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小胞体モデル異常タンパク質△pro に対する O 型糖鎖付加の試験管内再構成(卒業研究)http://www.slideshare.net/teapipin/proo-13958755 の台本注)★は、クリックポイント!!小胞体品質管理小胞体は...
以上のことを踏まえて、本研究では、pro を基質として、酵母の系を用いた in vitro アッセイ系を構築することを目的としました。in vitro ERAD /O 型糖鎖付加 assay 系デルタ    ジー   プロ   アルファーファ...
反応を行いました。チェイス反応後、トリプシン消化を行い、ミクロソーム中に残存しているpro の量を定量しました。その結果、まず、pro がチェイス反応に従って減少していく様子が観察されました(レーン 1-4)                ...
(もし質問が来たとき)cytosol 因子の同定、シャペロンの機能(教科書通りに答える)デルタ ジー   プロ アルファファクターとは何か?プロ アルファファクターの 3 つの N 型糖鎖付加部位を置換した変異体で、ERAD の基質となる異常タ...
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台本:小胞体モデル異常タンパク質△proに対するO型糖鎖付加の試験管内再構成(卒業研究)

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小胞体モデル異常タンパク質△proに対するO型糖鎖付加の試験管内再構成(卒業研究)
http://www.slideshare.net/teapipin/proo-13958755
の卒業発表の台本です。

発表時間:12分、質疑応答3分でした。

当時は台本を作って先輩や先生に見てもらってそれを丸暗記して発表していました。
社会人の今では発表する場合は必要なキーワードだけをメモして、
発表時はスライドを見ながらその都度話す内容を作り、
各スライドの最後でメモをちら見して言い忘れたことがないか
確認しながら進めています。

台本を丸暗記なんて方法は今になれば幼かったなぁと思いますが^^、
成長の記録としてアップしてみました。


卒業論文はこちら
http://www.slideshare.net/teapipin/proo-16720850

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台本:小胞体モデル異常タンパク質△proに対するO型糖鎖付加の試験管内再構成(卒業研究)

  1. 1. 小胞体モデル異常タンパク質△pro に対する O 型糖鎖付加の試験管内再構成(卒業研究)http://www.slideshare.net/teapipin/proo-13958755 の台本注)★は、クリックポイント!!小胞体品質管理小胞体は分泌経路における最初のオルガネラです。分泌タンパク質や中央空胞系オルガネラのタンパク質は、リボソームで合成されたのち、小胞体内に取り込まれます。小胞体にはタンパク質の品質管理機構が存在し、適切なプロセシングを受けて正しい高次構造を形成したタンパク質のみが、小胞体からゴルジ体以降へ輸送されます。一方、遺伝的変異、熱ショック、確率論的なミスフォールディングなどが原因で、正しい高次構造を獲得できなかった異常タンパク質については、分子シャペロンがその凝集体形成を阻止し、高次構造の形成を促進するという、修復が試みられます。しかし、最終的に正しい高次構造を形成できなかった異常タンパク質は、膜透過チャネルである Sec61p 複合体を通じて、サイトゾルへ逆向きに輸送され、プロテアソームによって分解されます。★この分解系は小胞体関連分解 ERAD と呼ばれています。O 型糖鎖付加 最近酵母で、ERAD の基質となる異常タンパク質の一部が、サイトゾルへ逆向き輸送されずに小胞体内にとどまると、O 型糖鎖付加を受けることが見いだされました。O 型糖鎖付加は、小胞体内で、プロテイン マンノシル トランスフェラーゼ(Pmt)によって、タンパク質のセリン/スレオニン残基に直接マンノース残基が付加される反応です。この修飾は、親水性残基である糖鎖を付加することによって、本来は、凝集しやすい性質をもつ異常タンパク質を可溶化して無毒化する、新しい対処方法である可能性が示唆されています。 ★例えば、デルタ ジー プロ アルファファクターという ERAD の基質となる異常タンパク質を基質として用いた場合、in vivo、および、in vitro のアッセイにおいて、O 型糖鎖付加を受けることが明らかにされています。 また、同様の現象が、pro を基質として用いた in vivo のアッセイで観察されます。proとは、糸状菌由来の、アスパルティック プロテアーゼ ワンのプロ配列を欠失させた変異体であり、ERAD の基質となる異常タンパク質です。しかし、pro を用いた in vitro のin vitro ERAD /O 型糖鎖付加 アッセイ系は確立していません。 in vitro のアッセイ系のメリットは、様々な物質や因子を添加または除去することで反応を分割することができるという点にあります。そのため、細胞内で起こる複雑な現象を解析する手段として、in vitro のアッセイは極めて有効です。現在、ERAD、O 型糖鎖付加について in vitro でアッセイが行えるのはデルタ ジー プロアルファファクターのみです。そのため、複数の基質について比較、解析することが重要です。★ 1
  2. 2. 以上のことを踏まえて、本研究では、pro を基質として、酵母の系を用いた in vitro アッセイ系を構築することを目的としました。in vitro ERAD /O 型糖鎖付加 assay 系デルタ ジー プロ アルファーファクターにおいてのみ、確立されている in vitro のERAD O 型糖鎖付加 アッセイ系を紹介します。方法は、まず、デルタ ジー プロ アルファーファクターを in vitro で合成し、ミクロソームに取り込ませます。★そしてミクロソームを洗浄後、サイトゾル画分と ATP 再生系を加え、★30℃のインキュベートでチェイス反応を行います。すると、ミクロソームに取り込まれたデルタ ジー プロ アルファーファクターが、サイトゾルへ逆向きに輸送され、プロテアソームによって分解されるERAD が起こります。★このとき、ERAD と同時に、Pmt によって O 型糖鎖付加も起こります。プレpro の翻訳反応酵母から調製したミクロソームに、in vitro でタンパク質を取り込ませることに成功した例は多くはありません。アルファファクターは、in vitro で翻訳終了後にミクロソームに取り込まれることが示されています。そのため、本研究ではまず最初に、プレpro を酵母ライセート中で翻訳し、アルファファクターと同様に、翻訳終了後にミクロソームへ取り込ませることを試みました。 この図は、in vitro で 35S メチオニン存在下で、酵母ライセートによってプレpro を合成した結果です。35kDa 付近に期待通りの分子量のタンパク質が合成されました。プレpro の翻訳終了後の膜透過反応次に in vitro で合成した、プレpro についてミクロソームへの、膜透過反応を行いました(レーン 2-5) 。★その後、トリプシン消化を行い、ミクロソームに取り込まれてプロテアーゼ耐性になる分子種の検出を試みました(レーン 6-13) 。しかし、このように、プロテアーゼ耐性になるバンドは観察されませんでした。このことから、in vitro においてプレproは、翻訳が完全に終了した後では、ミクロソームに取り込まれないと判断しました。プレpro の翻訳と共役した膜透過反応次に、酵母ライセートによる翻訳系にミクロソームを共存させ、翻訳と膜透過を共役させた反応によって、プレpro がミクロソームに取り込まれる可能性について調べました。その結果、このように、プレ配列の切断されたpro が、プロテアーゼ耐性となり、ミクロソームへ取り込まれたことがわかりました。(野生株由来のミクロソームを用いた)in vitro ERAD /O 型糖鎖付加 assay次に、pro を取り込んだミクロソームに、サイトゾル画分と ATP 再生系を加え、チェイス 2
  3. 3. 反応を行いました。チェイス反応後、トリプシン消化を行い、ミクロソーム中に残存しているpro の量を定量しました。その結果、まず、pro がチェイス反応に従って減少していく様子が観察されました(レーン 1-4) 。また、pro のバンドの上部にこのようなスメアバンドが観察されました(レーン 5-8)。これらを定量したのが下のグラフです。チェイス時間 0 分のときのpro の存在量を 100%とすると、チェイス反応終了後の 60 分後にはpro約 35%まで減少したことが分かります。 スメアバンドはチェイス反応終了後に約 65% また、増加しました。★一方、pro とスメアバンドの合計量は、チェイス反応中にほとんど変化しませんでした(Fig.5B) 。この実験から、チェイス反応に従ってpro は減少しましたが、ERAD による分解は見られず、何らかの修飾を受けていることが予想されました。(pmt2 株由来のミクロソームを用いた)in vitro ERAD /O 型糖鎖付加 assaypro は in vivo において、主に小胞体の膜タンパク質 Pmt2p によって、O 型糖鎖付加を受けます。先ほどのスメアバンドが、pro が O 型糖鎖付加を受けた結果であるかを検討するために、Pmt2p を欠失させたpmt2 株由来のミクロソームを用いて同様のチェイス反応を行いました。★チェイス反応後にトリプシン消化を行った場合、pro のバンドの上部には、野生株の場合と異なり、スメアバンドは観察されませんでした(レーン 5-8)。このことから、野生株由来のミクロソームを用いたpro の assay では、pro は O 型糖鎖付加を受けた可能性が示唆されました。本研究のまとめ 本研究では、モデル異常タンパク質であるpro を in vitro で合成し、酵母由来のミクロソームに取り込ませ、pro の O 型糖鎖付加の in vitro 再構成を試みました。まず、proを翻訳と共役した膜透過反応によってミクロソームに取り込ませることに成功しました。そこへサイトゾル画分と ATP 再生系を加えると、pro は Pmt2p に依存して O 型糖鎖付加を受けた可能性が示唆されました。 pro を用いた今回のアッセイ系では、ミクロソーム内に存在するpro と O 型糖鎖付加を受けたと考えられるpro の総量は、チェイス反応中にほとんど変化しませんでした。このことから、pro を基質として用いた場合、ERAD の経路による分解は、再構成されていないと考えられました。この結果は、デルタ ジー プロ アルファファクターの場合も、in vitro アッセイにおいては ERAD による分解よりも O 型糖鎖付加の方が進行しやすいことと一致します。そのため、pro の場合も、その多くが分解経路ではなく O 型糖鎖付加を受ける経路へ移行したと考えられます。 今後はこの系を用いて、異常タンパク質のO型糖鎖付加に関与する因子や、経路を、デルタ ジー プロアルファファクターの場合と比較検討しながら明らかにしていきたいと考えています。★ 3
  4. 4. (もし質問が来たとき)cytosol 因子の同定、シャペロンの機能(教科書通りに答える)デルタ ジー プロ アルファファクターとは何か?プロ アルファファクターの 3 つの N 型糖鎖付加部位を置換した変異体で、ERAD の基質となる異常タンパク質。N 型糖鎖付加は受けないが、O 型糖鎖付加を受ける。距離の測定ppro をコードする DNA の終止コドンの直前を制限酵素によって消化した直鎖状 DNA から、転写、翻訳を行い、ppro、tRNA、リボソームの複合体を形成させる。この場合、翻訳が終了しないために膜透過中間体を形成することが期待される。膜透過反応が途中で停止したpro が O 型糖鎖付加を受けることができれば、膜透過装置と Pmt2p は近傍に存在することになる。ConA による免疫沈降で確認スメアバンドが O 型糖鎖付加かどうかは、O 型糖鎖を特異的に検出できる抗体で免疫沈降法 ConA(コンカナバリン A)によって、解析を進める必要がある。糖鎖付加の可能性は O 型糖鎖付加のみか?N 型糖鎖付加もあるが、これは Asn-X-Ser/Thr というコンセンサス配列のアスパラギン残基のアミド基に糖鎖が付加されることが分かっている。しかし、pro はこのコンセンサス配列を持っていないため、N 型糖鎖付加の可能性はない。N 型糖鎖付加は EndoH(エンドグリコシダーゼ H)で N 型を切断し、ConA で落とすことで確認できる。小胞体からゴルジ体への移行への可能性は考慮に入れたか?サイトゾル画分には、ゴルジ体の因子は除去していない。しかし、機能する状態で残っているかどうかは不明。ゴルジ型糖鎖就職を受けているかは、これを認識する抗体で免疫沈降をすれば分かる。ERAD の分解効率 in vivo in vitroGpF 早い 見えるくらいpro 遅め ほとんど、今回は見えないユビキチンはいらない。因子の要求性→必要なサイトゾル因子を精製して、加えていく必要がある。 4

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