Cinética enzimatica

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Cinética enzimatica

  1. 1. Buscando
el
mecanismo
y
la
velocidad
de reacción

con
la
ciné3ca
enzimá3caLa
ciné(ca
enzimá(ca
sirve
para:•Determinar
las
afinidades
de
fijación
de
sustratos
e
inhibidoresde
una
enzima.•Si
 conocemos
 la
 forma
 en
 que
 varía
 la
 velocidad
 de
 reacción(además
 de
 otra
 información),
 se
 puede
 elucidar
 el
 mecanismocatalí(co
de
la
enzima.•Conocer
el
papel
de
la
enzima
en
un
proceso
metabólico
global.•Casi
 siempre,
 la
 velocidad
 de
 la
 reacción
 es
 proporcional
 a
 lacan(dad
 de
 enzima
 presente,
 por
 lo
 que
 las
 determinacionesenzimá(cas
se
basan
en
estudios
ciné(cos.
  2. 2. Deduciendo
el
modelo
de
Michaelis‐Menten Leonor
Michaelis Maud
Menten
  3. 3. Análisis
de
los
componentes
de
una
reacción
enzimá3caSe
consideraque
el
sustratoestá
en
excesocon
respecto
ala
enzima. Estado estacionario. Premisa
más importante
en
el modelo
de Michaelis
Menten
  4. 4. La
fase
transitoria
o estado
pre‐ estacionario,
se encuentra
dentro
de los
primerosmomentos
de
reacciónEn
esta
etapa
la
concentración de
ES
aumenta
  5. 5. El
efecto
de
la
concentración
de
sustrato
sobre
la velocidad
de
reacción
se
explica
con
la
ecuación
de Michaelis‐MentenEje
y=
Velocidadinicial(Vo).Antes
de
que
el Hipérbola10%
del
S
se rectangularconvierta
en
P. Enzima
saturada. (Vo) Toda
en
forma
ES Ni
siquiera
a
10KM
se ob(ene
un
valorKM
=Vmax/2 certero
de
Vmáx. Eje
x=
[S]
  6. 6. Saturación
de
una
enzima
por
su
sustratoBaja
[S]





















50%
[S]
o
Km











Alta,
saturante
[S]
























































































































o
Vmax













































































(Todo
en
ES)



  7. 7. Linearizando
la
gráfica
hiperbólica
con dobles
recíprocos… Ecuación
de
Lineweaver‐BurkVo
=
Velocidad
inicialVmáx
=
Velocidad
máxima[S]
=
Concentración
de
sustratoKm
=
Constante
de
Michaelis
  8. 8. Gráfica
de
Lineweaver‐Burky= m x + b Ecuación de la recta
  9. 9. Significado
de
los
parámetros
ciné3cos KM VmáxLa
concentración
de
sustrato
a
la Cuando
la
enzima
estáque
la
velocidad
de
reacción
es
la completamente
saturadamitad
de
la
máxima. Cuando
predomina
la
forma
ES KM
=Vmax/2 Cuando
se
(enen
ALTAS
[S],
o
seaEs
una
medida
de
la
afinidad
de
la [S]>>Km,
Vo=Vmáxenzima
por
el
sustrato. Constante
de
especificidadUna
enzima
con
un
KM
pequeñologra
una
eficeincia
catalí(ca
alta
a Parámetro
que
permite kcat comparar
las
eficienciasuna

concentración
de
sustrato KM catalí3cas
de
las
rxspequeña. Constante
catalí3ca
o
número
de
recambio. Número
de
moléculas
de
sustrato
que
son transformadas
por
una
molécula
de
enzima

por unidad
de
(empo.
Medida
de
eficiencia
catalí3ca.
  10. 10. Valores
de
KM,
kcat
y

kcat/KM
de
algunas enzimas
y
sustratos
  11. 11. Inhibición
enzimá3ca: Reducción
en
la
ac3vidad
catalí3ca
de
la
enzima Modificación
irreversible
de
la
enzima.
Unión Irreversible COVALENTE
del
inhibidor
a
los
aminoácidos
de la
enzima
(si(o
ac(vo).Inhibición Unión
 NO
 COVALENTE
 del
 inhibidor
 al
 si(o ac(vo
 o
 a
 otro
 si(o
 de
 la
 enzima,
 limitando
 así su
capacidad
de
catalizar
una
reacción. Reversible La
 ac(vidad
 enzimá(ca
 se
 restaura
 cuando
 el inhibidor
es
removido
del
medio. Inhibición •COMPETITIVA Reversible •NO
COMPETITIVA
(MIXTA) •ACOMPETITIVA
  12. 12. Inhibición
compe33va Inhibidor
compe33vo.
Sustancia que
compite
directamente
con
un sustrato
normal
por
un
si(o
de fijación
enzimá(co.
Se
parece
al sustrato
pues
se
fija
al
si(o
ac(vo pero
difiere
en
que
no
es
reac(vo. Reduce
la
[E] libre
disponible para
la
fijaciónNo
produc(vo del
sustrato.
  13. 13. Gráfica
de
Michaelis‐Menten
en
presencia
de un
inhibidor
compe33vo Donde:αKm= Km aparente
  14. 14. Gráfica
de
Lineweaver‐Burk
en
presencia
de un
inhibidor
compe33vo y = m x + b•La
Km
aumenta
por
el
factor
α.Se
necesita
mayor
concentraciónde
sustrato
para
alcanzar
Vmax/2•Una
can(dad
alta
de
sustratopuede
desplazar
al
inhibidor,alcanzando
la
Vmax
normal Km aumenta Vmax no cambia -1/Km
  15. 15. El
malonato
es
un
inhibidor
compe33vo Enzima: Succinato deshidrogenasa (SDH)
  16. 16. Inhibición
nocompe33va
o mixta No
produc(vos •El
inhibidor
se
une
a
un
si(o dis(nto
del
si(o
ac(vo
de
la
enzima, es
independiente
del
sustrato. •Puede
unirse
tanto
a
la
enzima
E como
al
complejo
ES. •La
conformación
de
la
enzima cambia
y
se
afecta
un
paso
catalí(co que
disminuye
o
elimina
la
ac(vidad.
  17. 17. Gráfica
de
Michaelis‐Menten
en
presencia
de un
inhibidor
no
compe33voDonde:
  18. 18. Gráfica
de
Lineweaver‐Burk
en
presencia
de
un inhibidor
no
compe33vo
o
mixto y = m x + b•El
inhibidor
no
afecta
launión
del
sustrato.
La
Kmno
cambia.•Inac(va
a
la
enzima,
unavez
que
se
une
a
ella
yforma
el
complejo
EI•Mientras
más
EI
se
forme,menos
ES
se
tendrá
ydisminuirá
la
Vmax. Vmax
disminuye Km
NO
cambia
  19. 19. Inhibición acompe33va(incompe33va,uncompe33ve) No
produc(vo El
inhibidor
acompe((vo
se
une directamente
al
complejo
enzima‐ sustrato
pero
no
a
la
enzima
libre, por
lo
que
la
unión
del
sustrato
es indispensable
para
la
unión
del inhibidor.
  20. 20. Gráfica
de
Michaelis‐Menten
en
presencia
de un
inhibidor
acompe33vo Control Vo + inhibidorDonde: Vmax / 2 [S] Km
  21. 21. Gráfica
de
Lineweaver‐Burk
en
presencia
de
un inhibidor

acompe33vo
(incompe33vo) y = m x + b•En
altas
[S],
Vo
esaprox.
Vmax/α’.•Por
lo
tanto
esteinhibidor
disminuyeVmax•La
Km
aparentedisminuye. Vmax
disminuye Km
disminuye
  22. 22. Ejemplo
de
inhibidor
acompe33vo:
Inhibición de
la
fosfatasa
alcalina
por
fenilalanina •Cataliza
la
liberación
de
fosfato
inorgánico
a par(r
de
ésteres
de
fosfato. •Involucrada
en
la
deposición
de hidroxiapa(ta
en
células
osteoides
durante
la formación
de
hueso. •Es
un
marcador
clínico:
Su
aumento
puede ser
causa
de
enfermedad
ósea
de
Paget, hepa((s,
etc.
  23. 23. No
olvides
la
diferencia! Inhibidor
compe33vo vs.
no
compe33vo
  24. 24. Resumen
del
cambio
de
los
parámetros
deMichaelis‐Menten
en
diferentes
3pos
de
inhibición
  25. 25. Resumen
del
efecto
de
los
inhibidores

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