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Rapport stage pm

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Rapport stage pm

  1. 1. Biogenèse des Signaux Peptidiques Université Pierre et Marie Curie - ER3 BIOSIPE Responsables de stage : Sandrine Cadel, Thierry Foulon Parcours « Molécules et Cibles Thérapeutiques » Année 2009-2010 Patricia Masson Recherche d’acides aminés impliqués dans la spécificité de reconnaissance du substrat et dans le mécanisme catalytique de l’Aminopeptidase B
  2. 2. L’aminopeptidase B (EC 3.4.11.6) <ul><li>Enzyme monomérique : 72 kDa </li></ul><ul><li>Ubiquitaire chez les vertébrés </li></ul><ul><li>Zn 2+ -métallopeptidase </li></ul><ul><li>H E XX H X 18 E - Famille M1 </li></ul><ul><li>Enlève les résidus basiques (R, K) en NH 2 terminal des peptides (Arg-enképhalines…) </li></ul><ul><li>Activation par les ions chlore </li></ul><ul><li>Phylogénétiquement très proche de la LTA 4 hydrolase (33% identité, 48% similarité de séquence) </li></ul><ul><li>Présente une activité résiduelle leucotriène A 4 hydrolase in vitro </li></ul><ul><li>Enzyme bifonctionnelle </li></ul>
  3. 3. <ul><li>Protéine monomérique de 69 kDa </li></ul><ul><li>Enzyme bifonctionnelle </li></ul><ul><li>LTA 4 Hydrolase </li></ul><ul><li>Aminopeptidase (Ala, Arg, Lys, Pro, Leu) </li></ul><ul><li>Famille M1 des aminopeptidases </li></ul><ul><li>Activation par les ions chlore </li></ul><ul><li>Structure 3D (Thunnissen et al. , 2001) </li></ul>La leucotriène A 4 hydrolase (EC 3.3.2.6)
  4. 4. Modèle moléculaire de l’Aminopeptidase B NH 2 Domaine catalytique COOH
  5. 5. Famille M1 des Aminopeptidases HEXXHX 18 E Liaison peptidique
  6. 6. Mécanisme catalytique proposé pour l’activité aminopeptidase de la LTA 4 hydrolase (Tholander et al., 2008)
  7. 7. Objectifs But : Identifier des résidus de l’Ap-B ayant un rôle dans le mécanisme enzymatique et la spécificité de reconnaissance du substrat Mutagenèse dirigée Alignements des séquences des aminopeptidases de la famille M1 Modèle moléculaire de l’Ap-B
  8. 8. Matériels et Méthodes M 72 kDa M 72 kDa 170kDa 95kDa 72kDa 55kDa Mutagenèse dirigée Expression et purification des protéines (HP His trap et Sephadex G100) Test d’activité (spécificité de substrat; K M , k cat , K i , effet des ions Cl - ) Electrophorèse et Western Blot
  9. 9. Cibles de mutagenèse dirigée Reconnaissance et la fixation du substrat? Mécanisme catalytique?
  10. 10. Les mutants Y 228 F, Y 408 F, Y 413 F et Y 440 F Tyr 408 Tyr 413 Tyr 228 Tyr 440
  11. 11. Les mutants Y 408 F et Y 440 F <ul><ul><li>Effet des ions chlore </li></ul></ul> Augmentation de l’activité d’un facteur 3 en présence de 150 mM NaCl Y 408 F Y 440 F
  12. 12. <ul><ul><li>Paramètres cinétiques (L-Arg  -NA) </li></ul></ul><ul><li>Diminution de l’efficacité catalytique (x 5) </li></ul><ul><li>pour les mutants Y 408 F et Y 440 F </li></ul>Les mutants Y 228 F, Y 408 F, Y 413 F et Y 440 F Mutant Activité K M (µM) k cat (s -1 ) k cat /K M (µM -1 . s -1 ) Sauvage oui 115 28 0,243 Y 228 F non - - - Y 413 F non - - - Y 408 F oui 86 4,1 0,048 Y 440 F oui 47,3 2,5 0,053
  13. 13. <ul><li>Effet des inhibiteurs </li></ul> Modification du profil d’inhibition Les mutants Y 408 Fet Y 440 F Arphaménine A (1 µM) Arphaménine B (1 µM) Bestatine (1 µM) Sauvage 100 % Ki = 20 nM 100 % Ki = 20 nM 100 % Ki = 50 nM Y 408 F 20 % 40 % 25 % Y 440 F 70 % Ki = 120 nM 94 % Ki = 40 nM 54 % Ki = 155 nM
  14. 14. Les mutants tyrosine : Hypothèses / Conclusions <ul><li>2 tyrosines dont la fonction hydroxyle est essentielle dans l’activité : </li></ul><ul><ul><ul><li>Y 413 polarise et maintient le carbonyle de la liaison peptidique clivée </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>Y 228 établit une liaison hydrogène avec E 300 qui lui même interagit avec l’extrémité amino-terminale du peptide </li></ul></ul></ul><ul><li>Y 408 Interaction π avec le groupement guanidinium ou aminé du substrat- Spécificité de substrat? </li></ul><ul><li>Liaison hydrogène avec la Y 413 </li></ul><ul><li>Y 440 conservée : Rôle architectural / Attraction de molécule d’eau ??? </li></ul>
  15. 15. Les mutants D 403 V, D 405 N, D 405 V et D 406 N Gel D 403 , D 405 et D 406 D 368 , D 371 , D 373 et D 375 de la LTA 4 hydrolase
  16. 16. Les mutants D 403 V et D 406 N : spécificité de reconnaissance du substrat D 406 N D 403 V  Activité majoritaire avec les substrats basiques : Arg et Lys  Elargissement de la spécificité de reconnaissance : Arg, Lys, Ala, Pro, Leu, Tyr, Phe, His et Met
  17. 17. Les mutants D 405 N et D 405 V : spécificité de reconnaissance du substrat  Diminution d’un facteur 2 de l’activité vis-à-vis de substrat s basiques pour le D 405 V par rapport au D 405 N  Elargissement de la spécificité de reconnaissance : Arg, Lys, Ala, Pro, Leu, Tyr, Phe, His, Met
  18. 18. Les mutants D 403 V, D 405 N et D 405 V WT D 403 V D 405 N D 405 V L-Arg kcat ( s -1 ) 28 0,9 2,7 0,5 Km ( µM) 115 114 136 63 kcat/Km (µM -1 .s -1 ) 0,243 0,008 (÷30) 0,020 (÷12) 0,007 ( ÷ 35) L-Lys kcat ( s -1 ) 9 1,3 - - Km ( µM) 188 176 - - kcat/Km (µM -1 .s -1 ) 0,047 0,007 ( ÷ 3) - - L-Ala kcat ( s -1 ) Liaison peptique non hydrolysée 2,4 1,3 Km ( µM) 401 212 kcat/Km (µM -1 .s -1 ) 0,005 0.006 L-Pro kcat ( s -1 ) 1,5 - Km ( µM) 252 - kcat/Km (µM -1 .s -1 ) 0,005 -
  19. 19. Les mutants D 405 N et D 405 V <ul><li>Effet des ions chlore </li></ul> Augmentation d’un facteur 4 de l’activité à 200mM de NaCl vis-à-vis du L-Arg β -NA  Effet moindre vis-à-vis du L-Arg β -Na (2X) mais plus prononcé vis-à-vis d’autres substrats : Pro, Tyr (2X) D 405 N D 405 V
  20. 20. Le mutant D 405 V <ul><li>Effet des inhibiteurs </li></ul> Très faible inhibition par les arphaménines A et B contrairement à la bestatine D 405 V
  21. 21. Les mutants aspartates : Hypothèses/Conclusions <ul><li>Liaison électrostatique entre le D 405 et le groupement guanidinium de l’arginine (RAR) dans ce modèle </li></ul><ul><li>Hypothèse : déstructuration de la petite hélice pour induire une orientation différente de D 405 et D 406 lorsque le substrat est positionné </li></ul><ul><li>Effet du chlore complexe, ne semble pas lié à la charge négative du D 405 . Le remplacement D 405 V modifie cet effet. </li></ul>Asp 405 Asp 403 Asp 406 <ul><li>Les chaines latérales et en particulier les charges négatives de D 405 et D 406 sont importantes pour la spécificité de l’Ap-B </li></ul>
  22. 22. Perspectives Confirmer les résultats obtenus Effet du chlore : paramètres cinétiques (K M , k cat ) en fonction du substrat et de la mutation Concevoir d’autres mutants: Simples: F 296 Y, K 599 G, Y 408 G… Doubles: F 296 Y/K 599 R; D 405 N/D 406 N, D 405 V/D 406 V … Triples: D 403 A/D 405 A/D 406 A…. Activité vis-à-vis de différents peptides Informations structurales (dichroïsme circulaire, spectroscopie de fluorescence) Structure 3D avec un inhibiteur  confirmation du modèle proposé
  23. 23. À plus long terme : Décrypter les mécanismes catalytiques Différences entre ApB et la LTA 4 hydrolase (bifonctionnalité) Conception d’ inhibiteurs spécifiques de chacune des activités de l’ApB  Cibler pathologies Identifier les substrats peptidiques physiologiques de l’ApB
  24. 24.
  25. 25. MUTAGÉNÈSE POUR FAIRE UN SITE ACTIF SIMILAIRE À CELUI DE LA LTA 4 HYDROLASE
  26. 26. Etude du mutant K 599 R <ul><ul><li>Paramètres cinétiques </li></ul></ul> Diminution de l’efficacité catalytique d’un facteur 2,7 <ul><li>Effet des inhibiteurs </li></ul>Mutant K M (µM) k cat (s -1 ) k cat /K M (µM -1 . s -1 ) Sauvage 115 28 0,243 K 599 R 73 ( ÷ 1,6) 6,5 ( ÷ 4,3) 0,089 ( ÷ 2,7) Mutant Arphaménine A (1 µM) Arphaménine B (1 µM) Bestatine (1 µM) Sauvage Ki = 20 nM Ki = 20 nM Ki = 50 nM K 599 R Ki = 300 nM Ki = 160 nM -
  27. 27. Liaison électrostatique entre le groupement aminé et le carboxylate C-terminal du peptide: Arg  -NA pas d’intérêt Effet des inhibiteurs est moindre avec le mutant K 599 R Liaison électrostatique avec le E 569 moins forte ?? K 599 E 569 R 704 Le mutant K 600 R : Hypothèses/Conclusions

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