Métodos para la siembra y mantenimiento de virus en laboratorio.

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Métodos para la siembra y mantenimiento de virus en laboratorio.

  1. 1. Métodos para la siembra y mantenimiento de virus en laboratorio. A diferencia de lo que sucede con la mayoría de las bacterias, hongos y protozoos, sólo pueden multiplicarse en el interior de las células vivas, no pudiendo hacerlo en un medio nutritivo carente de células. Los sistemas celulares utilizados para propagar los virus en el laboratorio son: Animales de experimentación Embriones animales Cultivos celulares artificiales Animales de experimentación: La inoculación en animales de experimentación de muestras clínicas o de virus para su aislamiento o propagación, es una técnica poco empleada debido a diversas dificultades como el entrenamiento de los animales, la laboriosidad de la inoculación y el peligro de difusión del virus con las excretas de las animales. Se emplea únicamente cuando se trata de propagar virus cuya replicación en los otros sistemas - embriones cultivos celulares - no es posible. Los animales más utilizados: monos, los cobayos y los ratones lactantes. Embriones animales Los más utilizados son los embriones de pollo, los huevos fecundados se incuban hasta el momento de su inoculación que suele oscilar entre 5 y 14 días. Las inoculaciones, que pueden realizarse en diversas zonas del embrión (cavidad amniótica, saco vitelino o cavidad alantoidea). Se requiere de experiencia para su realización debido al tipo de inoculación y extracción. La inoculación en la cavidad amniótica es la más utilizada para el aislamiento del virus a partir de muestras clínicas. Los virus sólo pueden reproducirse en determinadas partes del embrión; por consiguiente, se deben inyectar en la región apropiada, ej. Losmixovirus crecen bien en la membrana corioalantoidea, en tanto que el virus de la parotiditis prefiere la cavidad alantoidea. La infección puede producir una lesión tisular local conocida como pústula, cuyo aspecto, a menudo, es característico del virus.
  2. 2. El método exacto de inoculación y la edad del embrión Que se emplea, dependen del virus problema. ej. Para aislar en forma primaria el virus de la influenza a partir de material recogido de la garganta, suele inocularse este en la cavidad amniótica de embriones de 7 a 8 días; pero el virus se duplica fácilmente en la membrana alantoidea de embriones de 12 a 13 días, después de varias resiembras (“adaptación”) en el amnios. Los focos más utilizados para la inoculación, a parte de las cavidades amniótica y alantoidea, son la membrana corioalantoidea y el saco vitelino. Algunas veces, puede inyectarse directamente el virus en el embrión en desarrollo, recurriendo a la inoculación intravenosa, intraperitoneal o intracerebral. Una vez que se duplicó el virus dentro de las células de las membranas o del embrión, puede liberarse a los líquidos vecinos, los cuales constituyen entonces una buena fuente de virus. P. ej. el virus de la influenza, que se duplica en el sistema respiratorio del embrión y en las células de la membrana amniótica, pasa al líquido amniótico, que luego puede recogerse con una jeringa y aguja. En cambio, otros virus, como p.ej. los de la viruela y el herpes, que se duplican en la membrana corioalantoidea, siguen unidos a las células en las lesiones o “pústulas” que se forman sobre dicha membrana. Al moler y deshacer en una solución salina isotónica las membranas, logran liberarse estos virus. En consecuencia el crecimiento de un virus en un embrión de pollo puede provocar la muerte del embrión (p.ej. virus de la encefalitis), producir pústulas o placas sobre la membrana corioalantoidea (como herpes, viruela, vacuna), desarrollar hemaglutininas en los líquidos o tejidos embrionarios (p.ej. influenza) o desarrollar virus infectante (p.ej. poliovirus tipo 2). En el caso de los virus herpes y vaccinia, estos se pueden cuantificar por la técnica de inoculación de huevos embrionados al correlacionar el número de pústulas contadas con la dilución viral inoculada. Actualmente el método preferido para cultivar virus de influenza aviar es la inoculación en huevos embrionados libres de patógenos específicos (SPF) o huevos negativos a anticuerpos específicos (SAN). El sobrenadante de los centrifugados de las muestras se inocula en el saco alantoideo de al menos 5 huevos de 9-11 días de incubación y se incuba a 35-37ºC durante 4-7 días. Luego los huevos con embriones muertos, cuando esto ocurra, o los que queden al final del periodo de incubación se refrigeran a 4 ºC y el líquido alantoideo se chequea con la prueba de hemaglutinación. Si se detecta actividad de hemoaglutinatión hay una probabilidad alta de la presencia de virus A de influenza o de un paramixovirus aviar. Los fluidos que den reacción negativa deben inocularse al menos en otro lote de huevos.
  3. 3. Entre los lugares deinoculación tenemos: Membrana Corioalantoidea: Se emplean embriones de 10 – 12 días y La cantidad de inóculo es de 0.1 – 0.5 ml. Apropiada especialmente para el aislamiento y cultivo de virus variolicos; virus de laringotraqueitis aviar y de la enfermedad de Beyer(Pseudorrabia); que provocan focos o pústulas fácilmente visibles. Cavidad Alantoidea: Se emplean embriones de 9 – 12 días y la Cantidad de inoculo es de 0.1 – 0.2 ml. Entre los virus que desarrollan en el endodermo alantoideo tenemos: peste, New Castle, virus de la bronquitis infecciosa, encefalitis equina occidental y oriental Venezuela, parotiditis. Ventaja: simplicidad de la inoculación y toma de muestra Cavidad Amniótica Se emplean embriones de 7 – 15 días y la cantidad de inóculo es de 0.1 – 0.2 ml. la edad de los mismos depende fundamentalmente del tipo de virus o del estudio que se realiza.
  4. 4. Saco Vitelino Se emplean embriones de 5 – 8 días de incubación y la cantidad de inóculo es de 0.2 – 1 ml. Vía es sumamente adecuada para el aislamiento y cultivo de los virus de enfermedades venéreas, neumonía y rickettsias. El vitelo es empleado para la preparación de vacunas y como antígeno para reacciones serológicas de los virus ya mencionados. Vía Intravenosa La membrana corialantoidea está irrigada por vasos sanguíneos, es susceptible de inoculación para casos especiales, virus queocasionan cambios hematológicos; por ejemplo, virus de la Leucemia. Son empleados embriones de 10 - 15 días y la cantidad de inóculo es de 0.02 - 0.05 ml.
  5. 5. Vía Intracerebral (embrión) Se emplea embriones de 8 – 14 días, específicamente para virus que producen alteraciones cerebrales: la rabia, herpes, etc; 0.01 –0.02 ml. EFECTO CITOPÀTICO (CPE),´ Los virus invaden las células causando normalmente algún tipo de cambio visible en el crecimiento de las células .Ejemplo efecto citopàtico (CPE), es un deterioro delas células del cultivo de tejidos causado por el virus.´ La CPE puede tener diferentes aparienciasdependiendo de un virus particular y del tipo decélulas en el cultivo. Cambios morfológicos visibles en célulasinfestadas con virus. Incluye la paralización del ARN celular y de lasíntesis de proteínas, fusión celular, liberaciónde enzimas lisosomales, cambios en lapermeabilidad de las membranas celulares,cambios difusos de las estructurasintracelulares, presencia de cuerpos deinclusión virales, y aberraciones cromosómicas EFECTOS CITOPATOGÉNICOS´ Los efectos citopatogénicos virales aportan unvalioso método para la identificación yclasificación de los virus que producen lainfección. MATERIALES Y MÉTODOS
  6. 6. Material de Laboratorio: • Ovoscopio. • Tijera Quirúrgica. • Agua Destilada. • Azul de Metileno. • Agujas Hipodérmicas. • Placas Petri amplias. Los virus pueden propagarse en las membranas extraembrionarias o en el propio embrión. Anatómicamente el huevo embrionado de gallina presentan en su estructura las siguientes partes: 1.- Embrión 2.- Cavidad amniótica 2a.- Membrana amniótica 3.- Saco vitelino 4.- Albúmina 5.- Cavidad alantoidea 6.- Membrana corioalantoidea 7.- Membrana externa del huevo 8.- Cáscara 9.- Cámara de aire Cultivos celulares Se trata de multiplicar y mantener células in vitro. La células se obtienen de un fragmento de un órgano u embriones de pollo, por trituración y posterior disgregación con tripsina (enzima), lo que permite obtener células aisladas que se introducen en frascos con medos de cultivo líquidos adecuados (botellas o placas Petri). Las células en los frascos pueden estar en suspensión, es decir, libres en el medio de cultivo líquido o adosadas a la pared del frasco y bañadas por el medio (las células producen un material glicoprotéico que permite su adhesión a las superficies). En el primer caso se trata de células en suspensión y en segundo en monocapa.
  7. 7. El medio de cultivo utilizado para los cultivos celulares es bastante complejo, e incluye aminoácidos, vitaminas, sales, glucosa y buffer de bicarbonato. Para un mejor crecimiento, se da la adición de una pequeña cantidad de suero sanguíneo, y también suele añadirse varios antibióticos para impedir la contaminación bacteriana. También se añade un indicador de pH coloreados para evidenciar esta contaminación. Algunos cultivos celulares pueden crecer indefinidamente y constituyen las llamadas líneas celulares permanentes, estos cultivos son más convincentes para investigación vírica. En otros casos no ocurre un crecimiento indefinido, pero permanece vivo por unos días, estos son los llamados cultivos primarios, que aunque también sean útiles hay que prepararlos en cada análisis. Acción citopática: Lesión que causan algunos virus a las células in vitro. Pueden ser intensas y precoces, produciendo en 24 o 48 horas la muerte celular, acompañada de lisis fácilmente observable al inspeccionar los cultivos celulares con microscopio. El efecto citopático es muy diferente debido al tipo de virus. En otras ocasiones las alteraciones morfológicas que se producen en las células son mínimas o tardías y muy difíciles de detectar. En las células infectadas por determinados virus pueden observarse cuerpos de inclusión. Los cuerpos de inclusión pueden visualizarse, después de la tinción de las células con hematoxilina-eosina, como masas con morfología más o menos característica y localización nuclear o citoplasmática típica, según los virus que los originan. Están constituidos por acúmulos del material vírico sintetizado depositados en zonas celulares alteradas.

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