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Seminario molecular

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Seminario molecular

  1. 1. Expression of trisomic proteins in Down syndrome model systemsClaire Spellman, Mahiuddin Ahmed , Daphne Dubacha, Katheleen J. Gardiner. Alexander Betancur Sara Sofía Villegas Molina III Semester
  2. 2. IntroductionDown syndrome is a naturally occurringchromosomal arrangement that hasalways been a part of the humancondition, being universally presentacross racial, gender or socioeconomiclines, and affecting approximately 1 in800 live births, although there isconsiderable variation worldwide.Down syndrome usually causes varyingdegrees of intellectual and physicaldisability and associated medical issues
  3. 3. Introductiongenetic damage caused by atriplication of genetic material forthe chromosome 21 neurological diseases at present, and have a cardiac phenotype similar to typical Mongoloid
  4. 4. trisomy 21 today there are three types of trisomy in error in the 5% has its origin in andistribution of genetic existing additionalmaterial that occurs at genetic contribution in the moment of one of the parents, butfertilization or the first attached to another cell division chromosome 5% present mosaicism, ie the body cells appear with trisomy 21 and others are normal, the disorder occurs in advanced stages of cell division
  5. 5. Introductionlymphoblastic cell line (LCL):are the cells that give rise tofunctional lymphocytes(lymphocyte precursor cells)
  6. 6. Relationship LCL lymphocytes Antibodies Search anomalies (proteins) (abnormalities)chromosomal See alterations down trisomies syndrome
  7. 7. ObjetiveThis study aims to study the genes overexpressed intrisomy effects, especially at the protein level sorelied on lymphoblastic cell line and expression ofantibodies to thereby provide resources for furtherinvestigation of the molecular basis of intellectualdisability and phenotypic factors in the DS
  8. 8. Materiales y MétodosLCL en las líneas celulares se utilizaron 3 controles y 3 DS. Todas las líneas celulares se obtuvieron de individuos entre los 24 y 41 años. En dos de las tres líneas todos eran hombres. Luego las cell se cultivaron en condiciones estándares, se recogieron se lisaron y se preparo el buffer.
  9. 9. Materiales y MétodosRatón y el tejido cerebral: Los cerebros se congelaron en nitrógeno liquido Se les hizo control a los machos con edades entre los 7 y 8 meses Luego se lisan las proteínas para obtener el buffer.
  10. 10. Materiales y MétodosAnticuerpos primarios: Los anticuerpos van dirigidos al HSA21 (20) Luego se estudia con profundidad 6 anticuerpos sobre el brazo largo del cromosoma 21 HSA21
  11. 11. Materiales y MétodosWestern blotting Se determina 20 microorganismos de proteínas lisadas estandarizadas antes por el del intervalo lineal de detección de anticuerpos En geles SDS-PAGE se separaran a 170 voltios por 2. ½ horas Luego de la electroforesis se pasa a la membrana Luego las membranas se bloquean con tris Se incuba durante toda la noche a 4 grados centígrados con anticuerpos primarios
  12. 12. Materiales y Métodos la detecciones de los anticuerpos primarios se hizocon fosfatasa alcalina.Se detectaron señales con quimioluminiscencia.Se despojan las membranas.Se reprobaron con anticuerpos.Luego se determino la expresión de proteínas en latrisomía Vs controles.
  13. 13. Materiales y MétodosBloqueo péptido: Los péptidos se incubaron a una concentración final de 1 mg / ml, junto con anticuerpo primario en 5% (w / v) de leche desnatada seca en TBST durante 1 hora a temperatura ambiente. Las membranas que contienen lisados de control LCL o el control del ratón se incubaron con el anticuerpo primario ± péptido a 4 ° C durante la noche. Tratamientos secundarios de anticuerpos, lavados y detección de señal Se llevaron a cabo como se describió anteriormente por Western Blot.
  14. 14. RESULTADOSLCL ( derivados decontroles depacientes con SD)Corteza de 2populares modelosde ratones:• Ts65dn• Tc1
  15. 15. Tc1• Un cromosoma humano 21 Dentro de los tejidos• Permite que se segregue libremente la HSA21 (96%) Especies de ratones• 3 deleciones internas 40 genes que codifican proteínas Elimina la expresión de• Gen APP proteínas Tc1 es efectivamente trisómico para aproximadamente 120 H2SA1 de ratones (Genes ortólogos)
  16. 16. 1.Validación de anticuerposSe ensayaron los anticuerpos con 20 proteínas 7 proteínas detectaron• 12 anticuerpos detectaron bandas del tamaño bandas esperado en LCL correspondiente s a la corteza del ratón• 8 anticuerpos detectaron bandas del tamaño esperado solo en corteza de ratón.
  17. 17. • Conjunto de anticuerpos detectaron otras bandas del tamaño correcto (Bandas adicionales) • Isoformas • Modificaciones post- transducción • Reactividad cruzada Anticuerpos contra secuencias Solo se detectaron bandas en peptídicas humanas: corteza del ratón mas no en LCL humanos. -Péptido bloqueo con 8 AC. -Baja expresión -No expresión -Péptida antigénico con secuencias de ortólogos para las 20 proteínas
  18. 18. • ZNF294, SIM2, ADARB1 Solo difieren 0, 1 y 3 aa• Donson, SH3BGR, PRMT Tienen menores identidades globales ( 23-60 aa) • Bloqueos de 8 anticuerpos detectaron los objetivos correctos • 6 de 8 proteínas se expresan en el cerebro del ratón
  19. 19. 2. Expresión de proteínas en trisomía
  20. 20. DISCUSSION • The Tc1 model, expression at the RNA level was available only for whole embryo (E14.5) and only for the human gene. • Most DS expression studies have focused on RNA analysis,Maier and because RNA levels are not well correlated with proteinSchwanhä- levels . usse • Two RNA datasets available for DS LCLsAït Yahya- Graison
  21. 21. CONCLUSIONS• Increases in trisomy are relative to 100% for the respective controls.• A little more in proteins with expression in LCLs like mouse cortex I shows high levels of DS.• Between sequences of human antigens and mouse protein there is reactivity of antibodies.• Antigenic peptide blocked detected the correct objetive.
  22. 22. MAPAS SINDROME DE DOWN John Langdon Down Error en la meiosis Trisomía del cromosoma 21 Región critica del cromosoma (DSCR) Retardo mental y rasgos característicos 5 millones de PB y 33 genes Estudio mediante ratones Para verificar la expresión de proteínas trisómicasSara Villegas Molina
  23. 23. Alexander Betancur Salazar
  24. 24. GRACIAS

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