Cromatografía de líquidos

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Cromatografía de líquidos

  1. 1. CROMATOGRAFÍA DECROMATOGRAFÍA DELÍQUIDOSLÍQUIDOSen columnaen columna
  2. 2. Cromatografía de líquidos en columnaCromatografía de líquidos en columnasegún los mecanismos de partición y/osegún los mecanismos de partición y/oabsorción, por baja o alta performance.absorción, por baja o alta performance.Aparatos:Aparatos: materialesmateriales: vidrio, cuarzo, plástico, celofán o metálicas.: vidrio, cuarzo, plástico, celofán o metálicas. formas;formas; cuadradas, circulares, cilíndricas y elípticas, la más apropiada es la decuadradas, circulares, cilíndricas y elípticas, la más apropiada es la desección circular.sección circular. dimensiones :dimensiones : El tamaño depende de la cantidad de soporte que se use, peroEl tamaño depende de la cantidad de soporte que se use, perodebe ser la relación longitud/ diámetro bastante mayor que uno.debe ser la relación longitud/ diámetro bastante mayor que uno.Le Rosen comprobó que la velocidad del flujo del solvente a través de la columna esLe Rosen comprobó que la velocidad del flujo del solvente a través de la columna esindependiente del diámetroindependiente del diámetro funcionamientofuncionamiento ::AscendenteAscendenteVertical: con flujoVertical: con flujo DescendenteDescendenteEn formaEn forma HorizontalHorizontalInclinadaInclinadaLa aceleración de la gravedadLa aceleración de la gravedadPor acción de Presión aplicada en la parte de entradaPor acción de Presión aplicada en la parte de entradaSucción a la salidaSucción a la salida
  3. 3. Es importante la forma de rellenado:Es importante la forma de rellenado:Empaque HúmedoEmpaque HúmedoSecoSecoEl método “húmedo” asegura el equilibrio entre las fases estacionaria y móvil.El método “húmedo” asegura el equilibrio entre las fases estacionaria y móvil.Se introduce como una papilla con el eluyente.Se introduce como una papilla con el eluyente.Previamente se elimina el aire y se agrega un poco de disolvente puro.Previamente se elimina el aire y se agrega un poco de disolvente puro.Se elimina el exceso de disolvente.Se elimina el exceso de disolvente.El método en “seco” colocar un elemento de sustentación del relleno (por ejemplo lana, vidrio);El método en “seco” colocar un elemento de sustentación del relleno (por ejemplo lana, vidrio);Tomar el tubo con una manoTomar el tubo con una manoIntroducir una pequeña cantidad de materialIntroducir una pequeña cantidad de materialEmpujar el material hasta el otro extremoEmpujar el material hasta el otro extremoProseguir el rellenado con pequeños incrementosProseguir el rellenado con pequeños incrementosCuidar que la presión ejercida sea solo la necesaria para dar firmezaCuidar que la presión ejercida sea solo la necesaria para dar firmezaEstabilizar el relleno con una cobertura con un disco de papel de filtro o deEstabilizar el relleno con una cobertura con un disco de papel de filtro o delana de vidrio.lana de vidrio.““anillos de presión”. Este efecto se a que cuando se introduce una gran cantidad de material de unaanillos de presión”. Este efecto se a que cuando se introduce una gran cantidad de material de unavez, la presión que se aplica en la parte superior no se transmite en forma efectiva a la porciónvez, la presión que se aplica en la parte superior no se transmite en forma efectiva a la porcióninferior.inferior.
  4. 4. Cromatografía de líquidos en columnaCromatografía de líquidos en columnasegún los mecanismos de partición y/osegún los mecanismos de partición y/oabsorción, por baja o alta performance.absorción, por baja o alta performance.Fase estacionariaFase estacionaria ::Depende del mecanismo de separación:Depende del mecanismo de separación:ParticiónPartición. se inmoviliza el líquido en un soporte inerte.. se inmoviliza el líquido en un soporte inerte.Las fases caracterizan según dos clases: hidrofílicas y faseLas fases caracterizan según dos clases: hidrofílicas y fasereversa.reversa.ElEl soportesoporte preferentemente debe serpreferentemente debe ser inerteinerte y se utilizan ácidoy se utilizan ácidosilícico, tierras diatomeas, celulosa en polvo, vidrio en polvo y gomasilícico, tierras diatomeas, celulosa en polvo, vidrio en polvo y gomade celulosa.de celulosa.Como fase fija se usan líquidos de diversos tipos cuyas polaridadesComo fase fija se usan líquidos de diversos tipos cuyas polaridadesvarían desde la correspondiente al agua (muy elevada) hastavarían desde la correspondiente al agua (muy elevada) hastahidrocarburos parafínicos ( muy bajas)hidrocarburos parafínicos ( muy bajas)Adsorción,Adsorción,elel relleno debe ser activorelleno debe ser activo y en general cualquier sólido porosoy en general cualquier sólido porosoque no sea muy soluble en la fase móvil es apropiado. (alúminasque no sea muy soluble en la fase móvil es apropiado. (alúminaspreparadas por deshidratación del hidróxido, por hidrólisis opreparadas por deshidratación del hidróxido, por hidrólisis oneutralización de sales). Las ventajas de este material son: granneutralización de sales). Las ventajas de este material son: grancapacidad, blanca, insoluble y químicamente inerte, barata,capacidad, blanca, insoluble y químicamente inerte, barata,fácilmente obtenible y muy versátil.fácilmente obtenible y muy versátil.
  5. 5. Los rellenos a usar, previamenteLos rellenos a usar, previamentedeben ser sometidos a diversosdeben ser sometidos a diversostratamientos:tratamientos:Activados,Activados,Desactivados yDesactivados yEstandarizadosEstandarizados
  6. 6. Rellenos de columnasRellenos de columnasActivación:Activación:A - Por remoción de sustancias que bloquean los lugares activos de laA - Por remoción de sustancias que bloquean los lugares activos de lasuperficie.superficie.A-1) activación por calentamiento;A-1) activación por calentamiento; tienen por fin el de eliminar el agua presentetienen por fin el de eliminar el agua presenteen forma parcial. Se debe evitar el sobrecalentamiento ya que éste puedeen forma parcial. Se debe evitar el sobrecalentamiento ya que éste puedetener un efecto contraproducente.tener un efecto contraproducente.A-2) por lavado con solventes inertesA-2) por lavado con solventes inertes se realiza por lavado con solventese realiza por lavado con solventecaliente en la misma columna cromatográfica o por proceso “batch”.caliente en la misma columna cromatográfica o por proceso “batch”.A-3) por uso de reactivos químicosA-3) por uso de reactivos químicos se produce el lavado con ácidos, bases use produce el lavado con ácidos, bases uoxidantes, lográndose la remoción de las sustancias que bloquean los lugaresoxidantes, lográndose la remoción de las sustancias que bloquean los lugaresactivos del material. Esta operación debe llevarse a cabo cuidadosamenteactivos del material. Esta operación debe llevarse a cabo cuidadosamenteante el riesgo de provocar cambios indeseables en el comportamiento delante el riesgo de provocar cambios indeseables en el comportamiento deladsorbente.adsorbente.B - Por mejora del área superficial, la porosidad o grupos funcionales.B - Por mejora del área superficial, la porosidad o grupos funcionales.se logra por calentamiento.se logra por calentamiento.
  7. 7. Desactivación:Desactivación:Se usaSe usapara lograr isotermas menos curvadaspara lograr isotermas menos curvadaspara eliminar alguna propiedad no deseadapara eliminar alguna propiedad no deseadadel rellenodel rellenolograr la inercia total del material cuando selograr la inercia total del material cuando serequiere que el mecanismo sea de partición.requiere que el mecanismo sea de partición.Rellenos de columnasRellenos de columnas
  8. 8. EstandarizaciónEstandarizaciónPara lograr reproducibilidad en las medidas que conducen a laPara lograr reproducibilidad en las medidas que conducen a laidentificación y evaluación cuantitativa de los componentes de unaidentificación y evaluación cuantitativa de los componentes de unamuestra, el adsorbente a usar será estandarizado.muestra, el adsorbente a usar será estandarizado.Se realiza evaluando suSe realiza evaluando su capacidadcapacidad frente a un grupo de sustanciasfrente a un grupo de sustanciaso bien en base a lao bien en base a la selectividadselectividad de pares de sustanciasde pares de sustanciasLa capacidad de un adsorbente se puede medirLa capacidad de un adsorbente se puede medirmediante adsorción en batch: una cantidad pesada de adsorbente semediante adsorción en batch: una cantidad pesada de adsorbente secoloca como lecho y la solución test pasa al mismo. La cantidadcoloca como lecho y la solución test pasa al mismo. La cantidadadsorbida se evalúa mediante el cambio en la concentración de laadsorbida se evalúa mediante el cambio en la concentración de lasolución.solución.Brokmann: la alúmina se activa (deshidrata) por calentamiento yBrokmann: la alúmina se activa (deshidrata) por calentamiento yposteriormente es desactivada con grados controlados de exposiciónposteriormente es desactivada con grados controlados de exposiciónen aire.en aire.mediante el pasaje de una solución de rojo sudan en éter de petróleomediante el pasaje de una solución de rojo sudan en éter de petróleoen una columna: el ancho de banda está en relación inversa al grado deen una columna: el ancho de banda está en relación inversa al grado deactividad de la alúmina.actividad de la alúmina.Rellenos de columnasRellenos de columnas
  9. 9. para un adsorbente dado, cinco grados de actividad según el contenido de agua adsorbida:para un adsorbente dado, cinco grados de actividad según el contenido de agua adsorbida:I. . . . . . 0% de H2OI. . . . . . 0% de H2OII. . . . . 3% “ “II. . . . . 3% “ “III. . . . 6% “ “III. . . . 6% “ “IV. . . . 10% “ “IV. . . . 10% “ “V. . . . . 15% “ “V. . . . . 15% “ “Esta escala fue sugerida por Brokmann mediante la desactivación progresiva de la alúmina alEsta escala fue sugerida por Brokmann mediante la desactivación progresiva de la alúmina alagregar agua: para una actividad deseada se coloca una cantidad conocida de alúmina activadaagregar agua: para una actividad deseada se coloca una cantidad conocida de alúmina activadaa grado I en un frasco con una cantidad apropiada de agua, se cierra el frasco y se agita laa grado I en un frasco con una cantidad apropiada de agua, se cierra el frasco y se agita lamezcla por muchas horas. La actividad según el método se mide por la habilidad de separarmezcla por muchas horas. La actividad según el método se mide por la habilidad de separarmezclas de seis colorantes:mezclas de seis colorantes:Metoxiazobenceno (A)Metoxiazobenceno (A) Amarillo Sudán (B)Amarillo Sudán (B)Rojo Sudán (C)Rojo Sudán (C) Aminoazobenceno (D)Aminoazobenceno (D)Hidroxiazobenceno (E)Hidroxiazobenceno (E) Azobenceno (F)Azobenceno (F)Definió la actividad de la alúmina de tal forma que en condiciones estándar los dos másDefinió la actividad de la alúmina de tal forma que en condiciones estándar los dos másdébilmente adsorbidos sean recogidos y separados por la alúmina más activa (Gº I) mientrasdébilmente adsorbidos sean recogidos y separados por la alúmina más activa (Gº I) mientrasque los más fuertemente adsorbidos se separaban por la última de menor actividadque los más fuertemente adsorbidos se separaban por la última de menor actividad
  10. 10. Tamaño de las partículas de Relleno:Tamaño de las partículas de Relleno:influencia en la calidad de las separacionesinfluencia en la calidad de las separaciones..adsorbentes de gran granulometría dan cromatogramas borrososadsorbentes de gran granulometría dan cromatogramas borrososmientras que los adsorbentes pulverulentos dan mejores resultados. Sinmientras que los adsorbentes pulverulentos dan mejores resultados. Sinembargo es difícil establecer una prescripción absoluta acerca de cualembargo es difícil establecer una prescripción absoluta acerca de cuales el mejor tamaño de partícula.es el mejor tamaño de partícula.Existe una interrelación entre el “diámetro” de partícula y el diámetro deExiste una interrelación entre el “diámetro” de partícula y el diámetro dela columna. Además se incluye como factor, la facilidad dela columna. Además se incluye como factor, la facilidad demanipulación y relleno, en general es más fácil empacar columnasmanipulación y relleno, en general es más fácil empacar columnashomogéneamente con partículas de regular tamaño que con pequeñas.homogéneamente con partículas de regular tamaño que con pequeñas.Velocidad de adsorción:Velocidad de adsorción:Al comienzo se produce una adsorción rápida (al menos de veinteAl comienzo se produce una adsorción rápida (al menos de veintesegundos se adsorben las 2/3 partes),segundos se adsorben las 2/3 partes),Disminuye luego la velocidad de adsorción requiriéndose unosDisminuye luego la velocidad de adsorción requiriéndose unoscuantos minutos (20 aproximadamente) para completarse elcuantos minutos (20 aproximadamente) para completarse elproceso.proceso.La velocidad de desorcion es del mismo orden que la de adsorción.La velocidad de desorcion es del mismo orden que la de adsorción.
  11. 11. Velocidad de flujo de la fase móvil :Velocidad de flujo de la fase móvil :Al contrario a lo que ocurre en cromatografía de gasesAl contrario a lo que ocurre en cromatografía de gases a mayor velocidada mayor velocidadde flujo mayor “altura de platode flujo mayor “altura de plato”.”.Cuando la velocidad de flujo decrece por un periodo y luego retorna a suCuando la velocidad de flujo decrece por un periodo y luego retorna a suvalor original (por cambio de la presión) se observa la ruptura en la curva devalor original (por cambio de la presión) se observa la ruptura en la curva deconcentración del efluente, es decir que resulta perjudicial interrumpir unaconcentración del efluente, es decir que resulta perjudicial interrumpir unaexperiencia y continuarla después.experiencia y continuarla después.Uniformidad de la empaquetadura:Uniformidad de la empaquetadura:Las irregularidades a través de la columna son normalmente grandesLas irregularidades a través de la columna son normalmente grandescomparadas con la difusión o la falta de agudeza de la banda. Se introducecomparadas con la difusión o la falta de agudeza de la banda. Se introduceel % de distorsión (longitud del frente/ distancia media que se ha movido elel % de distorsión (longitud del frente/ distancia media que se ha movido elfrente) o bien:frente) o bien:D% = (D% = (ΔΔL/ LL/ Lii) *100 D% = () *100 D% = (ΔΔV/ Vret)*100V/ Vret)*100Los mejores resultados fueron en el caso en el que tal porcentaje fue deLos mejores resultados fueron en el caso en el que tal porcentaje fue deaproximadamente cinco.aproximadamente cinco.
  12. 12. Cromatografía de líquidos en columnaCromatografía de líquidos en columnasegún los mecanismos de partición y/osegún los mecanismos de partición y/oabsorción, por baja o alta performanceabsorción, por baja o alta performanceFase móvil:Fase móvil:Solventes:Solventes: son en general más o menosson en general más o menosinertes hacia el adsorbente o los adsortivos.inertes hacia el adsorbente o los adsortivos.Se usan como portadores de la mezcla que seSe usan como portadores de la mezcla que sedebe separar.debe separar.Eluyente:Eluyente: remueve los adsortivos de losremueve los adsortivos de losadsorbentes.adsorbentes.Desplazantes:Desplazantes: aquellos eluyentes con fuerzaaquellos eluyentes con fuerzaeluctante altaeluctante altaDesarrollantes:Desarrollantes: eluyentes con fuerza eluctanteeluyentes con fuerza eluctantebaja.baja.
  13. 13. Se pueden evaluar los solventesSe pueden evaluar los solventespor su poder de elucionpor su poder de elucionSerie eluotrópicaSerie eluotrópica1 N pentano 10 Cloroformo2 Éter de petróleo 11 Dietileter3 N- hexano 12 Acetato de etilo4 N- heptano 13 Piridina5 Ciclohexano 14 Acetona6 Tetracloruro de carbono 15 n-propanol7 Tricloroetileno 16 etanol8 Benceno 17 metanol9 Dicloroetano 18 aguaAumentodelpodereluotrópicoAumentodelpodereluotrópico
  14. 14. Formas de elección de las fasesFormas de elección de las fasesHidrofílica polarLipofílica no polarFase móvilMuestraFaseestacionariaHidrofílica polarLipofílica no polarHidrofílica polarLipofílica no polar
  15. 15. Desarrollo cromatográficosDesarrollo cromatográficosAnteriormente, se describieron los desarrollos frontal, por desplazamiento y porAnteriormente, se describieron los desarrollos frontal, por desplazamiento y porelución.elución.Elución Fraccionada:Elución Fraccionada:Se utilizan distintos disolventes, siendo cada uno más enérgico que el anterior. EsteSe utilizan distintos disolventes, siendo cada uno más enérgico que el anterior. Esteprocedimiento permite abreviar la elución de las sustancias fuertemente adsorbidas.procedimiento permite abreviar la elución de las sustancias fuertemente adsorbidas.Elución gradual:Elución gradual:Si las isotermas no son lineales, se presentan cromatogramas distorsionados: frenteSi las isotermas no son lineales, se presentan cromatogramas distorsionados: frentedifuso o colas. En el ultimo caso, se logra disminuir la magnitud de las colasdifuso o colas. En el ultimo caso, se logra disminuir la magnitud de las colasmezclando con el eluyente que se usa en la columna, otro más enérgico amezclando con el eluyente que se usa en la columna, otro más enérgico aconcentración gradualmente mayor. Así se establece un gradiente de concentraciónconcentración gradualmente mayor. Así se establece un gradiente de concentracióna lo largo de la columna que hace que la parte posterior de cualquier banda o zonaa lo largo de la columna que hace que la parte posterior de cualquier banda o zonacromatográfica se encuentre siempre en contacto con una solución eluyente máscromatográfica se encuentre siempre en contacto con una solución eluyente másenérgica que la parte frontalenérgica que la parte frontal
  16. 16. Cromatografía liquida de altaCromatografía liquida de altavelocidad (CLAP o HPLC)velocidad (CLAP o HPLC)La dificultad principal que presenta la cromatografía liquidaLa dificultad principal que presenta la cromatografía liquidatradicional es la lentitud.tradicional es la lentitud.La cromatografía de gases, presenta el inconveniente de lasLa cromatografía de gases, presenta el inconveniente de laselevadas temperaturas de trabajo que pueden destruir la muestra, yelevadas temperaturas de trabajo que pueden destruir la muestra, ylimita la posibilidad de elección de las fases fija y móvil.limita la posibilidad de elección de las fases fija y móvil.Es así que surge la cromatografía liquida de alta velocidadEs así que surge la cromatografía liquida de alta velocidad(performance) que compite muy ventajosamente en muchos casos(performance) que compite muy ventajosamente en muchos casoscon la cromatografía de gases. Para efectuar las separaciones concon la cromatografía de gases. Para efectuar las separaciones conrapidez, el eluyente se hace pasar a través de la columna arapidez, el eluyente se hace pasar a través de la columna avelocidades lineales de flujo que puedenvelocidades lineales de flujo que puedenser hasta 100 veces la de la cromatografíaser hasta 100 veces la de la cromatografíatradicional.tradicional.Es de hacer notar que la eficienciaEs de hacer notar que la eficiencia(expresada en “ATPE”) es mayor(expresada en “ATPE”) es mayorcuanto menor sea la velocidadcuanto menor sea la velocidad
  17. 17. Cromatografía liquida de altaCromatografía liquida de altavelocidad (CLAP o HPLC)velocidad (CLAP o HPLC)Características: SelectividadReproducibilidadSensibilidadRapidezParámetros:Naturaleza de la fase estacionariaTamaño de partículaEluyente (composición y flujo)DetectorFase Directa:fase estacionaria polarfase móvil de baja polaridadFase Reversa:fase estacionaria de polaridad bajafase móvil de polaridad alta
  18. 18. Los componentes de unLos componentes de uncromatógrafo de líquidos de altacromatógrafo de líquidos de altavelocidadvelocidaddepositoBombaInyectorColumnaDetectorRegistradorColector defraccionesMedidor deflujo
  19. 19. cromatógrafo de líquidoscromatógrafo de líquidosde alta velocidadde alta velocidad
  20. 20. Principales mecanismos de interacciónencromatografía líquida de alta perfomanceAdsorción superficialParticiónIntercambio iónicoExclusión molecular
  21. 21. AdsorciónAdsorciónLa fase estacionaria es sólida.La separación se logra por lasdiferencias en solubilidad (en fasemóvil) y de retención por adsorción (enfase estacionaria) de la mezcla desolutos.
  22. 22. las fases estacionarias más comunes son Sílica (90%) yalúmina (10%) .Tanto las moléculas de solutos como de disolvente sonatraídas hacia los lugares activos polares de la fase estacionaria.Unos solutos serán más atraídos que otros por la faseestacionaria y así se logrará su migración diferencial.Se usan mezclas de disolventes para conseguir el poderde elución y la selectividad adecuadas. Normalmente undisolvente apolar (n-hexano) unido a otro más activo(acetona, cloruro de metilo, etc.).
  23. 23. CROMATOGRAFÍA DEPARTICIÓNLa separación se basa en el reparto odistribución de los solutos entre unafase móvil líquida y otra estacionariainmiscible, soportada sobre un sólidoinerte. La discriminación se produce pordiferencias de solubilidad.
  24. 24. El mecanismo de actuación es similar al deun modelo de extracción en contracorriente.Las especies más retenidas serán las quepresenten mayor afinidad (solubilidad) por lafase estacionaria que por la fase móvil(eluyente).La separación de los solutos se basa en lasdiferencias en esta solubilidad relativa.
  25. 25. Existen dos modos básicos de operación:Fase normal. Cuando se trabaja con fase estacionaria polary fase móvil no polar.Fase reversa. Cuando se emplea una fase estacionaria nopolar y fase móvil polar.Inicialmente tuvo más auge la fase normal pero en laactualidad son más comunes los métodos cromatográficosen fase reversa dada la naturaleza hidrofílica de las muestras demayor interés (clínico, contaminación, alimentos).Según empleemos fase directa o fase reversa se va a alterar elorden de elución de bandas y el tiempo de análisis
  26. 26. Cromatografía de intercambioCromatografía de intercambioiónicoiónicoTanto fase estacionaria como fasemóvil son de naturaleza iónica.Los iones de la fase estacionaria sonde carga opuesta a los del eluyente.R–— A+ + B+ 􀀧 R–— B+ + A+R+— A– + B– 􀀧 R+— B– + A–
  27. 27. Separación de aniones inorgánicos porcromatografía de intercambio iónico.Los iones a separar son los contaminantes en aguas1-Fluoruro2-Cloruro3-Nitrito4-Bromuro5-Nitrato6-Fosfato7-SulfatoDetector UV Detector de conductividad
  28. 28. Bombas:Bombas:La bomba que fuerza el líquido a pasar por la columna a una velocidad satisfactoria,La bomba que fuerza el líquido a pasar por la columna a una velocidad satisfactoria,es impulsada por un motor.es impulsada por un motor.Los detectores usados por lo general son sensibles al flujo, la bomba debe liberar elLos detectores usados por lo general son sensibles al flujo, la bomba debe liberar ellíquido a una velocidad constante, sin pulsaciones. Una forma consiste en introducirlíquido a una velocidad constante, sin pulsaciones. Una forma consiste en introducirdos cilindros y pistones programados de tal modo que uno se llene rápidamentedos cilindros y pistones programados de tal modo que uno se llene rápidamentemientras el otro se vacía en forma lenta; después, este último lleva a cabo la funciónmientras el otro se vacía en forma lenta; después, este último lleva a cabo la funciónde llenado mientras su compañero se vacía, y así cíclicamente.de llenado mientras su compañero se vacía, y así cíclicamente.Debe producir presiones estables hasta 6000 psi.Debe producir presiones estables hasta 6000 psi.Mantener el flujo libre de pulsacionesMantener el flujo libre de pulsacionesGenerar intervalos de caudales de flujo (0,1 a 10 ml/min)Generar intervalos de caudales de flujo (0,1 a 10 ml/min)Control y reproducibilidad del flujo de solventeControl y reproducibilidad del flujo de solventeComponentes de la bomba resistentes a la corrosiónComponentes de la bomba resistentes a la corrosiónLas bombas que se usan en HPLC se pueden clasificar según su funcionamiento yLas bombas que se usan en HPLC se pueden clasificar según su funcionamiento ydiseño en:diseño en:MecánicasMecánicasRecíprocantesRecíprocantesDe desplazamiento contínuoDe desplazamiento contínuoNeumáticasNeumáticas
  29. 29. ColumnasColumnasdiámetro interno de 1 a 6 mmdiámetro interno de 1 a 6 mmlongitud de 30 a 100 cm cortas sonlongitud de 30 a 100 cm cortas sonrectas y las mas largas enrolladasrectas y las mas largas enrolladas(long 600 cm).(long 600 cm).son de acero inoxidable o deson de acero inoxidable o devidrio.vidrio.operan a temperatura ambiente.operan a temperatura ambiente.La velocidad de difusión puedeLa velocidad de difusión puedeaumentar de un poco alaumentar de un poco alincrementar la temperatura, por loincrementar la temperatura, por loque se suele usar una camisa deque se suele usar una camisa decalentamiento, en “CLAP” elcalentamiento, en “CLAP” elcontrol de la temperatura no es tancontrol de la temperatura no es tansignificativo como en CGsignificativo como en CG
  30. 30. Gradiente de elución:Gradiente de elución:El equivalente de la programación de temperaturas usada en CG es gradiente deEl equivalente de la programación de temperaturas usada en CG es gradiente deelución o programación del disolvente.elución o programación del disolvente.Produce un cambio en los coeficientes de partición de los componentes y puedeProduce un cambio en los coeficientes de partición de los componentes y puedeconducir a una mejor resolución.conducir a una mejor resolución.Existen dos métodos de programación de Solvente en HPLC:Existen dos métodos de programación de Solvente en HPLC:IsocráticoIsocráticoGradiente de Elución. proceso mediante el cual se cambia laGradiente de Elución. proceso mediante el cual se cambia lacomposición de la fase móvil. Pueden efectuarse de dos maneras:composición de la fase móvil. Pueden efectuarse de dos maneras:A baja presiónA baja presiónA alta presiónA alta presiónPermite obtener la mejor resolución de los componentes de laPermite obtener la mejor resolución de los componentes de lamuestra en el menor tiempo posible.muestra en el menor tiempo posible.Cuando se desarrolla un análisis usando el método de gradiente seCuando se desarrolla un análisis usando el método de gradiente sedebe tener presente dos objetivos:debe tener presente dos objetivos:Asegurar alta precisión y exactitud.Asegurar alta precisión y exactitud.Determinar la composición inicial y final del solvente.Determinar la composición inicial y final del solvente.Para obtener buenos resultados con el método de gradientePara obtener buenos resultados con el método de gradientedebemos seguir pasos fundamentales:debemos seguir pasos fundamentales:a) Ajustar el tiempo del gradientea) Ajustar el tiempo del gradienteb) Determinar la forma del gradiente (lineal, concava o convexa)b) Determinar la forma del gradiente (lineal, concava o convexa)c) Ajustar la velocidad del flujo para mejorar la resoluciónc) Ajustar la velocidad del flujo para mejorar la resoluciónd) Regresar a las condiciones iniciales la columna.d) Regresar a las condiciones iniciales la columna.
  31. 31. Sistemas de Inyección de muestraSistemas de Inyección de muestraEstos sistemas han variados durante la historiaEstos sistemas han variados durante la historiadel sistema de HPLC, en un principio dedel sistema de HPLC, en un principio deutilizaba la inyección de la muestra con jeringasutilizaba la inyección de la muestra con jeringasde alta presión las cuales ya están de desuso.de alta presión las cuales ya están de desuso.Hoy se utiliza el sistema de válvulas inyectoras .Hoy se utiliza el sistema de válvulas inyectoras .
  32. 32. DetectoresDeben de tener un volumen interno pequeño parareducir el ensanchamiento de picoBasados en una propiedad de la fase móvil (refracción,densidad etc.)Basados en una propiedad del soluto (absorbancia enUV, fluorescencia etc.)Tipos de detectoresDetector de absorbanciaDetector de fluorescenciaDetector de índice de refracciónDetector de dispersión de luzDetector electroquímicoDetector por espectroscopia de masas
  33. 33. UHPLCUHPLCMenor tamaño de particula de rellenoMenor tamaño de particula de rellenoMenor tamaño de columnaMenor tamaño de columnaMayor velocidad de flujoMayor velocidad de flujoMayores presionesMayores presionesMenos tiempo de análisisMenos tiempo de análisis

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