Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Fundamentos y aplicaciones QFB Roger Iván López Díaz

Requerimientos de la prueba Agua libre de nucleasas . Catión divalente (MgCl2). Desoxinucleótidos (dNTPs). Solución amortiguadora y sales. Oligonucleótidos (primers). Enzima (Taq polimerasa). 5´-GTTGACTTGATAGGCTA -3´

Catión divalente Los iones de magnesio estimulan a la enzima Taq polimerasa para que incorpore los dNTP´s.

Desoxinucleótidos Son 4 los dNTP´s involucrados en un PCR típico; dATP, dCTP, dGTP, dTTP. Provee de nucleótidos (base + azúcar + fosfato) a la reacción para la síntesis de ADN. Se incorporan a un ADN molde de manera complementaria, para realizar una copia exacta de este.

Pasos de la técnica de PCR Las cadenas de ADN son separadas en dos hebras sencillas. Los primers se unen por complementariedad a las cadenas molde, deacuerdo a su Tm. La enzima Taq polimerasa, adiciona los nucleótidos correspondientes en las nuevas cadenas sintetizadas por complementariedad de pares de bases.

Alineación 3’ 5’ Alineación de los primers 3’ 5’ 3’ 5’ Proceso en el que dos secuencias de ADN (primers y cadena molde) forman puentes de hidrógeno. La alineación se lleva a cabo por enfriamiento de la mezcla de reacción, después del paso de desnaturalización según la Tm de los primers empleados. 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’

Elongación del ADN La Taq polimerasa se une al templado de ADN y comienza a adicionar los nucleótidos que son complementarios a la cadena molde. La temperatura óptima de acción de la enzima Taq polimerasa son 72ºC.

Ciclo de replicación Desnaturalización. Alineación. Elongación.

Equipo de amplificación y detección en PCR de tiempo real Cada tubo pasa frente la misma fuente de luz excitatoria, la cual atraviesa las paredes laterales, y la fluorescencia emitida retorna al mismo sistema de detección, en este caso un tubo fotomultiplicador. LEDS y filtros que determinan rangos de longitud de onda. Todos los tubos pasan por el detector cada 150 milisegundos. La rotación garantiza la uniformidad de la temperatura del aire del sistema.