Practica n°9 anteras

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Practica n°9 anteras

  1. 1. 2013 CULTIVO IN VITRO DE ANTERAS Rosmery Cárdenas Hurtado UNIVRSIDAD CATOLICA SANTA MARIA 08/11/2013
  2. 2. CULTIVO IN VITRO DE ANTERAS 1. OBJETIVOS: → Establecer in vitro anteras de Dianthus caryophyllus (clavel). → Evaluar la respuesta del explante bajo la interacción auxina-citoquinina en la inducción de tejido calloso. 2. MARCO TEÓRICO El polen que se encuentra en las anteras, en estado en de microspora, es un gran precursor para el desarrollo de organogénesis indirecta. Esta característica de las anteras conocida se una en el cultivo in vitro, mediante los granos de polen en condiciones adecuadas especificas en un medio de MS enriquecido con 2,4 D que generara una nuevas plantas, por diferenciación de tejido. El cultivo de anteras principalmente sirve para obtener plantas con la mitad de numero de cromosomas normal de la especie a la que pertenece, las plantas haploides serán clones con características iguales al de la planta madre que fue seleccionada para la práctica. De esta forma se puede obtener líneas homocigóticas de plantas sin tener que pasar por la endogamia normal. En la práctica se uso botones de cucarda mediante un método de desinfección, siembra e incubación. Las células gametofíticas conocidas como microsporas o megasporas que son las células sexuales de la planta, se pueden usar como explante en el cultivo de tejidos para obtener una planta haploide. (Roca et al, 1982) Las esporas deben pasar por una etapa llamada via esporofitica que tiene como fin conseguir esporofitos haploides, y dejar el curso normal que pasa en condiciones de campo esta etapa se la conoce curso ontogénico. (Roca et al, 1982) El proceso se llama androgénesis cuando las microsporas originan embriones y plantas, y ginegénesis cuando tiene lugar en el cultivo de óvulos y ovarios. La androgénesis, obtenida mediante el cultivo de anteras, es la técnica más usada para la inducción de haploides y ha demostrado tener gran importancia para el fitomejoramiento. (Roca et al, 1982). Mediante esta técnica, las anteras inmaduras que contienen polen en una etapa especifica de desarrollo se colocan en medios donde el polen inmadura se divide para formar embriones o callos. Transferidos estos a medios de regeneración, se forman plantas. En la mayoría de casos se producen plantas haploides esteriles, pero en algunas especies
  3. 3. ocurre una duplicación espontaea de los cromosomas en las estapas de callos y de regeneración de la planta. Desde que Guha y Maheshwari lo descubrieron en 1964, el cultivo de anteras se ha exedido a mas de 150 especies (Dunwell, 1986). Si embrago, los intentos de integrar esta técnica con el mejoramiento practico se limitan a unos poquísimos cultivos económicamente importantes, a saber, arroz, cebada, trigo, papa, tabaco, colza oleaginosa, y maíz. DESARROLLO DEL CULTIVO DE ANTERAS Se desarrolla en dos etapas principales: * Inducción de microcallos * Regeneración de plantaas INDUCCION DE MICROCALLOS En una primera face del C. A. se induce la formación de microcallos colocando las anteras en un medio cuya composición estimule selectivamente la división mitótica de las microspóras , a expensas de las células somaticas en el filamento, el tejido conectivo y la pared de la antera .El medio para inducir esa formación debe tener al tas concentraciones de auxinas El arroz, el estado de polen optimo para esa inducción es el comprendido entre el unicleado tardio y binucleado temprano . A los 20 dias de cultivo se forma una masa diferenciada de tejido llamada microcallo, el cual contiene mas de 100 celulas por cada microspora involucrada en el proceso . el microcallo alcanza un tamaño de 2 mm alrededor de los 30 o 50 dias. Las anteras (órgano floral de las fanerógamas; se halla en la porción final de los estambres y contiene el polen en unas cavidades denominadas sacos polínicos.) contienen células sexuales masculinas haploides, el polen, los cuales cultivadas en un medio apropiado, pueden regenerar plantas también haploides. Aún cuando durante la evolución pudieron surgir especies haploides solamente entre organismos inferiores, puede ser conveniente durante varias etapas del proceso de mejora disponer de plantas haploides. Estas plantas, también llamadas haplontes, pueden ser obtenidas en diferentes especies, directamente a partir de las células del polen. Ventajas de los haploides  Pueden manifestarse fenotípicamente alelos recesivos que en este estado no pueden ser encubiertos por los alelos dominantes, por esta razón las plantas haploides pueden constituir un material útil para realizar estudios genéticos y mutagénicos.
  4. 4.  Cuando son diploidizados, se obtienen individuos totalmente homocigóticos, eso brinda la posibilidad de la obtención de plantas homocigóticas en una sola generación, a diferencia de los métodos tradicionales de autofecundación o selección, que requieren mucho tiempo para ello y aún así es imposible alcanzar la homocigosis total.  Constituyen un material que no induce poliploidía en experimentos de hibridación somática (fusión de protoplastos). Las dos primeras posibilidades son aprovechadas en la mejora práctica a partir de 1964, donde se desarrolló por primera vez embriones directamente a partir de anteras, sin la intervención del proceso de fecundación. Desde entonces el número de especies en las que se ha podido obtener haploides mediante el cultivo de anteras se ha ampliado a unas 200. Es posible la obtención de haploides a partir de gametos femeninos en los ovarios, pero como el número de los gametos masculinos en las anteras es considerablemente mayor, se prefieren las anteras como material básico para la obtención de haploides 3. MATERIALES I. Material vegetal: a. Botones florales de Dianthus caryophyllus (clavel). II. Medios de cultivo: a. Medio de Murashige y Skoog, suplementado con ANA/ BAP : 15 / 1 III. Material de vidrio: a. Beakers, 250 mL. b. Matraz, 100 mL. c. Tubo de ensayo. IV. Insumos: a. Agua destilada estéril. V. Reactivos: a. Agua destilada estéril. b. Etanol (70%). c. Hipoclorito de sodio (2.5%). VI. Instrumentos: a. Bisturíes. b. Mechero Bunsen. c. Pinzas. VII. Otros: a. Algodón. Ligas. b. Papel secante estéril. c. Plastic wrap. VIII. Equipos:
  5. 5. a. Autoclave. b. Cámara de flujo laminar. c. Estufa. 4. METODOLOGÍA: Se utilizará como explantes anteras procedentes de botones florales de Dianthus caryophyllus (clavel) Realizar la desinfestación del material vegetal, aislamiento de los explantes y su respectiva inoculación. 5. PROCEDIMIENTO: → El material vegetal ha utilizarse son los botones de clavel que estén cerrados sin flores ya que todavía no habido polinización y así podremos encontrar las anteras estériles. → Los botones los desinfestaremos con etanol por 30¨ (segundos) y luego con lejía por 3´ (minutos). → En la cámara de flujo laminar enjuagaremos tres veces el material vegetal con agua estéril. → Luego realizaremos los cortes para facilitar la obtención de anteras.
  6. 6. → Realizar un raspado para hacer caer las anteras en el medio de cultivo. 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Mediante esta técnica, las anteras inmaduras que contienen polen en una etapa especifica de desarrollo se colocan en medios donde el polen inmadura se divide para formar embriones o callos. RESULTADOS: MATERIAL VEGETAL CANTIDAD Sanos y vigorosos Necrosados Contaminados Hongos Fenolizados 34 / 34 0 / 34 0 / 34 0 / 34 0 / 34 7. CONCLUSIONES En el cultivo de anteras no todos lograron a formar callo de las 34 anteras solo 1 llegaron a salir callo debido al tiempo 8. CUESTIONARIO:  ¿En que consiste la microesporogénesis y cuales son sus fases? Si hacemos un corte transversal de una antera en desarrollo vemos cada un de los cuatro lobulos o sacos polínicos ocupados por las células madres de la microspora (Fig. A y B). Mediante un proceso especial de division celular llamado meiosis, por medio del cual s reduce en medio de cromosomas, cada celula madre de la microspora se divide dos veces, dando origen a cuatro microsporas, cada una de las cuales contiene el numero básico de cromosomas (1N) según la especie (Fig. C) Cada microspora, después de una división de su nucleo, se dessarrolla hasta convertirse en un grano de polen (Fig. D). inmediatamente antes de la dehiscencia
  7. 7. de las anteras, el nucleo del grano del polen se divide, generalente por la mitosis, para formar dos nucleos conocidos uno como nucleo vegetativo y el otro como nucleo generativo. En esta etapa del desarrollo, la pared de la microspora se convierte en la envoltura del grano del polen, antes de la dehiscencia, esta pared se engrosa y la superficie externa toma una forma, tamaño y textura caracteristica de cada especie. El nucleo generativo se divide, según la especie, antes o despues de la distribucion del polen , y da origen a dos gametas masculinas o nucleos espermaticos. El proceso de formacion del polen se denomina microsporogenesis.  ¿Cuál es la importancia del cultivo in vitro de anteras en el fitomejoramiento? Mediante esta técnica, las anteras inmaduras que contienen polen en una etapa específica de desarrollo se colocan en medios donde el polen inmaduro se divide para formar embriones o callo. Transferidos éstos a medios de regeneración, se forman plantas. En la mayoría de los casos se producen plantas haploides estériles, pero en algunas especies ocurre una duplicación espontánea de los cromosomas en las etapas de desarrollo del callo y de regeneración de la planta. Desde que Guha y Maheshwari lo descubrieron en 1964, el cultivo de anteras se ha extendido a más de 150 especies. Condiciones que afectan el cultivo de anteras:  Genotipo de las plantas donantes.
  8. 8. El genotipo es quizás el factor más importante que afecta el cultivo de anteras. La capacidad genotípica general para el cultivo de anteras, se han determinado, en la cebada y en el trigo, rasgos heredados independientemente respecto a componentes específicos de la androgénesis, como la inducción de callo y la regeneración de plantitas. se demostró que ambos rasgos eran altamente heredables, lo que sugería la posibilidad de obtener una ganancia rápida en la selección.  Albinismo. Aunque no se ha comprendido plenamente el fenómeno, hay pruebas de que el albinismo está relacionado con la supresión del ADN de los plásmidos. Usar plantas híbridas como donantes de anteras se considera un método práctico para aumentar el número de plantas productoras de polen Il u st r a c i ó n 1 a l bi n i smo en pl a n t a s
  9. 9.  Nombrar 4 especies que se obtienen mediante el cultivo in vitro de anteras. Definir la especie, características de la planta donante, pretratamiento de las anteras, medio nutritivo utilizado, concentración de reguladores de crecimien to y las condiciones de incubación de los cultivos. especie arroz (Oryza sativa L. ) característic as de la planta semillas de los genotipos ‘Cimarrón’, ‘D-oryza’ y ‘D-sativa’ fueron sembradas y se seleccionaro n al azar de tres a cuatro flósculos por cada genotipo y se procedió a extraer las anteras pre-tratamiento de las anteras Las panículas fueron cortadas desde la base de la planta y colocadas en bolsas plásticas, para luego ser sometidas a un tratamiento térmico de 4ºC durante 7 d. Esto se realizó con la finalidad de reducir el número de microsporas anormales y permitir la liberación de sustancias endógenas esenciales para la androgénesis ( medio de cultivo utilizado medio de inducción estuvo compuesto por las sales de Nistch (Nistch y Nistch, 1969), medio de regeneraci ón estuvo constituido por las sales de Murashige y Skoog (1962), concentración de reguladores condiciones de incubación tiamina-HCl (2,5 mg/L), acido nicotínico (2,5 mg/L), piridoxina-HCl (2,5 mg/L), glicina (2,5 mg/L), (2,4-D, 2 mg/L), picloram (0,07 mg/L), cinina (KIN, 0,5 mg/L), AgNO3 (10 mg/L) y maltosa (50g/L). El pH se ajustó a 5,8. mio-inositol (100 mg/L), tiamina-HCl (0,1 mg/L), ácido nicotínico (0,5 mg/L), piridoxina-HCl (0,5 mg/L), glicina (2 mg/L), (ANA, 1 mg/L), cinina (4 mg/L) y maltosa (30 condiciones ambientales fueron de total oscuridad para la fase de inducción, con temperatura de 25 ± 2ºC y humedad relativa de 60-70%. imagen
  10. 10. trigo las espigas se cosecharon cuando los ápices de las florecencias alcanzaban 3 / 4 de la distancia existente entre la base de la vaina de la segunda hoja Frio:  Aplicado a las espigas después de cosecharlas  Aplicadas una vez sembradas  En el material vegetal no resibio tratamiento de frio se empleo una temperatura de 4° por 4 a 7 dias Presión osmótica: Fue introducida a manitol 0,8 M por 1 hr antes de ser sembradas (este tiene el efecto de inducir a la celula a producir un aminoácido, que favorece la embriogénesis) Luz: Las espigas fueron incubadas bajo la luz o en completa oscuridad por 10 dias N8 Potato-2 MS Moraes-F Serina, glicina, glutamina y mayor cantidad de inositol 10 % de extracto de papa junto con los micronutrientes Mismos nutrientes que N8 Mismos nutrientes que N8 Cámara de crecimiento a 25°C, con una irradiación de 50 µEm2/seg y con un fotoperiodo de 16 hr de luz y 8hr de oscuridad
  11. 11. cafe ESPÁRRA GO (Asparagus officinalis L.) Choque térmico: Los botones floreales fueron sometidos a dos regímenes de temperatura (5 y 28°C) Se para tratar de inducir cambio colectaron androgénico el tiempo fue de botones 2, 4 y 8 dias. florales en diferentes Choque térmico y estado de centrifugación: desarrollo De 5°C durante dos timpos se de exposición y a tres sembraron 5 tiempos de de centrifugación anteras por (3,000 rpm) plato Choque osmótico: 30 anteras en dos concentraciondes de sacarosa 20 y 40 % Anteras con un tamaño de 1,5 a 2 mm (coincidente con el estado uninucleado de las microsporas ) y se mantuvieron en heladera durante 24 horas a 4°C. inmersión en etanol al 70 % seguido por 5 minutos en una solución de hipoclorito de sodio al 3 % de cloro activo con posteriores lavados de agua bidestilada estéril. Medio murashige y skoog (MS) y medio Gamborg (B-5) medio Murashige y Skoog (1962) (MS) Concentracione s de citoquininas y auxinas 2 mg.l-1 de ácido naftalenacético (ANA) y 1 mg.l-1 de bencilaminopuri na (BAP). El pH del medio fue ajustado a 5,9. Se colocaron en una cámara de crecimiento en completa oscuridad y temperatura de 28°C ± 2°C oscuridad durante 6-8 semanas y a una temperatura de 28±2°C transfiriéndo se a cámaras con una temperatura de 25±2°C y un fotoperíodo 16 hs hasta la aparición de callos con una
  12. 12. intensidad lumínica de 50 µE.m2.s-1. 9. BIBLIOGRAFÍA  OBTENCIÓN DE PLANTAS A PARTIR DE ANTERAS DE ESPÁRRAGO (Asparagus officinalis L.)- MUÑOZ, Sebastián1; ESPÓSITO, María Andrea1; CRAVERO, Vanina1; GARCÍA, Stella2; LÓPEZ ANIDO, Fernando1; COINTRY, Enrique1. http://www. fcagr. unr.edu. ar/Investigacion/revista/rev9/3. htm

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