Isolasi dan Skrining Fitokimia Isoflavon dari Biji Kedelai (Gysine Max.)

3,990 views

Published on

Published in: Health & Medicine
1 Comment
2 Likes
Statistics
Notes
No Downloads
Views
Total views
3,990
On SlideShare
0
From Embeds
0
Number of Embeds
2
Actions
Shares
0
Downloads
308
Comments
1
Likes
2
Embeds 0
No embeds

No notes for slide

Isolasi dan Skrining Fitokimia Isoflavon dari Biji Kedelai (Gysine Max.)

  1. 1. ISOLASI DAN SKRINING FITOKIMIA ISOFLAVON DARI EKSTRAK METANOL BIJI KEDELAI (Glycine max) Untuk Memenuhi Sebagian Tugas Mata Kuliah Fitofarmasi yang dibina oleh Ayu Ristamaya Yusuf., A.Md., S.T OLEH : RAHAYU WAHYU NINGSIH 12.091 AKADEMI FARMASI PUTRA INDONESIA MALANG Oktober 2013
  2. 2. I. PENDAHULUAN Tanaman merupakan sumber kekayaan alam yang memiliki peran penting disetiap aspek kehidupan manusia terutama di bidang kesehatan. Keberagaman tanaman yang tersedia di alam menjadikan tanaman memiliki manfaat dan khasiat yang beragam pula. Disetiap bagian tanaman dari akar, daun, batang, bunga, dan biji memiliki kandungan senyawa-senyawa kimia yang berbeda. Senyawa yang ada dalam tanaman itulah yang memiliki khasiat obat. Salah satu tanaman yang bisa digunakan sebagai obat adalah kedelai (Glysin max). Bagian tanaman kedelai yang memiliki kandungan senyawa kimia bermanfaat terbanyak adalah pada bagian bijinya. Biji kedelai mengandung senyawa-senyawa antioksidan diantaranya adalah vitamin E, vitamin A, provitamin A, vitamin C dan senyawa flavonoid golongan isoflavon, genistein dan daidzein. Senyawa antioksidan terutama dari golongan isoflavon yang memiliki aktivitas sebagai penangkal radikal bebas dan pencegahan penyakit kanker. Konsumsi pangan yang mengandung antioksidan tinggi perlu ditingkatkan untuk mengurangi jumlah penderita penyakit degeneratif seperti kanker. Isoflavon dalam biji kedelai merupakan suatu metabolit sekunder yang berperan sebagai antioksidan alami yang mampu memberikan perlindungan dan menjaga kesehatan tubuh, serta mencegah timbulnya berbagai penyakit. Antioksidan yang terdapat dalam tubuh harus terdapat dalam jumlah yang memadai. Oleh karena itu, jika terjadi peningkatan radikal bebas dalam tubuh, dibutuhkan antioksidan dalam jumlah yang lebih banyak untuk meminimalisasi dan menetralisasi efek radikal bebas. Kedelai sebagai sumber antioksidan isoflavon telah dijadikan sebagai primadona karena mudah diperoleh dalam makanan sehari-hari dan merupakan komoditas yang populer di masyarakat. Berbagai produk olahan kedelai telah banyak dimanfaatkan masyarakat untuk mencukupi kebutuhan gizi sebagai bahan makanan. Karena begitu pentingnya fungsi tanaman ini, serta dugaan terhadap adanya senyawa golongan flavonoid yang dikandung, maka pada penelitian ini dilakukan isolasi dan identifikasi senyawa golongan flavonoid dari biji kedelai (Glycine max). Serangkaian isolasi dimulai dari preparasi simplisia, ekstraksi flavonoid biji kedelai dengan metanol, selanjutnya dipartisi menggunakan HCl dan n-heksan, hingga akhirnya didapatkan isolat isoflavon. Identifikasi dan pengujian dilakukan dengan skrining fitokimia dan kromatografi lapis tipis (KLT). Setelah didapatkan isolat isoflavon, bisa dibuat menjadi bentuk sedian kapsul isoflavon.
  3. 3. Kapsul isoflavon ini memiliki khasiat sebagai suplemen makanan tepatnya sebagai antioksidan. Antioksidan ini berperan sebagai penangkal radikal bebas yang bisa mencegah berbagai penyakit. II. TUJUAN Untuk mengeksplorasi senyawa isoflavon dari kacang kedelai agar lebih bermanfaat sebagai antioksidan. III. TINJAUAN PUSTAKA 3.1 Kedelai Kedelai merupakan tanaman semusim dengan tinggi berkisar 10–200 cm, berupa semak rendah, tegak, berdaun lebat, dapat bercabang sedikit atau banyak tergantung kultivar. Tanaman ini tumbuh baik pada tanah dengan pH 4.5 dan daerah pertumbuhannya tidak lebih dari 500 m di atas pemukaan laut. Nama botani kedelai yang dibudidayakan adalah Glycine max (Gambar 1), dengan klasifikasi sebagai berikut: Kingdom : Plantae Divisio : Spermatophyta Classis : Dicotylodenae Ordo : Rosales Familia : Papilionaceae Genus : Glycine Species : Glycine max (L.) Merill Kedelai sebagai bahan makanan mempunyai nilai gizi yang cukup tinggi dan merupakan sumber protein, lemak, vitamin, mineral, dan serat yang paling baik. Kandungan protein kedelai sekitar 30–50% (b/b), tetapi kadar karbohidratnya hanya sekitar 22–29% (b/b). Kadar lemaknya antara 16–20% (b/b), sedangkan kadar total gula sekitar 7.97% (b/b) (Liu 1997). Hasil utama dari kedelai adalah bijinya. Biji kedelai juga mengandung mineral-mineral kalsium, fosfor, besi, dan klor. Bentuk biji ada yang bundar, lonjong, gepeng, dan bulat telur. Warnanya tergantung dari varietas, ada yang hitam, kuning kehijauan, putih kekuningan, dan kuning gading.
  4. 4. 3.2 Penggolongan Flavonoid Flavonoid merupakan kelompok senyawa fenol terbesar yang terdapat di alam. Senyawa- senyawa ini merupakan zat warna merah, ungu, biru, dan kuning yang ditemukan dalam tumbuh-tumbuhan. Flavonoid memiliki kerangka dasar 15 atom karbon, terdiri dari dua cincin benzena yang dihubungkan oleh rantai linear tiga karbon dan dapat dinyatakan ke dalam konfigurasi C6-C3-C6 Flavonoid mengandung sistem aromatik yang terkonjugasi sehingga menunjukkan pita serapan kuat pada daerah spektrum sinar ultraviolet dan spektrum sinar tampak, umumnya dalam tumbuhan terikat pada gula yang disebut dengan glikosida. (Harborne, 1996) Pada flavonoida O-glikosida, satu gugus hidroksil flavonoid (atau lebih) terikat pada satu gula (lebih) dengan ikatan yang tahan asam. Glukosa merupakan gula yang paling umum terlibat dan gula lain yang sering juga terdapat adalah galaktosa, ramnosa, silosa, arabinosa, dan rutinosa. Waktu yang diperlukan untuk memutuskan suatu gula dari suatu flavonoid O-glukosida dengan hidrolisis asam ditentukan oleh sifat gula tersebut. Pada flavonoid C-glikosida, gula terikat pada atom karbon flavonoid dan dalam hal ini gula tersebut terikat langsung pada inti benzena dengan suatu ikatan karbon-karbon yang tahan asam. Gula yang terikat pada atom C hanya ditemukan pada atom C nomor 6 dan 8 dalam inti flavonoid, misalnya pada orientin. (Markham, 1988) Menurut Robinson (1995), flavonoid dapat dikelompokkan berdasarkan keragaman pada rantai C3 yaitu : 1. Flavonol Flavonol paling sering terdapat sebagai glikosida, biasanya 3-glikosida, dan aglikon flavonol yang umum yaitu kamferol, kuersetin, dan mirisetin yang berkhasiat sebagai antioksidan dan antiimflamasi. Flavonol lain yang terdapat di alam bebas kebanyakan merupakan variasi struktur sederhana dari flavonol. Larutan flavonol dalam suasana basa dioksidasi oleh udara tetapi tidak begitu cepat sehingga penggunaan basa pada pengerjaannya masih dapat dilakukan.
  5. 5. 2. Flavon Flavon berbeda dengan flavonol dimana pada flavon tidak terdapat gugusan 3- hidroksi. Hal ini mempunyai serapan UV-nya, gerakan kromatografi, serta reaksi warnanya. Flavon terdapat juga sebagai glikosidanya lebih sedikit daripada jenis glikosida pada flavonol. Flavon yang paling umum dijumpai adalah apigenin dan luteolin. Luteolin merupakan zat warna yang pertama kali dipakai di Eropa. Jenis yang paling umum adalah 7-glukosida dan terdapat juga flavon yang terikat pada gula melalui ikatan karbon-karbon. Contohnya luteolin 8-C- glikosida. Flavon dianggap sebagai induk dalam nomenklatur kelompok senyawa flavonoid.
  6. 6. 3. Isoflavon Isoflavon merupakan isomer flavon, tetapi jumlahnya sangat sedikit dan sebagai fitoaleksin yaitu senyawa pelindung yang terbentuk dalam tumbuhan sebagai pertahanan terhadap serangan penyakit. Isoflavon sukar dicirikan karena reaksinya tidak khas dengan pereaksi warna manapun. Beberapa isoflavon (misalnya daidzein) memberikan warna biru muda cemerlang dengan sinar UV bila diuapi amonia, tetapi kebanyakan yang lain tampak sebagai bercak lembayung yang pudar dengan amonia berubah menjadi coklat.
  7. 7. 4. Flavanon Flavanon terdistribusi luas di alam. Flavanon terdapat di dalam kayu, daun dan bunga. Flavanon glikosida merupakan konstituen utama dari tanaman genus prenus dan buah jeruk; dua glikosida yang paling lazim adalah neringenin dan hesperitin, terdapat dalam buah anggur dan jeruk.
  8. 8. 5. Flavanonol Senyawa ini berkhasiat sebagai antioksidan dan hanya terdapat sedikit sekali jika dibandingkan dengan flavonoid lain. Sebagian besar senyawa ini diabaikan karena konsentrasinya rendah dan tidak berwarna. 6. Katekin Katekin terdapat pada seluruh dunia tumbuhan, terutama pada tumbuhan berkayu. Senyawa ini mudah diperoleh dalam jumlah besar dari ekstrak kental Uncaria gambir dan daun teh kering yang mengandung kira-kira 30% senyawa ini. Katekin berkhasiat sebagai antioksidan. 7. Leukoantosianidin
  9. 9. Leukoantosianidin merupakan senyawa tan warna, terutama terdapat pada tumbuhan berkayu. Senyawa ini jarang terdapat sebagai glikosida, contohnya melaksidin, apiferol. 8. Antosianin Antosianin merupakan pewarna yang paling penting dan paling tersebar luas dalam tumbuhan. Pigmen yang berwarna kuat dan larut dalam air ini adalah penyebab hampir semua warna merah jambu, merah marak , ungu, dan biru dalam daun, bunga, dan buah pada tumbuhan tinggi. Secara kimia semua antosianin merupakan turunan suatu struktur aromatik tunggal yaitu sianidin, dan semuanya terbentuk dari pigmen sianidin ini dengan penambahan atau pengurangan gugus hidroksil atau dengan metilasi atau glikosilasi.
  10. 10. 9. Khalkon Khalkon adalah pigmen fenol kuning yang berwarna coklat kuat dengan sinar UV bila dikromatografi kertas. Aglikon flavon dapat dibedakan dari glikosidanya, karena hanya pigmen dalam bentuk glikosida yang dapat bergerak pada kromatografi kertas dalam pengembang air. (Harborne, 1996) 10. Auron
  11. 11. Auron berupa pigmen kuning emas yang terdapat dalam bunga tertentu dan briofita. Dalam larutan basa senyawa ini berwarna merah ros dan tampak pada kromatografi kertas berupa bercak kuning, dengan sinar ultraviolet warna kuning kuat berubah menjadi merah jingga bila diberi uap amonia. (Robinson, 1995) 3.3 Ekstraksi Senyawa Flavonoid Ekstraksi dapat dilakukan dengn metoda maserasi, sokletasi, dan perkolasi. Sebelum ekstraksi dilakukan, biasanya serbuk tumbuhan dikeringkan lalu dihaluskan dengan derajat kehalusan tertentu, kemudian diekstraksi dengan salah satu cara di atas. Ekstraksi dengan metoda sokletasi dapat dilakukan secara bertingkat dengan berbagai pelarut berdasarkan kepolarannya, misalnya n-heksana, Eter, Benzena, Kloroform, Etil asetat, Etanol, Metanol, dan Air. Ekstraksi dianggap selesai bila tetesan terakhir memberikan reaksi negatif terhadap senyawa yang diekstraksi. Untuk mendapatkan larutan ekstrak yang pekat biasanya pelarut ekstrak diuapkan dengan menggunakan alat rotari evaporator. (Harborne, 1996)
  12. 12. 3.4 Isoflavon Isoflavon termasuk dalam golongan flavonoid yang merupakan senyawa polifenolik. Stuktur kimia dasar dari isoflavon hampir sama seperti flavon, yaitu terdiri dari 2 cincin benzen (A dan B) dan terikat pada cincin C piran heterosiklik, tetapi orientasi cincin B nya berbeda. Pada flavon, cincin B diikat oleh karbon nomor 2 cincin tengah C, sedangkan isoflavon diikat oleh karbon nomor 3 (Schmidl dan Labuza, 2000). Pada umumnya, senyawa isoflavon banyak ditemukan pada tanaman kacang- kacangan atau leguminosa (Zubik dan Meydani, 2003). Isoflavon pada kedelai terdapat dalam empat bentuk, yaitu 1. Bentuk aglikon (non gula) : genistein, daidzein, dan glycitein; 2. Bentuk glikosida : daidzin, genistin dan glisitin; 3. Bentuk asetilglikosida : 6”-O-asetil daidzin, 6”-O- asetil genistin, 6”-O-asetil glisitin; 4. Bentuk malonilglikosida : 6”-O-malonil daidzin, 6”-O-malonil genistin, 6”-O- malonil glisitin. Isoflavon utama pada kedelai terdiri dari genistein (4’,5’7-tryhydroxyisoflavone) dan daidzein (4’,7-dihydroxyisoflavone), serta turunan β-glikosida, gensitin dan daidzin. Ditemukan juga sejumlah kecil senyawa isoflavon lainnya seperti glycitein (7,4’-dihydroxy-6-methoxy- isoflavone) dan glikosidanya (Wang dan Murphy, 1994). Secara alami, isoflavon pada kedelai hampir seluruhnya terdapat dalam bentuk β-glikosida (glikon). Bentuk glikosida dipertahankan oleh tanaman sebagai bentuk inaktif sehingga dibutuhkan sebagai antioksidan. Menurut Naim et al . (1974), sebanyak 99 % isoflavon pada kedelai terdapat dalam bentuk glikosida, terdiri dari 64 % genistin, 23 % daidzin dan 13 % glisitin. Komposisi ini biasanya terdapat pada makanan olahan kedelai yang tidak difermentasi seperti susu kedelai, tofu, tepung kedelai, konsentrat protein kedelai dan isolat protein kedelai. Pada makanan olahan kedelai yang mengalami proses fermentasi seperti miso dan tempe, isoflavon dalam bentuk bebas (aglikon) lebih dominan (Coward et al., 1998). Sebagian besar isoflavon dalam kedelai atau produk olahan kedelai terdapat dalam bentuk glikosida seperti genistin, daidzin dan glisitin yang berkonjugasi dengan mengikat satu molekul gula. Ketika produk kedelai dikonsumsi, bentuk glikosida isoflavon didegradasi menjadi senyawa aglikon dalam bentuk bebas yang dihasilkan oleh pelepasan glukosa dari glikosida.
  13. 13. Proses degradasi glikosida menjadi aglikon seperti genistein, daidzein dan glisitein dikatalis oleh enzim glukosidase dalam usus halus. Isoflavon dalam bentuk aglikon lebih mudah diserap oleh usus halus sebagai bagian dari misel yang dibentuk oleh empedu. Sirkulasi isoflavon dalam darah bersifat kompleks, karena sebagian larut lemak dan sebagian berikatan dengan protein dengan kekuatan yang lemah. Isoflavon kemungkinan didistribusikan melalui darah ke hati, atau didaur ulang sebagai bagian dari cairan empedu dan sirkulasi enterohepatik. Ekskresi akhir isoflavon terjadi pada feses dan urin (Schmidl dan Labuza, 2000). 3.5 Metode Isolasi Senyawa Flavonoid oleh Harborne Dalam metoda ini, daun yang segar dimaserasi dengan MeOH, lalu disaring. Ekstrak MeOH dipekatkan dengan rotari evaporator. Lalu ekstrak pekat yang dihasilkan, diasamkan dengan H2SO4 2M, didiamkan, lalu diesktraksi dengan Kloroform. Lapisan Kloroform diambil, lalu diuapkan, sehingga dihasilkan ekstrak polar pertengahan (Terpenoida atau senyawa Fenol). (Harborne, 1996) 3.6 Kromatografi lapis tipis Kromatografi Lapis Tipis pada plat berlapis yang berukuran lebih besar, biasanya 5x20 cm, 10x20 cm, atau 20x20 cm. Biasanya memerlukan waktu pengembangan 30 menit sampai satu jam. Pada hakikatnya KLT melibatkan dua fase yaitu fase diam atau sifat lapisan, dan fase gerak atau campuran pelarut pengembang. Fase diam dapat berupa serbuk halus yang berfungsi sebagai permukaan penyerap atau penyangga untuk lapisan zat cair. Fase gerak dapat berupa hampir segala macam pelarut atau campuran pelarut. (Sudjadi, 1986). Pemisahan senyawa dengan Kromatografi Lapis Tipis seperti senyawa organik alam dan senyawa organik sintetik dapat dilakukan dalam beberapa menit dengan alat yang harganya tidak terlalu mahal. Jumlah cuplikan beberapa mikrogram atau sebanyak 5 g dapat ditangani. Kelebihan KLT yang lain ialah pemakaian jumlah pelarut dan jumlah cuplikan yang sedikit. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan salah satu metode pemisahan yang cukup sederhana yaitu dengan menggunakan plat kaca yang dilapisi silika gel dengan menggunakan pelarut tertentu. (Gritter,1991). Nilai utama Kromatografi Lapis Tipis pada penelitian senyawa flavonoid ialah sebagai cara analisis cepat yang memerlukan bahan sangat sedikit. Menurut Markham, Kromatografi Lapis
  14. 14. Tipis terutama berguna untuk tujuan berikut: a. Mencari pelarut untuk kromatografi kolom b. Analisis fraksi yang diperoleh dari kromatografi kolom c. Identifikasi flavonoid secara ko-kromatografi. d. Isolasi flavonoid murni skala kecil e. Penyerap dan pengembang yang digunakan umumnya sama dengan penyerap dan pengembang pada kromatografi kolom dan kromatografi kertas. (Markham, 1988). Fase diam yang digunakan pada KLT adalah silika gel GF254 dan sebagai fase gerak digunakan n- heksana, kloroform, etil asetat dan n-butanol. Bejana kromatografi sebelum digunakan untuk elusi, terlebih dahulu dijenuhkan dengan fase geraknya. Sedikit fraksi positif flavonoid yaitu fraksi n-heksana dilarutkan dengan pelarutnya (eluen yang akan dipakai) kemudian ditotolkan pada plat kromatografi lapis tipis dengan menggunakan pipa kapiler. Setelah kering lalu dimasukkan dalam bejana. Bila fase gerak telah mencapai batas yang ditentukan, plat diangkat, dan dikeringkan di udara terbuka. Sebagai penampak noda digunakan asam sulfat. Noda yang terbentuk diamati dengan lampu UV 254 nm dan 366 nm kemudian dihitung Rf-nya. 3.7 Harga Rf (Retension Factor) Mengidentifikasi noda-noda dalam lapisan tipis lazim menggunakan harga Rf yang diidentifikasikan sebagai perbandingan antara jarak perambatan suatu zat dengan jarak perambatan pelarut yang dihitung dari titik penotolan pelarut zat. Jarak yang ditempuh oleh tiap bercak dari titik penotolan diukur dari pusat bercak. Untuk mengidentifikasi suatu senyawa, maka harga Rf senyawa tersebut dapat dibandingkan dengan harga Rf senyawa pembanding. (Sastrohamidjojo, 1991). 3.8 Uji Fitokimia Uji Fitokimia Pemeriksaan golongan flavonoid dapat dilakukan dengan uji warna yaitu : 1. Test Wilstatter penotolantitikdaripelarutperambatanJarak penotolantitikdaribercakperambatanJarak =Rf
  15. 15. Beberapa mililiter sampel dalam alkohol ditambahkan 2-4 tetes larutan HCl dan 2-3 potong kecil logam Mg. Perubahan warna yang terjadi diamati dari kuning tua menjadi orange. 2. Test dengan NaOH 10% Beberapa mililiter sampel dalam alkohol ditambahkan 2-4 tetes larutan NaOH 10%. Perubahan warna yang terjadi diamati dari kuning tua menjadi kuning muda. 3. Test dengan H2SO4 (pekat) Beberapa mililiter sampel dalam alkohol ditambahkan 2-4 tetes larutan H2SO4 (pekat). Perubahan warna yang terjadi diamati dari kuning tua menjadi merah tua.
  16. 16. IV. KERANGKA KONSEP Kacang Kedelai Kandungan : Kand.tertinggi : Isoflavon (Genistein & daizdein) Kand.Lain : Fitosterol,asam fitat, assam lemak, dll. ISOFLAVON Aktivitas : Sebagai antikanker dan antioksidan Golongan Flavonoid > 35% Genistein dan daizdein dlm bentuk glikosida Sifat polar, larut air TEKNIK PEMISAHAN Maserasi Bertingkat Maserasi Tahap 1 MeOH:H2O (9:1) Maserasi Tahap 2 MeOH:H2O (1:1) Rotary Vacuum Evaporator Ekstrak Kental ISOLASI ISOFLAVON Isolat + etil asetat Rotary Vacuum Evaporator + etilasetat (corong pisah) + n-hexane + HCl (p) (dihidrolisis) (dlm Corong pisah) IDENTIFIKASI ISOFLAVON UJI KLT 1. Eluen Etil asetat : asam format: as.asetat glasial : air (100:11:11: 27) 2. Pereaksi Penampak : Difenil boriloksinetilamina LP 3. Bercak sinar 365 nm : Berpendar kuning intensif, hijau dan jingga SKRINING FITOKIMIA 1. Test Wilstatter : ekstrak + alkohol + HCl + pita Mg ( kuning tua → orange) 2. Test dengan NaOH 10% : ekstrak + alkohol +NaOH 10%. (kuning tua → kuning muda. 3. Test dengan H2SO4 (pekat) ekstrak + alkohol + H2SO4 (pekat). (kuning tua → merah tua)
  17. 17. Ekstraksi dan Isolasi Kacang kedelai banyak mengandung flavonoid khususnya golongan isoflavon dibandingkan kacang-kacangan yang lain. Secara alami, isoflavon pada kedelai hampir seluruhnya terdapat dalam bentuk β-glikosida (glikon) misalnya genestein dan daidzein. Untuk mengekstrak flavonoid dari kedelai, dilakukan dengan metode maserasi dua tahap dengan menggunakan pelarut metanol. Metanol dipilih sebagai pelarut karena metanol bersifat polar, begitu juga dengan flavonoid. Metanol yang digunakan pada maserasi tahap pertama digunakan perbandingan Me(OH):H2O (9:1). Perbandingan metanol yang 9 kali lebih besar dari air bertujuan untuk memaksimalkan proses ekstraksi dan penarikan flavonoid dari serbuk kedelai. Selanjutnya, ekstrak yang didapatkan disaring kemudian residu dimaserasi kembali dengan pelarut yang sama tetapi perbandingan diturunkan menjadi 1:1. Perbandingan metanol diturunkan karena kemungkinan masih ada sebagian kecil flavonoid yang belum terekstrak pada maserasi tahap pertama. Kedua ekstrak hasil maserasi tahap pertama dan kedua, diuapkan menggunakan rotary vacuum evaporator. Hal ini bertujuan untuk menguapkan etanol yang melarutkan flavonoid pada proses maserasi. Selanjutnya ekstrak kental dipartisi dengan n-hexane untuk menghilangkan zat- zat lemak yang ada dalam ekstrak. Ekstraksi partisi menggunakan n-hexane dilakukan dengan menggunakan corong pisah dan dilakukan berulang-ulang. Ekstrak yang diperoleh kemudian disatukan dan disatukan. Tahap selanjutnya adalah isolasi senyawa isoflavon dari ekstrak flavonoid yang didapatkan sebelumnya. Isolasi senyawa golongan isoflavon dilakukan dengan cara menghidrolisis ekstrak dengan HCl. Proses hidrolisis (penambahan HCl) pada ekstrak bertujuan untuk memecah ekstrak menjadi glikosida dan aglikon-aglikon seperti isoflavon yang merupakan bentuk dari β-glikosida (glikon). Tahap terakhir adalah dipartisi dengan etil asetat yang bertujuan untuk memisahkan aglikon flavonoid dari fraksi gula-gulanya. Isolat yang didapatkan digunakan sebagai sampel untuk uji golongan dan KLT. Skrining Fitokimia Uji Tabung 1. Test Wilstatter Pada uji ini, penambahan aljohol dan HCl bertujuan untuk menghidrolisis flavonoid dengan cara
  18. 18. memutuskan rantai aglikon yang ada, sedangkan penambahan logam Mg bertujuan untuk menunjukkan perubahan warna yang terjadi. Berikut reaksi senyawa flavonoid dengan logam. 2. Test dengan NaOH 10% Beberapa mililiter sampel dalam alkohol ditambahkan 2-4 tetes larutan NaOH 10%. Perubahan warna yang terjadi diamati dari kuning tua menjadi kuning muda. 3. Test dengan H2SO4 (pekat) Beberapa mililiter sampel dalam alkohol ditambahkan 2-4 tetes larutan H2SO4 (pekat). Perubahan warna yang terjadi diamati dari kuning tua menjadi merah tua. Uji KLT Pada uji KLT, digunakan eluen Etil asetat : asam format: as.asetat glasial : air dengan perbandingan 100:11:11: 27. Dipilih eluen ini karena bahan-bahan yang ada dalam eluen tersebut memiliki tingkat kepolaran yang berbeda.
  19. 19. V. METODE KERJA 4.1 Alat dan Bahan Alat : Bahan : 1. Blender, 2. Neraca Analitik, 3. Lampu UV, 4. Seperangkat Alat Penampak Bercak 5. Kertas Saring, 6. Seperangkat Alat Gelas, 7. Penguap Putar Vakum (rotary vacuum evaporator), 1. Biji kedelai segar(Glycine max) 2. Metanol (teknis dan p.a) 3. Asam Klorida pekat 4. n- heksana (p.a) 5. Natrium Hidroksida 6. Plat KLT Silika Gel GF254 7. Etil Asetat (p.a) 8. Aquades 8. Asam Sulfat pekat 9. Etanol 70% 10. NH4OH 11. H2SO4 2 M 12. Pita Mg 13. etil asetat, 14. n-butanol, 15. asam asetat, Cara Kerja 1. Penyiapan Bahan a. Ditimbang 1 kg biji kedelai segar b. Biji kedelai segar dicuci bersih c. Biji Kedelai dikeringanginkan d. Dihaluskan biji kedelai kering menggunakan penggiling sampai menjadi serbuk 2. Ekstraksi Senyawa Flavonoid a. Ditimbang serbuk kedelai 500 g b. Dimasukkan kedalam bekerglass c. Ditambahkan etanol 70% sebanyak 1L d. Dilakukan maserasi selama 3x24 jam pada suhu kamar disertai pengadukan berkala
  20. 20. e. Ekstrak-etanol disaring menggunakan corong buchner f. Filtrat disimpan, residu dimaserasi kembali menggunakan etanol 70% sebanyak 1L g. Hasil maserasi yang kedua disaring menggunakan corong buchner h. Filtrat maserasi kedua dikumpulkan menjadi satu dengan filtrat pertama i. Filtrat diuapkan dengan Rotary Vacuum Evaporator sampai diperoleh ekstrak kental 3. Isolasi Senyawa Flavonoid golongan Isoflavon a. Ekstrak kental dimasukkan kedalam tabung reaksi b. Ditambahkan HCl pekat c. Dipanaskan selama 2 - 3 jam d. Ditambahkan n-hexane 10% dari vlume ekstrak e. Ditambahkan n-hexane sebanyak 10% dari volume ekstrak kental + HCl pekat, selanjutnya dipindahkan dengan corong pisah f. Ditambahkan etil asetat, dikocok dan didiamkan beberapa saat sampai terlihat terpisah sempurna g. Isolat kemudian diuapkan dengan rotary vacuum evaporator. Isolat yang diperoleh digunakan untuk uji fitokimia dan uji KLT 4. Uji Fitokimia Senyawa Flavonoid  Test Wilstatter 1. 1 mL sampel dalam tabung reaksi 2. Ditambah alkohol beberapa tetes 3. Ditambahkan 2-4 tetes larutan HCl 4. Ditambahkan 2-3 potong pita logam Mg. 5. Diamati perubahan warna yang terjadi  Test dengan NaOH 10% 1. 1 mL sampel dalam tabung reaksi 2. Ditambahkan beberapa mL alkohol 3. Ditambahkan 2-4 tetes larutan NaOH 10%. 4. Diamati perubahan warna yang terjadi  Test dengan H2SO4 (pekat)
  21. 21. 1. 1mL sampel dalam tabung reaksi 2. Ditambahkan beberapa mL alkohol 3. Ditambahkan 2-4 tetes larutan H2SO4 (pekat). 4. Diamati perubahan warna yang terjadi 5. Uji KLT a. Pembuatan Eluen dan Penjenuhan Chamber 1. Dimasukkan aquadest pada chamber untuk mengetahui perkiraan batas eluen, lalu beri tanda (kalibrasi) 2. Chamber dikeringkan 4. Dibuat eluen etil asetat : asam format : asam asetat glasial : air dengan perbandingan ( 100:11:11:27) sebanyak volume aquades yang digunakan kalibrasi 5. Dimasukkan kedalam chamber 6. Diletakkan kertas saring hingga menyentuh dasar eluen 7. Chamber ditutup dengan gelas arloji 8. Chamber dibiarkan sampai jenuh, ditandai dengan bagian luar kertas saring basah oleh eluen b. Penyiapan Plat 1. Diambil plat Silica GF254 lalu dipotong 15cm x 5 cm 2. Ditentukan jarak batas bawah dan batas atas 3. Plat dioven pada suhu 110 C ± selama 15 menit
  22. 22. c. Pereaksi Penampak (difenilboriloksinetilamina LP) 1. Pereaksi penampak digunakan larutan difenilboriloksinetilamina LP 2. Dimasukkan kedalam botol penyemprot d. Penotolan sampel 1. Dinyalakan spiritus 2. Diletakkan pipa kapiler diatas api bunsen sambil diputar-putar 3. Diangkat pipa kapiler dari atas api dan ditarik kedua ujung pipa kapiler 4. Dipatahkan bagian tengah pipa kapiler menjadi dua bagian 5. Diambil sampel menggunakan ujung pipa kapiler yang sidah dipatahkan 6. Ditotolkan pada titik penotolan ( dibuat lebih dari satu titik dengan jarak tertentu) 7. Diulangi penotolan pada titik yang sama berulang-ulang, selanjutnya dikeringanginkan 8. Dimasukkan plat kedalam chamber yang berisi eluen 9. Chamber ditutup dengan gelas arloji 10. Dibiarkan sampai eluen berada pada batas atas yang telah dibuat 15 cm 5 cm 1,5cm1,5cm Batas Eluen Titik penotolan Batas atas eluen
  23. 23. e. Pengamatan Bercak Noda 1. Diambil plat dari chamber 2. Diamati adanya bercak noda pada sinar biasa (ditandai menggunakan pensil) 3. Diamati adanya bercak noda pada Sinar UV 365 nm (ditandai menggunakan pensil) 4. Dihitung nilai Rf dengan rumus:
  24. 24. DAFTAR PUSTAKA ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA ISOFLAVON DARI KACANG KEDELAI (Glycine max) , I. A. R. Astiti Asih , Juirusan Kimia FMIPA Universitas Udayana, ITB. Terjemahan dari: Phytochemical Methode . ISOFLAVON KEDELAI DAN POTENSINYA SEBAGAI PENANGKAP RADIKAL BEBAS [Soybean Isoflavone and Its Potentially as Scavenger Free Radicals] ,.Sussi Astuti 1) 1) Staf Pengajar Jurusan Teknologi Industri Pertanian Fakultas Pertanian Universitas Lampung Jl. Prof. Soemantri Brojonegoro No. 1 Bandar Lampung, Markham KR. 1988. Cara Mengidentifikasi Flavonoid . Padmawinata K, penerjemah. Bandung: Penerbit ITB. Terjemahan dari: Techniques of Flavonoid Identification Harborne JB.1987. Metode Fitokimia . Padmawinata K, Soediro I, penerjemah; Niksolihin S, editor. Bandung

×