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HEV検出システムの新規構築
http://www.tsukuba-genetech.com/
1
E型肝炎
2
原因ウイルス: HEV
分 類: ヘペウイルス科
主な感染経路: 糞便で汚染された飲み水を介した糞口感染
潜 伏 期 間: 平均6週間
症 状 ・ 慢性化することがある。
・ キャリア化することがある。
・ 終生免疫が成立するか否かは不明。
・ 急性肝炎を発症した場合はA型肝炎に類似。
・ 稀に劇症化し死亡することあり。
・ 妊婦がHEVに感染して発症した場合、劇症化する率が高い。
・ 人獣共通感染症と認識されている唯一の肝炎ウイルスである。
診 断 ・血清学的検査: IgM抗体、IgA抗体の検出(まれに擬陽性、擬陰性がみられる)
・核酸増幅検査: HEV-RNAの検出(特殊な検査;一部の研究室で診断可能)
治 療 方 法: 急性期の対症療法
劇症化した場合は、血漿交換、人工肝補助療法、肝移植など
Genotype1
Genotype2
Genotype3
Genotype4
AvianHEV
3c
3b
3a
0.1 substitutions/site
0.1
Mex-14
I1
C4
C1
SAR-55
P1pSK-HEV-2
C3C5
P2
India
TK15-92l
I4I3HPESVPB1
T3
Morocco
HE-JA2JAK-SaiHE-JI4swJ13-1JSF-Tot03CHE-JK4JYN-Nii02LJYN-Sap01CJSN-Sap-FHJSN-Sap-FH02CHE-JA1HE-JF3
JSW-Sap95JKK-SapHE-JF5HE-JF4JYW-Sap02JTS-Sap02HE-JA19HE-JA37HE-JA41HE-JA36HE-JA28
CCC220
E087-SAP04C
SH-SW-zs1
E067-SIJ05C
swCH31
IND-SW-00-01
swCH25
T1
swGX32
JKO-ChiSai98C
Ch-S-1
JYI-ChiSai01C
HEVN2
swGX40
swDQ
Avian
Osh205swMN06-C1056
swX07-E1
E116-YKH98C
HE-JA04-1911swJ12-4
swJ8-5swMN06-A1288
E088-STM04C
Arkell
HE-JA10JMY-Haw
JKN-Sap
HEV-US1HEV-US2
swMengpSHEV-3
pSHEV-2pSHEV-1
wbJYG1
swJ570
E097-OSA05C
JRA1
JBOAR1-Hyo04JMO-Hyo03L
JSO-Hyo03LJYO-Hyo03LJTH-Hyo03LJDEER-Hyo03LJJT-Kan
HEVN1
wbJSG1
wbJTS1
JMNG-Oki02CJE03-1760F p5B
JE03-1760F p5
JE03-1760F p13-3
JE03-1760F p10JE03-1760F 118d-AlexJE03-1760F p0JE03-1760F 114-A549JE03-1760F wt
HEV遺伝子ORF2塩基配列による分子系統樹
(Genoype1~4が明確に分離できる)
2008年12月の段階で、DNA data bankに登録されているE型肝炎ウイルスのORF2遺伝子全てを解析し、
HEVのウイルス遺伝子をRealtimeRT-PCRで特異的に検出できるprimer set (HEV Universal RealtimeRT-
PCR primer)、Genotype 3およびGenotype 4 を特異的に検出できるprimer set (HEV Genotype3/4 detection
primer)を考案、設計した。
HEV検出システム
HEV Universal RealtimeRT-PCR primer set
↓
HEV Genotype3/4 detection primer set
左図の、発現しているHEV遺伝子を全て検出でき、
さらにGenotype3およびGenotype4の遺伝子を特
異的に検出・同定できる。
人獣共通感染 E型肝炎ウイルス (HEV)検出システム
4
HEV universal primer 設計例1:forward side
HEVuniF83
Geno-
type III
Geno-
type I
II and IV
5
HEVG3F151
Geno-
type III
Geno-
type I
II and IV
HEV universal primer 設計例2:forward side
Frd-18
6
HEVuniR197 HEVuniR223
HEV universal primer 設計例3:reverse side
Geno-
type III
Geno-
type I
II and IV
Rsv-18
7
PrimerのPosition (HEV ORF2 region: ca 2000nt)
431
HEVuniF83
HEVuniR197 HEVuniR223
HEVG3F151
HEVG3R323
HEVG4F150
HEVG4R388
G4
G1,G2,G3
(Note: primer nameの数字はprimerの5’-endのpositionを示す。)
Primer作成)
1) Genotype I~IVまでuniversalに増幅できるprimerを約120bp付近で設計した。
設計参考配列:E型肝炎ウイルス98種類
Genotype I~II 18種類, Genotype III 42種類, Genotype IV 38種類
2) Primer regionは全てのgenotypeの保存領域とした。
3) ForwardおよびReverse primer sequenceのBLAST解析を実施し、Forwardおよび
Reverse ともに全てHEVであった。
*主なプライマーを表示した(青色)。
4)上記プライマーを参考に、PCR産物が100bp以下になるよう再設計(Frd-18, Rsv-18)し、
BLAST解析で全てのHEVを認識することを確認した。
Frd-18 Rsv-18
HEV検出系 H28年版
方法
I. 抽出
ブタ糞
↓ 約80-100mg/ 800-1000ml in PBS
↓ 撹拌, 1分
↓ 遠心, 10Krpm 30秒
↓ 上清
↓ QuickGene RNA tissue kit SII
100ml
II. RT-PCR
RT反応
↓ HEVRT Rsv18 primer: xxxxxxxxxxxxx
* ポジコン用HEV-RNA断片
condition)
65C 60min, 70C 5min, 4C hold
PCR反応
↓ Frd18 primer:xxxxxxxxxxx
Tag primer:ttttttttttt
condition)
95C 9min (1cycle), 95C 30sec 66C 30sec 72C 30sec (28cycles), 72C 5min (1cycle)
電気泳動
HEVRT Rvs-18
5’ 3’
5’ 3’
Frd-18 primer Tag primer
抽出されたHEVRT RNAに対し、HEVRT Rvs-18 primerでcDNAを合成する。
原理
cDNA
cDNAに対し、Frd-18 primerとTag primerで増幅し95bp断片を検出する。
RNA
電気泳動
2.5% agarose gel, 5ml PCR product
A1, A2: ブタ糞 Aから個々に抽出(1,2)
B1, B2: ブタ糞 Bから個々に抽出(1,2)
DW1: RT反応におけるDW(ネガティブコントロール)
DW2: PCR反応におけるDW(ネガティブコントロール)
P: HEV-RNA断片(ポジティブコントロール)
M DW2 DW1 A1 A2 B1 B2 A1+P A2+P B1+P B2+P M
500bp
200bp
10
【検出感度】
1: ポジコン用HEV-RNA断片 (101 molecukes/ ml)
2: ポジコン用HEV-RNA断片 (102 molecukes/ ml)
3: ポジコン用HEV-RNA断片 (103 molecukes/ ml)
4: ポジコン用HEV-RNA断片 (104 molecukes/ ml)
5: ポジコン用HEV-RNA断片 (106 molecukes/ ml)
6: ポジコン用HEV-RNA断片 (101 molecukes/ ml)
7: ポジコン用HEV-RNA断片 (102 molecukes/ ml)
8: ポジコン用HEV-RNA断片 (103 molecukes/ ml)
9: ポジコン用HEV-RNA断片 (104 molecukes/ ml)
10: ポジコン用HEV-RNA断片 (106 molecukes/ ml)
11: DW (1st PCR, nega-con)
12: DW (2nd PCR, nega-con)
1 ~ 5: 090216に調製したRT用サンプル
6~10: 090514に調製したRT用サンプル
*090527にすべてのサンプルをRT反応した。
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M 11 12
・ポジコン用HEV-RNAのロット、保管期間などにより検出感度が異なるが、
電気泳動では10分子以上を検出可能である。
100bp
11
PAS (PrintedArrayStrip)
E型肝炎ウイルスのRNAの検出
1: control (no virus RNA)
2: HEV RNA + 10分子
3: HEV RNA + 1分子
1 2 3
II. RT-PCR
RT反応
↓ HEVRT Rsv18 primer
condition)
65C 60min, 70C 5min, 4C hold
PCR反応
↓ [F-1] Frd18 primer
Biotin Tag primer
condition)
95C 9min (1cycle),
95C 30sec 66C 30sec 72C 30sec (28cycles),
72C 5min (1cycle)
PAS反応
↓ 【展開】 PCR 産物 + 展開液
↓ 【染色】青色染色アビジンビーズ反応
↓ 【乾燥】
12
【結果】
ウイルス98種類をすべて、一セットのプイラマーで検出するの
に、適した領域をin silicoで検討した結果、ORF2の中の一領域
が適していることが判った。PCR産物の大きさ70塩基で、大きさ
が小さいことから、PCRに必要な時間は少なくすることが出来た。
既存のウイルスRNAから、当該領域を含む520塩基を調製し、
各実験の鋳型として、検出感度を求めた。その結果、検出感度
は10分子程度であることが判った。
【考察】
現時点では、E型肝炎ウイルス98種類については、検出できる
ことは判っているが、今後、データベースに登録されている他の
ウイルスが検出できるか、また、今後登録されるウイルスについ
ても、同様にin silicoで検討して行く予定である。

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