配列の切断されたpro が、プロテアーゼ耐性となり、ミクロソ
ームへ取り込まれたことがわかりました。
（野生株由来のミクロソームを用いた）in vitro ERAD /O 型糖鎖付加 assay
次に、pro を取り込んだミクロソームに、サイトゾル画分と ATP 再生系を加え、チェイス
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3. 反応を行いました。チェイス反応後、トリプシン消化を行い、ミクロソーム中に残存して
いるpro の量を定量しました。その結果、まず、pro がチェイス反応に従って減少してい
く様子が観察されました（レーン 1-4）
。また、pro のバンドの上部にこのようなスメアバ
ンドが観察されました（レーン 5-8）。これらを定量したのが下のグラフです。チェイス時
間 0 分のときのpro の存在量を 100％とすると、チェイス反応終了後の 60 分後にはpro
約 35％まで減少したことが分かります。 スメアバンドはチェイス反応終了後に約 65％
また、
増加しました。★一方、pro とスメアバンドの合計量は、チェイス反応中にほとんど変化
しませんでした（Fig.5B）
。この実験から、チェイス反応に従ってpro は減少しましたが、
ERAD による分解は見られず、何らかの修飾を受けていることが予想されました。
（pmt2 株由来のミクロソームを用いた）in vitro ERAD /O 型糖鎖付加 assay
pro は in vivo において、主に小胞体の膜タンパク質 Pmt2p によって、O 型糖鎖付加を受
けます。先ほどのスメアバンドが、pro が O 型糖鎖付加を受けた結果であるかを検討する
ために、Pmt2p を欠失させたpmt2 株由来のミクロソームを用いて同様のチェイス反応を
行いました。★チェイス反応後にトリプシン消化を行った場合、pro のバンドの上部には、
野生株の場合と異なり、スメアバンドは観察されませんでした（レーン 5-8）。このことか
ら、野生株由来のミクロソームを用いたpro の assay では、pro は O 型糖鎖付加を受け
た可能性が示唆されました。
本研究のまとめ
本研究では、モデル異常タンパク質であるpro を in vitro で合成し、酵母由来のミクロ
ソームに取り込ませ、pro の O 型糖鎖付加の in vitro 再構成を試みました。まず、pro
を翻訳と共役した膜透過反応によってミクロソームに取り込ませることに成功しました。
そこへサイトゾル画分と ATP 再生系を加えると、pro は Pmt2p に依存して O 型糖鎖付加
を受けた可能性が示唆されました。
pro を用いた今回のアッセイ系では、ミクロソーム内に存在するpro と O 型糖鎖付加
を受けたと考えられるpro の総量は、チェイス反応中にほとんど変化しませんでした。こ
のことから、pro を基質として用いた場合、ERAD の経路による分解は、再構成されてい
ないと考えられました。この結果は、デルタ ジー プロ アルファファクターの場合も、
in vitro アッセイにおいては ERAD による分解よりも O 型糖鎖付加の方が進行しやすい
ことと一致します。そのため、pro の場合も、その多くが分解経路ではなく O 型糖鎖付加
を受ける経路へ移行したと考えられます。
今後はこの系を用いて、異常タンパク質のＯ型糖鎖付加に関与する因子や、経路を、デ
ルタ ジー プロアルファファクターの場合と比較検討しながら明らかにしていきたいと
考えています。★
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4. （もし質問が来たとき）
cytosol 因子の同定、シャペロンの機能
（教科書通りに答える）
デルタ ジー プロ アルファファクターとは何か？
プロ アルファファクターの 3 つの N 型糖鎖付加部位を置換した変異体で、ERAD の基質
となる異常タンパク質。N 型糖鎖付加は受けないが、O 型糖鎖付加を受ける。
距離の測定
ppro をコードする DNA の終止コドンの直前を制限酵素によって消化した直鎖状 DNA か
ら、転写、翻訳を行い、ppro、tRNA、リボソームの複合体を形成させる。この場合、翻
訳が終了しないために膜透過中間体を形成することが期待される。膜透過反応が途中で停
止したpro が O 型糖鎖付加を受けることができれば、膜透過装置と Pmt2p は近傍に存在
することになる。
ConA による免疫沈降で確認
スメアバンドが O 型糖鎖付加かどうかは、O 型糖鎖を特異的に検出できる抗体で免疫沈降
法 ConA（コンカナバリン A）によって、解析を進める必要がある。
糖鎖付加の可能性は O 型糖鎖付加のみか？
N 型糖鎖付加もあるが、これは Asn-X-Ser/Thr というコンセンサス配列のアスパラギン残
基のアミド基に糖鎖が付加されることが分かっている。しかし、pro はこのコンセンサス
配列を持っていないため、N 型糖鎖付加の可能性はない。N 型糖鎖付加は EndoH（エンド
グリコシダーゼ H）で N 型を切断し、ConA で落とすことで確認できる。
小胞体からゴルジ体への移行への可能性は考慮に入れたか？
サイトゾル画分には、ゴルジ体の因子は除去していない。しかし、機能する状態で残って
いるかどうかは不明。ゴルジ型糖鎖就職を受けているかは、これを認識する抗体で免疫沈
降をすれば分かる。
ERAD の分解効率 in vivo in vitro
GpF 早い 見えるくらい
pro 遅め ほとんど、今回は見えない
ユビキチンはいらない。
因子の要求性→必要なサイトゾル因子を精製して、加えていく必要がある。
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