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Tecnologia do DNA recombinante

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Tecnologia do DNA recombinante

  1. 1. TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE GOVERNO DO ESTADO DO RIO GRANDE DO NORTE SECRETARIA DO ESTADO DA EDUCAÇÃO, DA CULTURA E DOS DESPORTOS - SECD UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO GRANDE DO NORTE - UERN FACULDADE DE CIÊNCIAS EXATAS E NATURAIS – FANAT DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS – DECB DISCIPLINA: GENÉTICA BÁSICA
  2. 2. CONCEITOS BÁSICOS • Essa tecnologia foi desenvolvida a partir da década de 70 quando foram descobertas as endonucleases de restrição ou enzimas de restrição. • Conjunto de técnicas que permitem a manipulação de moléculas de DNA, considerando seqüências específicas, com a perpetuação de tal seqüência in vivo.
  3. 3. ENZIMAS DE RESTRIÇÃO VETORES DE CLONAGEM DNA LIGASE CÉLULA HOSPEDEIRA SELEÇÃO
  4. 4. CONCEITO DE CLONAGEM MOLECULAR • A origem do termo clonagem vem da Genética Bacteriana. • A técnica central do DNA recombinante é a clonagem molecular • Consiste no isolamento e propagação de moléculas de DNA idênticas.
  5. 5. • Estágios da Clonagem molecular Vetorr DNA recombinante Transformação transformante ou célula transformada Inserto
  6. 6. ENZIMAS DE RESTRIÇÃO • Enzimas Especializadas em degradar DNA exógeno em bactérias. • Função: reconhecer e clivar um DNA estranho. • Sistema de restrição e modificação.
  7. 7. Duas classes de enzimas colocam-se para gerar e propagar o DNA recombinante: • Endonucleases de restrição. • DNA ligases
  8. 8. • Existem três tipos de endonucleases de restrição: I, II e III; • I e II geralmente grandes complexos com múltiplas subunidades contendo tanto a atividade endonucleásica como metilase; sua clivagem é aleatória; • III cliva o DNA a cerca de 25pb da seqüência de reconhecimento.
  9. 9. Há 2 tipos distintos de clivagens: • Extremidades abruptas: os dois cortes ocorrem no eixo de simetria da seqüência específica. • Extremidades coesivas: os cortes são feitos simetricamente, porém, fora do eixo de simetria.
  10. 10. • EcoRI é purificada de uma Escherichia coli que carrega um fator de transferência de resistência RI. • Hind III é isolada da Haemophilus influenzae, linhagem d III.
  11. 11. ENZIMAS DE RESTRIÇÃO INTERESSE IMPORTÂNCIA FAMÍLIA ÚNICA DE FRAGMENTOS
  12. 12. DNA LIGASE • Promove a ligação dos fragmentos de DNA em vetores previamente clivados por endonucleases de restrição.
  13. 13. Junção de duas fitas de DNA A DNA ligase requer um grupo OH livre na extremidade 3' de uma das cadeias de DNA e um grupo fosfato na extremidade 5' da outra cadeia
  14. 14. CONSTRUÇÃO DO DNA RECOMBINANTE Ela atua na clonagem molecular unindo o fragmento de interesse ao vetor utilizado, formando um híbrido vetor/fragmento. A função das ligases na célula é reparar quebras em fitas individuais, que surgem em moléculas de DNA de fita dupla durante a replicação do DNA
  15. 15. Fragmentos de DNA • Fragmentos com extremidades coesivas; • Fragmentos com extremidades não coesivas;
  16. 16. A. Adição de polidesoxiadenina na extremidade 3’ de um fragmento de DNA, e polidesoxitimina na extremidade 3’ de um outro fragmento de DNA; B. Adição de adaptadores às extremidades não coesivas.
  17. 17. CLONAGEM Fragmentos de DNA com extremidades não coesivas podem ser transformadas em coesivas pela adição de poli (A) e poli (T).
  18. 18. Fragmentos de DNA com extremidades não coesivas podem ser transformados em coesivas pela adição de adaptadores e posterior tratamento com a enzima de restrição que reconhece o adaptador.
  19. 19. TRASFORMAÇÃO BACTERIANA TRANSFORMAÇÃO INDUZIDA CAPTAÇÃO DO DNA
  20. 20. CLONAGEM - As bactérias e o vetor são misturados com uma solução de cloreto de cálcio seguido de um choque térmico de curta duração. - Os íons cálcio têm a função de neutralizar as cargas do DNA e da membrana bacteriana, facilitando a passagem do vetor pela membrana no momento do choque térmico.
  21. 21. Vetor - Conceito • Um vetor pode definir-se como um agente capaz de promover uma ou mais etapas no processo global de transferência de material genético. • Plasmídeos • Bacteriófago λ • BACs
  22. 22. VETORES UTILIZADOS EM ANIMAIS Lipossomos Retrovírus ( integram seu DNA ao do hospedeiro) Adenovírus Microinjeção pronuclear Transferência de genes por bombardeamento de partículas (biobalística)
  23. 23. LIPOSSOMOS (in vitro) MICROINJETADOS TODO ESSE PROCESSO É INDUZIDO TRANSCRIÇÃO E TRADUÇÃO
  24. 24. VETORES RETROVIRAIS • Transcriptase reversa (RNA – DNA) e integrase; • Retrovírus: seqüências LTR e ψ e gene exógeno; • Vírus assistentes Genes gag,pol e env( sem ψ – requerida para o empacotamento )
  25. 25. MICROINJEÇÃO EM PRONÚCLEO PIPETA MICROCAPILAR MICROSCÓPIO INVERTIDO
  26. 26. IMPORTÂNCIA DA APLICAÇÃO DESSA TÉCNICAS • O fim da seleção artificial • Xenotransplante • Biorreatores • Terapia gênica
  27. 27. QUESTÕES RELACIONADAS COM A TRANSGENIA • Bioéticas • Ecológicas • Econômicas • Científicas

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