O relatório descreve um estudo que purificou um extrato de Guazuma ulmifolia e testou sua atividade antiviral contra o HIV. O extrato foi fracionado em frações butanólica, aquosa e total, que foram testadas contra células infectadas com HIV. A fração butanólica mostrou atividade antiviral.

1. 1. DADOS CADASTRAIS DO SOLICITANTE
NOME: Paulo Antônio Rodrigues Gouveia
ENDEREÇO: Rua Goianesia, nº78, Conjunto Urbanístico.
CIDADE: Araguaina - TO
CEP: 77818-772
CNPJ/CPF: 388.684.581-87
INSCRIÇÃO ESTADUAL: ---
2. DADOS AMOSTRA
IDENTIFICAÇÃO DO PRODUTO: “Extrato” aquoso de Guazuma ulmifolia.
TOTAL AMOSTRA: 5 frascos.
LOCAL DE PRODUÇÃO: Fornecido pelo solicitante.
LOTE: ---
VALIDADE: ---
3. ENSAIOS
ENSAIOS REALIZADOS: Purificação do “extrato” aquoso de Guazuma ulmifolia e estudo da
atividade antiviral (HIV) in vitro.
4. EXECUÇÃO DOS ENSAIOS
KYOLAB LABORATÓRIO LTDA.
CNPJ: 05.758.608/0001-01
Rua Lauro Vanucci, 1020 – Jd. Santa Cândida – Campinas-SP
CEP: 13087-548
RESPONSÁVEL PELO ENSAIO: Thaís Barbizan Ferreira da Costa e Dr. Amilcar Tanuri
DATA DE RECEBIMENTO DA AMOSTRA: Fevereiro/2012
Período de realização do ensaio: Abril/Maio 2012
Data emissão do relatório: 01/06/2012
Kyolab, 01 de junho de 2012.
KYOLAB Laboratório Ltda
www.kyolab.com.br
CNPJ: 05.758.608/0001-01
Laboratório: Rua Lauro Vannucci, nº 1020 – Jd. Sta. Cândida
Campinas – SP CEP: 13087-548 Fone: 55 (19) 4062-8090 / (11) 4063-8090 Ramal: 1100
Administrativo: Av. José da Rocha Bonfim, nº 214 – Edifício Londres - Cond. Praça Capital
Campinas- SP CEP: 13080-650
Fone/FAX: 55 (19) 37091151

2. RELATÓRIO TÉCNICO
Purificação do “extrato” aquoso de Guazuma ulmifolia e estudo da atividade
antiviral (HIV) in vitro.
1. Identificação da amostra
Extrato aquoso de Guazuma ulmifolia fornecido pelo solicitante.
2. Objetivos
Purificação do extrato aquoso e avaliação da atividade antiviral (HIV) in vitro.
3. Método
3.1 Purificação do extrato aquoso: Foi realizada uma filtração do extrato
fornecido e após uma partição líquido – líquido com hexano e butanol, como pode
ser observado no fluxograma 1. O hexano extraiu muito pouco, com isso, não se
obteve uma massa significativa. Foi realizada uma Cromatografia em Camada
Delgada para uma comparação da composição química das diferentes amostras
obtidas com a partição. Para avaliação da atividade antiviral (HIV) in vitro, foram
enviadas as amostras: Fração butanólica (BuI), Fração aquosa (AQI) e extrato
total após a filtração (TI).
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3. Extrato aquoso
Guazuma
V= 200mL
- Funil de separação;
- 200mL Hexano;
- Agitação e separação das fases.
Fr. Hexânica
Fr. Aquosa
- 200mL Butanol;
- Agitação;
- Separação das fases.
FR. BuOH 1
Agrupamento das
duas frações.
Fr. Aquosa
- 100mL Butanol;
- Agitação;
- Separação das fases.
FR. BuOH 2
m = 166,7mg
Fr. Aquosa
M = 1,4662g
Fluxograma 1: Partição líquido/líquido extrato aquoso de Guazuma ulmifolia.
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4. Cromatografia em Camada Delgada:
Pontos:
1) Extrato aquoso após filtração;
2) Fração Aquosa;
3) Fração Butanólica.
Eluente:
Acetato de etila: Ác. Fórmico: Água ( 90:5:5)
Revelador:
Solução de Anisaldeído.
3.2 Teste de ação antiviral das frações (BUI e AQI) e extrato (TI), vindos da
Guazuma ulmifolia usando células MT4.
3.2.1 Vírus padrão: isolado NL4-3 (subtipo B, padrão) purificado de
passagem em cultura de células MT-4. Título: 103 TCID50 / ml.
3.2.2 Linhagem celular utilizada: MT-4, linhagem linfocitária estabelecida
em cultura, CD4+, expressando co-receptores CCR5 e CXCR4 do HIV-1. Célula
formadora de sincício (SI) e muito sensível à infecção pelo HIV-1.
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5. 3.2.3 Desenho do ensaio: Infecção em placa de 96 poços, contendo 104
células/poço, infectadas com MOI (multiplicidade de infecção) de 0,002
(recomendação do NIH= 0,001 a 0,01). As três amostras (BUI, TI, e AQI) vindos
da Guazuma ulmifolia, foram diluídos em DMSO a 20mg/ml e posteriormente
diluído em meio base RPMI 1640 para 200µg/ml no primeiro poço das células
infectadas previamente com o isolado HIV-1 NL4-3 (subtipo B). Depois as células
foram expostas a concentrações decrescentes da droga, a partir de fator de 5 de
diluição. O meio de cultura utilizado foi o RPMI 1640 adicionado de 10% de soro
fetal bovino, antibióticos estreptomicina/penicilina a 1% e L-glutamina a 0,2mgml.
O poço mais concentrado possuía concentração final de 200µg/ml, seguindo-se as
diluições sucessivas de 5 vezes como indicado: 40µg/ml, 8µg/ml, 1,6 µg/ml,
0,32µg/ml. No último e nono poço, foi mantido como controle da infecção, sem a
presença da droga. Cada linha de 10 poços de infecção foi produzida em
sextuplicata, para tratamento estatístico posterior. Um quarto “array” (linha) de 10
poços de células foi exposto à diluição seriada da droga, como descrito, mas sem
a presença de vírus, para análise de citotoxidade da droga, nesta faixa de
concentração. A infecção, mantida em estufa CO2 5% a 37°C, foi acompanhada
diariamente por microscopia óptica de fase, para análise do aparecimento de
sincícios, o que acontece geralmente no quarto dia pós-infecção.
3.2.4 Revelação do ensaio: A técnica utilizada de coloração CellTiter-Blue
Assay da Promega para medida da viabilidade celular, foi utilizada no sexto dia
p.i., a fim de permitir a diferenciação de viabilidade celular pós formação de
sincício. Após coloração, a placa de 96 poços será lida em fluorimetro 560. Ex.
/590. Em. Os resultados foram analisados em matriz Microsoft Excel p/ Windows
(Office 98), efetuando-se a correção do branco, e a plotagem em gráfico da
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6. frequência de emissão do ensaio (em porcentagem, usando como padrão 100% a
emissão de poço de células viáveis sem infecção) como medida da viabilidade
celular. O valor de 50% da emissão do padrão foi considerado como ponto de
“cutoff” para o cálculo do EC50 (concentração inibitória da droga em 50% da
infecção) após obtenção, no gráfico, da equação da curva de regressão
logarítmica (ou semi-logarítmica).
Um novo experimento com a amostra Bu1 foi realizado para corroborar os
dados anteriores e também confirmar efeito anti-HIV desta amostra.
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7. 4. Resultados
Observam-se abaixo os dados brutos do ensaio com as amostras de Guazuma
ulmifolia.
Experimento 1:
ug/ml
AQ1
100
1
3218.536
3742.886
3791.326
3111.216
3035.973
3018.325
20
2
3787.642
3349.466
3862.401
19477.83
11976.43
10846.91
4
3
3054.273
2993.495
3165.824
4366.21
8528.929
24493.36
0.8
4
3029.623
2921.36
3175.966
2674.602
5251.845
10675.08
0.16
5
3050.815
3504.554
3471.753
3761.903
4034.446
10511.61
0.032
6
2942.556
3313.594
3284.441
3076.742
6046.562
11035.92
0.0064
7
2838.061
3368.63
3324.773
6052.958
9489.978
13717.92
0.00128
8
3266.952
3508.849
3071.067
3048.72
7767.46
7460.173
0 MOCK
9
10
3856.086 21463.08
3831.135 14058.51
4265.1 20294.67
7240.043 7477.002
10664.81 12772.81
11631.7 14904.05
T1
1
4678.774
3648.367
4505.607
3478.071
3464.056
3466.57
2
4786.826
4698.749
4855.646
11082.36
18769.24
30047.38
3
3640.615
3396.308
3050.558
20798.67
23575.37
42701.53
4
3197.269
3033.221
3060.215
3092.523
6290.354
20304.38
5
2969.581
2937.966
2851.461
6175.344
11040.51
21610.14
6
3167.663
3177.718
3222.067
9931.44
12574.45
33459.76
7
3161.772
3185.137
3087.069
6314.826
6861.942
23847.6
8
2945.539
2912.907
3152.385
6791.282
10059.75
20340.6
9
2893.992
3171.715
3232.763
7868.27
20465.64
24218.94
10
15247.06
16203.14
19429.31
11966.43
22468.87
29270.19
BU1
1
3780.665
3725.434
3694.26
3706.6
3751.745
3786.029
2
6687.205
9439.628
6138.598
9131.073
13926.65
21043.8
3
4030.617
3754.924
3697.187
9456.156
13667.83
35402.97
4
3735.877
3216.574
3453.84
4017.167
5648.854
20247.16
5
3343.416
3391.877
3268.927
6634.354
28670.71
40455.04
6
3349.616
3571.244
3461.059
4801.022
11885.63
36367.43
7
3335.424
3594.279
3536.97
3718.691
6658.553
14835.89
8
3387.817
3599.979
3485.578
4119.047
3977.721
9229.815
9
3535.693
3483.987
3595.887
19062.17
6637.935
14016.52
10
21099.38
20940.39
28091.88
10836.41
13054.59
23878.32
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8. Figura 1: Sobrevivência da célula MT4 com diferentes concentrações das amostras BU1, TN1, e AQ1. Podese verificar uma proteção parcial das células com a amostra BU1 ( 30%) na concentração de 20ug/ml.
Experimento 2:
Seguem abaixo os dados da repetição do experimento com a amostra Bu1.
ug/ml
120
1823.828
1754.799
1744.599
1723.314
1745.994
1811.232
24
7267.684
7431.17
6982.898
7768.199
26911.6
27341.41
4.8
3611.812
3269.485
4333.729
3425.291
31401.27
35005.58
0.96
3179.984
3695.089
4048.463
4360.88
34002.62
33018.74
0.192
3606.229
3082.308
3943.282
3168.434
32780.6
33096.76
0.0384
3365.61
4431.423
4972.181
3841.711
31191.5
34080.29
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0.00768
3273.242
3857.433
3180.402
3847.31
33799.98
34062.86
0.001536
4442.716
3150.869
3760.187
3339.885
34284.94
35448.51
0
4141.916
3247.724
4009.271
3148.082
3049.602
3335.248
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MOCK
33535.09
33003.2
31025.81
35635.67
35846.08
33422.74

9. Figura 2: Repetição do experimento anterior com o extrato BU1. O histograma mostra sobrevivência da célula
MT4 infectada com vírus HIV-1 pNL43 com um MOI de 0,01 e simultaneamente a citotoxidade com diferentes
concentrações da amostra BU1. Podemos verificar uma proteção parcial das células com a amostra BU1 (
30%) na concentração de 24ug/ml. Repare que a citotoxidade do BU1 ainda é muito alta e encobre o efeito
antiviral.
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10. 5. Conclusões
Como visto no primeiro experimento, a amostra com atividade antiviral mais
marcante foi a BU1.
O segundo experimento, validou e pode-se observar a
sobrevivência da célula MT4 com diferentes concentrações das amostras BU1,
TN1 e AQ1. Verifica-se uma proteção parcial das células com a amostra BU1
(30%) na concentração de 20ug/ml. Contudo, a amostra não protegeu a totalidade
das células porque ainda há muitos compostos tóxicos na mesma. Há
necessidade de purificação a partir da planta in natura para realização e repetição
dos testes.
____________________________
Luiz Francisco Pianowski
Presidente
KYOLAB Laboratório Ltda
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