Door: Patrick van DorstBPV-begeleiderStage begeleider
Proeve van bekwaamheid                         Student;                         Patrick van Dorst                         ...
Proeve van bekwaamheid                                                                                 InhoudsopgaveInhoud...
Proeve van bekwaamheid                   Literatuurbronnen:..................................................................
Proeve van bekwaamheid             Verklaring gebruikte afkortingenAfkorting     Betekenis[15-A-DON]    concentratie 15-Ac...
Proeve van bekwaamheid                                           VoorwoordOp mijn laatste stage, in dit geval het IRS te B...
Proeve van bekwaamheid                  Methode ontwikkeling Mycotoxines                                  Wat zijn Mycotox...
Proeve van bekwaamheid                                   Het onderzoekHet onderzoek naar de methode ontwikkeling voor het ...
Proeve van bekwaamheid                                           Instellingen HPLCOm mycotoxines te kunnen meten door midd...
Proeve van bekwaamheid                                      De analyse                                            IJklijnO...
Proeve van bekwaamheidUit de metingen is gebleken dat de opbrengst door gebruik te maken van de kolommen slechts24% en res...
Proeve van bekwaamheidHet bleek na deze meting dat de DON niet aan de eiwitten in de kolom bleven hechten,hierdoor wordt d...
Proeve van bekwaamheidopvang. Wat er dus in de 1ste opvang terug gevonden werd was de rest van de DON die niet opde eiwitt...
Proeve van bekwaamheidmonster ingewogen worden, deze vervolgens 1,5 a 2 uur geëxtraheerd door middel van 100mlACN/H2O oplo...
Proeve van bekwaamheidvan deze 3 breimonsters zijn vergeleken met zowel een combistandaard als een breimonsterwaar wel DON...
Proeve van bekwaamheid                         Resultaten    Figuur 1: De stapgradiënt voor het opschonen van de kolom    ...
Proeve van bekwaamheid                    Figuur 5: Teruggevonden DON    ID        [DON] µg/ml    DON (area)   recovery DO...
Proeve van bekwaamheid                                   Figuur 5a: Teruggevonden 15A-DON                     ID          ...
Proeve van bekwaamheid                Figuur 9: Resultaten ter bevestiging Biofarm                        ID              ...
Proeve van bekwaamheid                       Figuur 12: Analyse breimonster op mycotoxines                        Analyse ...
Proeve van bekwaamheid                             Conclusie en DiscussieDe opdracht was naar mijn idee in het begin leek ...
Proeve van bekwaamheid           Bijlage  Bijlage 1; De ijklijn van DON                    y=3,88x2+2,32x-0,00            ...
Proeve van bekwaamheidBijlage 3: spectra van een standaard                23
Proeve van bekwaamheidBijlage 4; Spikeoplossing in ACN                                   Bijlage 5; Spikeoplossing ingedam...
Proeve van bekwaamheid             Bijlage 6; Procedure om de DONprep kolom te gebruiken                 1          2     ...
Proeve van bekwaamheid            Bijlage 8: Brei monsters TP4 spectra rechtstreeks en na de kolomBijlage 9: Brei 33558 ve...
Proeve van bekwaamheidBijlage 10: Brei 03864 vergeleken met een standaard en monster dat wel DON en 15-ADON               ...
Proeve van bekwaamheid                                   Samenvatting                                        Nederlands:Op...
Proeve van bekwaamheid                                          Engels:On the 26th February 2008 I started with the projec...
Proeve van bekwaamheid                              Literatuurbronnen:                                         Boeken:Tite...
Upcoming SlideShare
Loading in …5
×

Afstudeerscriptie MLO

1,580 views

Published on

Published in: Education, Technology, Business
0 Comments
0 Likes
Statistics
Notes
  • Be the first to comment

  • Be the first to like this

No Downloads
Views
Total views
1,580
On SlideShare
0
From Embeds
0
Number of Embeds
1
Actions
Shares
0
Downloads
5
Comments
0
Likes
0
Embeds 0
No embeds

No notes for slide

Afstudeerscriptie MLO

  1. 1. Door: Patrick van DorstBPV-begeleiderStage begeleider
  2. 2. Proeve van bekwaamheid Student; Patrick van Dorst Kerkstraat 16 4664 BR Lepelstraat BPV-instelling; IRS Postbus 32 4600 AA Bergen op Zoom BPV-begeleiders; Theo van Tilbeurgh Peter Gijssel BPV-periode; januari 2008 - juni 2008 Stagedocent; Wim Migchielsen 2
  3. 3. Proeve van bekwaamheid InhoudsopgaveInhoudsopgave........................................................................................................................................................................................................3Verklaring gebruikte afkortingen...........................................................................................................................................................................5Voorwoord..............................................................................................................................................................................................................6Methode ontwikkeling Mycotoxines......................................................................................................................................................................7 Wat zijn Mycotoxines?...........................................................................................................7 Oorzaken van het ontstaan van mycotoxines..........................................................................7Het onderzoek.........................................................................................................................................................................................................8 De loopvloeistoffen.................................................................................................................8 Instellingen HPLC...................................................................................................................9 Monster voorbereiding............................................................................................................9De analyse.............................................................................................................................................................................................................10 IJklijn....................................................................................................................................10 De opzuiverings kolommen..................................................................................................10 De DONprep kolom..........................................................................................................10 De Varian kolom...............................................................................................................13Resultaten.............................................................................................................................................................................................................16 Figuur 1: De stapgradiënt voor het opschonen van de kolom...........................................16 Figuur 2: Standaardenreeks...............................................................................................16 Figuur 3: Verdunde spike oplossing rechtstreeks en door de kolom................................16 Figuur 5: Teruggevonden DON........................................................................................17 Figuur 5a: Teruggevonden 15A-DON..............................................................................18 Figuur 6: Verdunde DON oplossing.................................................................................18 Figuur 7: Verdunde DON oplossing met 2 druppels PEG toegevoegd............................18 Figuur 8: Resultaten TP3..................................................................................................18 Figuur 8a: Resultaten TP4.................................................................................................18 Figuur 9: Resultaten ter bevestiging Biofarm...................................................................19 Figuur 10: Verdunde spikeoplossing met oplossing A:....................................................19 Figuur 11: Verdunde spikeoplossing door kolom:...........................................................19 Figuur 11a: Verdunde spike oplossing ingedampt en aangevuld met oplossing A:.........19 Figuur 12: Analyse breimonster op mycotoxines.............................................................20 Figuur 13: Analyse breimonster waar geen mycotoxines aanwezig zijn..........................20Conclusie en Discussie.........................................................................................................................................................................................21Bijlage...................................................................................................................................................................................................................22 Bijlage 1; De ijklijn van DON..........................................................................................22 Bijlage 2; De ijklijn van 15-A-DON.................................................................................22 Bijlage 3: spectra van een standaard.................................................................................23 Bijlage 4; Spikeoplossing in ACN ...................................................................................24 Bijlage 5; Spikeoplossing ingedampt en oplossing A.......................................................24 Bijlage 6; Procedure om de DONprep kolom te gebruiken..............................................25 Bijlage 7: Brei monsters TP3 spectra rechtstreeks en na de kolom..................................25 Bijlage 8: Brei monsters TP4 spectra rechtstreeks en na de kolom..................................26 Bijlage 9: Brei 33558 vergeleken met een standaard en monster dat wel DON en 15- ADON bevat.....................................................................................................................26 Bijlage 10: Brei 03864 vergeleken met een standaard en monster dat wel DON en 15- ADON bevat.....................................................................................................................27 Bijlage 11: Brei 7661 vergeleken met een standaard en monster dat wel DON en 15- ADON bevat.....................................................................................................................27Samenvatting........................................................................................................................................................................................................28 Nederlands:...........................................................................................................................28 Engels:...................................................................................................................................29 3
  4. 4. Proeve van bekwaamheid Literatuurbronnen:............................................................................................................................................................30Boeken:.................................................................................................................................30Internet:.................................................................................................................................30 4
  5. 5. Proeve van bekwaamheid Verklaring gebruikte afkortingenAfkorting Betekenis[15-A-DON] concentratie 15-Acetyl-Deoxynivalenol[DON] concentratie Deoxynivalenol15-A-DON 15-Acetyl-DeoxynivalenolACN AcetonitrileDON DeoxynivalenolH2O MilliQ waterHPLC High Performance Liquid ChromatographyMeOH methanolml millilitermg milligramOpl. oplossingPEG polyethyleenglycolUV Ultraviolet 5
  6. 6. Proeve van bekwaamheid VoorwoordOp mijn laatste stage, in dit geval het IRS te Bergen op Zoom, moet ik de proeve vanbekwaamheid uitvoeren. Hieronder wordt verstaan dat in binnen het IRS moet gaan werkenaan methode ontwikkeling.De opdracht is het ontwikkelen van een methode voor het bepalen van mycotoxines in brei.Brei is gemalen suikerbiet. De mycotoxines waar het om gaat tijdens deze proeve vanbekwaamheid zijn: 15-Acetyl- Deoxynivalenol (15-A-DON) en Deoxynivalenol (DON). Ditwordt gedaan met behulp van HPLC analyse en UV-detectie.Hierbij wordt gekeken of het nodig is om het monster voor te bewerken door middel van eenopzuiveringskolom of dat het monster rechtstreeks kan worden gemeten. Hierbij wordt naareen tweetal zuiveringskolommen gekeken: DONprep van Biopharm en Bond EluteMycotoxin Column van Varian. Om de betrouwbaarheid van de metingen zeker te stellenworden er onder andere recovery bepalingen uitgevoerd.Tijdens het gehele project wordt er gewerkt met de onderstaande HPLC apparatuur: 1. Pomp: SP8800 (Spectra Physics - binair) 2. Kolom: Inertsil 5ODS-3 (Varian) 3. Detector: Spectra Physics UV Spectra 200 4. Autosampler: Gilson Model 231In dit verslag wordt van dag tot dag beschreven welke werkzaamheden er samen met mijnBPV-begeleider heb uitgevoerd om een methode te ontwikkelen voor het onderzoeken van dehoeveelheid mycotoxinen in breimonsters.Graag zou ik Peter Gijssel en Theo van Tilbeurgh willen bedanken voor hun steun aan ditproject. Ook de overige medewerk(st)ers wil ik bedanken voor de leuke en leerzameervaringen die ik heb opgedaan binnen het IRS. 6
  7. 7. Proeve van bekwaamheid Methode ontwikkeling Mycotoxines Wat zijn Mycotoxines?Een mycotoxine is een gif dat geproduceerd wordt door een organisme van deschimmelfamilie, zoals paddenstoelen, draadvormige schimmels en gist.De meeste schimmels zijn aëroob, deze hebben zuurstof nodig om te kunnen overleven, enkomen overal voor in zeer kleine hoeveelheden vanwege hun sporen. Zodra de juisteluchtvochtigheid en temperatuur daarvoor de gelegenheid biedt, begint de ontwikkeling vande cellen van de schimmels door het consumeren van organisch materiaal, waardoor hetmycotoxine niveau stijgt. De gifstoffen zijn enzymen of proteïnen.Mycotoxines komen in de voedselketen door een schimmelinfectie van landbouwproducten ofdoor het eten van giftige paddenstoelen. Zelfs als het product niet door mensen geconsumeerdwordt blijft het schadelijk voor de gezondheid omdat het waarschijnlijk als veevoeder wordtgebruikt. Mycotoxinen zijn uiterst resistent in de spijsvertering en blijven daardoor in devoedselketen van vlees en zuivelproducten zoals melk en kaas. Temperatuurbehandelingenzoals verhitten en bevriezen hebben geen invloed op het mycotoxine-gehalte.De FAO (Food and Agriculteral Organisation) in Nederland bekend beter bekend als Voedsel-en Landbouworganisatie schat dat circa 25% van alle voedselproducten in de wereldmycotoxinen bevatten. In de Europese Unie zijn de wettelijke niveaus van een aantalmycotoxinen in voedsel en dierenvoeding vastgesteld door een aantal Europese richtlijnen enCommissieverordeningen. Oorzaken van het ontstaan van mycotoxinesEr zijn een aantal verschillende oorzaken waardoor er mycotoxines kunnen wordenaangetroffen in verschillen landbouw producten. Een aantal oorzaken kunnen onder anderezijn: • Primaire verontreiniging: granen worden al tijdens de teelt door schimmels besmet zoals moederkoorn op rogge, tarwe en gerst. Deze soort van mycotoxinen wordt ook wel genaamd de veld mycotoxinen, en behoort vooral tot de Fusarium mycotoxinen. • Secundaire verontreiniging: opgeslagen levensmiddelen beschimmelen door Aspergillus of Penicillium. Deze soorten van mycotoxines wordt ook wel genoemd de opslag-mycotoxinen; voorbeelden zijn: o Aflatoxinen o Ochratoxine A. • Metabolisme in het dier: vee krijgt beschimmelde levensmiddelen en de mycotoxinen worden gemetaboliseerd. Ze belanden in de eindproducten: melk, eieren, vlees. Een voorbeeld hiervan is aflatoxine M1 wat gevormd wordt in de melk na besmetting met aflatoxine B1. • Schimmelvorming bij bewaring, een voorbeeld hiervan is het bewaren van suikerbieten. 7
  8. 8. Proeve van bekwaamheid Het onderzoekHet onderzoek naar de methode ontwikkeling voor het bepalen van mycotoxines is begonnenop 26 februari 2008. De bedoeling van de opdracht is het ontwikkeling van een methode voorhet bepalen van Mycotoxines in breimonsters.Om het onderzoek goed uit te kunnen voeren moeten er eerst een aantal instellingen bepaaldworden, zoals: 1. Wat voor loopvloeistoffen gaan we gebruiken? 2. Uit welke vloeistoffen bestaan de loopvloeistoffen? 3. Uit welke concentraties bestaan de loopvloeistoffen? 4. Wat voor instellingen van de HPLC zijn er nodig om een goed resultaat te verkrijgen? 5. Welke extractievloeistof gaan we gebruiken voor het extraheren van de breimonsters? 6. Uit welke concentratie bestaat deze extractievloeistof en welke vloeistoffen zijn dit?Dit moesten we deels zelf uit vinden, maar er stonden ook een aantal instelling op devoorschriften die we hebben gebruikt. De loopvloeistoffenOm mycotoxines te meten door middel van de HPLC heb je een loopvloeistof nodig, tijdenshet uitvoeren en ontwikkelen van de methode. De beide loopvloeistoffen voor het bepalen vanmycotoxines in brei moet bestaan uit een oplossing van H2O/ACN/MeOH. De exacteconcentratie moet nog bepaald worden.De eerste oplossing, ook wel oplossing A genoemd, bestond uit 90% H2O /5% ACN /5%MeOH.De tweede oplossing, ook wel oplossing B genoemd, bestond uit 45% H2O /50% ACN /5%MeOH.Met deze loopvloeistoffen zijn we gaan meten, maar het bleek dat er geen optimale piekvormte zien was, tevens kwam de hoofdpiek er pas na 24 minuten eruit. Na diverse metingengedaan te hebben zijn we tot de juiste verhoudingen gekomen voor zowel oplossing A alsoplossing B.  Loopvloeistof A: 82,5% H2O /12,5% ACN / 5% MeOH  Loopvloeistof B: 15% H2O / 80% ACN / 5% MeOHVan beide loopvloeistoffen is er 2 liter aangemaakt. Tijdens het gehele onderzoek wordt ergebruik gemaakt van de bovenstaande samenstelling van de loopvloeistoffen. Loopvloeistof Awordt ook vaak in dit verslag oplossing A. Wanneer de vloeistoffen op zijn wordt er uiteraardnieuwe aangemaakt. 8
  9. 9. Proeve van bekwaamheid Instellingen HPLCOm mycotoxines te kunnen meten door middel van de HPLC zijn er een aantal instellingennodig. Hiervoor is er een stapgradiënt gemaakt die past bij het meten van mytoxines in demonsters. Een stapgradiënt is een methode waardoor je de samenstelling van deloopvloeistoffen veranderd, en daarmee kan je de te bepalen stoffen beter terug vinden, maarook kan je hiermee de kolom schoonspoelen voor de volgende meting. De stapgradiënt die wegebruikt hebben voor het opschonen van de kolom staat in figuur 1 van de resultaten. Ditwaren de belangrijkste instellingen en benodigd heden om een goede HPLC analyse uit tekunnen voeren voor het bepalen van mycotoxines in breimonsters van suikerbieten. Monster voorbereidingVoordat een breimonster geanalyseerd kan worden moet deze eerst voorbereid worden,hiervoor moet het volgende gebeuren. Je weegt op een analytische balans in een buis van200ml een breitablet af van 15-20gram. Hierna wordt rand schoon gemaakt waar de dopuiteindelijk op de buis wordt geschroefd. Het gewicht van de breitablet schrijf je op en ookhet nummer van de betreffende zak waar de brei uitgehaald is. Er kan nu 150ml loopvloeistof A toegevoegd worden. Nadat de dop stevig is vastgedraaid op de buis, kan deze in de extraheer machine, zie afbeelding 1,voor ongeveer 2uur door middel van rotatie. Vervolgens wordt de buis uit de extraheermachine gehaald en in een daarvoor bestemde rek geplaatst, zodat de extractie buis met daarin het mengsel van brei en de extractie vloeistof 30 minuten de tijd krijgt om uit te zakken. Afbeelding 1: de extractie machine 9
  10. 10. Proeve van bekwaamheid De analyse IJklijnOm je monsters te kunnen gaan meten is het nodig om een ijklijn te maken. Via deze ijklijnkan je dan laten berekenen wat de [DON] en [15-A-DON] van de geanalyseerde breimonstersis. Dit is als volgt gedaan. Eerst is er een stockoplossing gemaakt van 4,40mg DON en4,20mg 15-A-DON op te lossen in 10 ml ACN. De [DON] 440µg/ml en [15-A-DON] is dan420µg/ml. Vanuit deze stockoplossing is de spikeoplossing gemaakt. De spikeoplossing isgemaakt door 2ml van de stockoplossing te pipetteren in een maatkolf van 50ml en aan tevullen met ACN. Je krijgt dan een [DON] van 17,6µg/ml. Deze concentratie is despikeoplossing, hiermee worden de standaarden gemaakt voor de ijklijn.De standaarden die gemaakt zijn voor het maken van de ijklijn staan vermeldt in figuur 2 vanhet kopje resultaten. De bijbehorende ijklijnen voor DON en 15-A-DON staan onder hetkopje bijlage vermeldbijlage 1 en bijlage 2. In bijlage 3, is een deel van een spectra te zienvan een standaard.Nadat deze ijklijnen gemaakt waren voor zowel DON als 15-A-DON was het tijd om tebeginnen met de recovery van de spikeoplossing. Het blijkt dan wanneer je wilt gaan werkenmet de spikeoplossing, die gemaakt is van de standaardoplossing en vervolgens aangevuld ismet ACN dat je de ACN moet indampen om een betere piekvorming te krijgen, dit is te zienin bijlage 4 en 4. Op 5 is goed te zien dat de piek vorm asymmetrisch van vorm is.Als je de spikeoplossing indampt door middel van de vacuüm rotatie verdamper, hiermee laatje de ACN verdampen en houd je alleen de DON en 15-A-DON over, en er vervolgensoplossing A toevoegt krijg je een goede symmetrische piek vorm. De opzuiverings kolommen De DONprep kolomOm een goede recovery uit te kunnen voeren is de verdunde spikeoplossing eerst rechtstreeksgemeten en vervolgens is er van de verdunde spikeoplossing 2ml door de kolom gedaan om tevergelijken wat het resultaat is.De verdunde spikeoplossing is als volgt verkregen. Er is 5ml spikeoplossing ingedampt in eenkolf van 50ml op de vacuümrotatie verdamper, vervolgens is er 25ml oplossing A toegevoerd. 17,6µg/mlDe spike oplossing is dan 5x verdund = 3,52µg/ml . Vervolgens is er 2 ml van deze 5verdunning is rechtstreeks gemeten, hiermee wordtbedoeld dat de verdunde oplossing niet door deDONprep kolom is gegaan. In afbeelding 2 in deDONprep kolom weergegeven. Afbeelding 2: DONprep kolomOok is er 2ml wel door de kolom gegaan, de procedure hiervan is te lezen in bijlage 6. Deresultaten van deze recovery staan in figuur 3 bij de resultaten. De waarden zijn gegeven inarea`s, want er was op het moment van meten nog geen ijklijn gemaakt. Deze is naderhanderbij gekomen toen er monsters gemeten werden. 10
  11. 11. Proeve van bekwaamheidUit de metingen is gebleken dat de opbrengst door gebruik te maken van de kolommen slechts24% en respectievelijk 33% bedraagt. De vraag was nu, waar is de rest van de DON en 15-A-DON gebleven. Om dit uit te zoeken is er de volgende recovery gedaan.Hierna zijn er 3 breimonsters gemeten om te kijken of er de te analyseren mycotoxines DONen 15-DON aanwezig zijn in het monster. De monsters zijn voorbereid op de wijze vanmonstervoorbereiding op bladzijde 8 van dit verslag.Nadat de brei 30 minuten tot rust is gekomen is de bovenstaande vloeistof voorzichtigafgeschonken in een filtreerspuit met hierop een dubbele filter het filtraat wordt opgevangenin een aparte kolf. Het eerste monster is als enige door de kolom gegaan, de overige 2 zijnrechtstreeks gemeten zie de onderstaande tabel. Breimonsters met of zonder DON en 15A DON? extractie ID nr. inweeg (g) vloeistof (ml) kolom (ml) opl.A (ml) Brei A 32904 15,76 150 2 2 Brei B 32911 18,52 150 - - Brei C 32902 17,43 150 - - Figuur 4Uit het onderzoek bleek dat in geen van de monsters mycotoxines aangetoond kondenworden. Deze meting is nogmaals herhaald. De monsters voor dit onderzoek zijn volgensdezelfde richtlijnen voorbereid die beschreven staan op bladzijde 8, alleen is het is plaats van150ml loopvloeistof A te nemen is er 140ml loopvloeistof A genomen en 10ml van despikeoplossing (17,6µg/ml). Tevens is er ook een controle standaard meegenomen, in figuur 5en 5a van de resultaten is te zien wat het resultaat is van dit stukje recovery. Deze monsterszijn door de DONprep kolom gegaan.Om uit te zoeken waarom er zo weinig van beide DON soorten overblijft nadat deze door dekolom zijn gegaan is er een nieuw onderzoek uitgevoerd. We hebben na bepaalde stappen diein het proces staan voor het opzuiveren van het monster, wanneer deze door de kolom hetresidu dat overblijft wordt een aantal elke keer in een aparte kolf op gevangen. Om dezedaarna te laten analyseren op de HPLC.Uit de recovery is gebleken dat het gebruiken van de DONprep kolom niet veel betereresultaten heeft opgeleverd. Een extra onderzoek is uitgevoerd om te onderzoeken wat deoorzaak hiervan kan zijn.Allereerst gaan we een nieuw standaard aanmaken door middel van 5ml spike oplossing in tedampen en vervolgens aan te vullen met een pipet van 25ml met MilliQ H2O. We hebbendeze verdunning eerst rechtstreeks gemeten, en vervolgens is deze door de kolom gegaan.Iedere keer dat de kolom gespoeld moest worden is het residu opgevangen in een aparte kolf.De eerste opvang was het residu dat overbleef nadat de Combistandaard door de kolom wasgegaan, de tweede opvang is na het spoelen van de kolom met H2O. Dit is tevens de laatste,want toen kon er een conclusie getrokken worden waarom er zoveel DON en 15-A-DON erweggespoeld is. Onder het hoofdstuk resultaten en dan figuur 6 is het resultaat van deze proefte vinden. 11
  12. 12. Proeve van bekwaamheidHet bleek na deze meting dat de DON niet aan de eiwitten in de kolom bleven hechten,hierdoor wordt de DON die eigenlijk op de pakking van de kolom moet blijven zitten al aanhet begin door de kolom gespoeld wordt.Daarom is er nogmaals een test gedaan, maar dan hebben we PEG (polyethyleenglycol)toegevoegd aan 5ml verdunde spike oplossing. Eerst hebben we rechtstreeks gemeten, envervolgens hebben we 2ml van dezelfde oplossing gemeten, maar nadat deze door deDONprep kolom is gegaan. Onder het hoofdstuk resultaten en dan in figuur 7 staan deresultaten vermeldt van dit stukje van de recovery.Uit de resultaten van deze metingen bleek dat er tijdens de eerste opvang vrij veel DON isblijven hangen aan de eiwitten in de kolom. Dit zie je ook aan de gevonden concentratie vande opgevangen vloeistof na de eerste opvang. Er is 48% door gelaten door de DONprepkolom, dan is er door de DONprep kolom 52% vastgehouden.Wederom een recovery onderzoek uitgevoerd, ditmaal naar het effect van PEG in monsters.Daarvoor is eerst een oplossing van 13g/L in 500ml MilliQ H2O. Dit komt neer op 6,5g per500ml. Ik heb hiervoor 6,499g afgewogen op een analytische balans en vervolgenskwantitatief overgebracht in een maatkolf van 500ml.Ook zijn er breimonsters voorbereid om gemeten te kunnen worden. Dit waren respectievelijkbreimonster TP3 en breimonster TP4. In deze brei mengmonsters is door een externlaboratorium (TLA) DON aangetoond. Van beide monsters is een bepaalde hoeveelheidafgewogen tussen de 15-20 gram, waarna aan deze monsters 150ml PEG/MilliQ mengsel istoegevoegd. Breimonster inweeg (g) TP3 22,79 TP4 20,848De beide breimonsters zijn daarna 2 uur lang geëxtraheerd en daarna hebben de monsters 30minuten lang laten uitzakken. Dit gevolgd door een dubbele filtratie. Hierbij is er ongeveer10ml filtraat verkregen van beide breimonsters.Van beide filtraten is er steeds 1 deel rechtstreeks gemeten en de overige vloeistof is door dekolom gegaan en naar de 1ste opvang, na de 2de opvang, en na de 3de opvang gemeten. Deresultaten staan vermeld in figuur 8 en figuur 8a van de resultaten. Het spectra van derechtstreekse meting en het spectra van na de kolom staat in bijlage 7 vermeld en de spectravan TP4 rechtstreeks en na kolom staat in bijlage 8.Om de [DON] in ppb te bereken maak je gebruik van de onderstaande formule.  [ DON ] × 150    inweeg   [ DON ]( ppb) =   × 10 3 concentratie stapNog steeds komt er minder DON van de kolom dan dat er ingegaan is. De BPV-begeleiderPeter Gijssel heeft toen contact opgenomen met de firma Biofarm met de vraag hoe dit komt.De fabrikant van de kolommen had een mail gestuurd met de mededeling dat de DONprepmaximaal 2µg/ml wordt vastgehouden door de eiwitten die zich in de kolom bevinden.Vandaar dat er na de 3de zuiveringsstap zo weinig DON wordt teruggevonden, want deeiwitten in de kolom waren verzadigd met DON. Hierdoor werd de overige DON dieaanwezig was in de recovery standaard weggespoeld, deze vond je daarom terug in 1ste 12
  13. 13. Proeve van bekwaamheidopvang. Wat er dus in de 1ste opvang terug gevonden werd was de rest van de DON die niet opde eiwitten konden blijven plakken, omdat deze verzadigd waren.Om die reden te bevestigen is er vandaag een recovery onderzoek uitgevoerd om te kijken ofdit de reden is waardoor er zo`n lage [DON] terug vinden. Het onderzoek is als volgtuitgevoerd:  Allereerst de spikeoplossing (17,6µg/ml) 25x verdund. Dit is gedaan door middel van 2ml van de spikeoplossing te pipetteren in een kolf en vervolgens in te dampen met de vacuümrotatie verdamper, waarna de kolf is aangevuld met 50ml MilliQ H2O. Deze oplossing heeft dan een concentratie van [DON]=0,704µg/ml  Uit de verdunde oplossing is een vial gevuld voor een rechtstreekse meting.  Ook is er 2ml van de oplossing gepipetteerd en door een DONprep kolom gespoeld. Ook van deze methode hebben we 3 vials gevuld en wel de volgende: de 1ste opvang, de 2e opvang en de opvang na de kolom  Deze zijn vervolgens geanalyseerd met de HPLC  Ook is er een monster gemeten, dit was monster TP4, deze is afgewogen op een balans (17,247) en vervolgens opgelost in 30ml verdunde spikeoplossing van 0,704µg/ml, en 120ml MilliQ H2O. Twee uur geëxtraheerd, gevolgd door een dubbele filtratie waarbij minimaal 10ml is verkregen. Ook hiervan zijn weer 4 vials gemeten. De eerste vial is rechtstreeks gemeten, dit is dus het gefiltreerde monster. De overige 3 vials zijn weer van de 1ste opvang, de 2de opvang en opvang na de kolom.De resultaten van deze recovery staan in het hoofdstuk resultaten in figuur 9. Hieruit is dusgebleken dat het inderdaad zo is dat een DONprep kolom een maximum capaciteit van DONheeft. Ook is het duidelijk geworden dat deze kolom alleen geschikt is voor het bepalen vanDON en niet geschikt voor 15-A-DON, want de eiwitten in deze kolom zorgen er alleen voordat ze binden met DON. 15-A-DON wordt er gewoon doorheen gespoeld. Je kunt bij dezekolom alleen maar 1 soort mycotoxine aantonen, en het kost geld om voor iedere soortmycotoxine een andere kolom aan te schaffen. De Varian kolom De tweede kolom die gebruikt is voor het onderzoek komt van Varian en heeft hebben de naam Bond Elute® Mycotoxin. Met deze kolommen gaan zijn er een aantal recoverys uitgevoerd, het zijn dezelfde als bij de voorgaande DONprep kolommen. In afbeelding 3 is de Varian kolom te zien.Afbeelding 3: De Varian kolomAllereerst is de theorie bestudeerd van de kolommen die door Varian geleverd zijn. Het is nietnodig om de kolom te spoelen met H2O of MeOH. Dit komt omdat deze kolom een andereeigenschap heeft. De kolom zorgt ervoor dat het monster dat je wilt gaan meten wordtgezuiverd van verontreinigingen, maar deze kolom laat ook meer soorten mycotoxines door.Het is dus alleen een kolom die de onzuiverheden weghaalt. Allereerst valt op dat er eenandere voorbewerking van de monsters gedaan moet worden. Er moet tussen de 15-20gram 13
  14. 14. Proeve van bekwaamheidmonster ingewogen worden, deze vervolgens 1,5 a 2 uur geëxtraheerd door middel van 100mlACN/H2O oplossing. In de verhouding van (80/20). Daarna filtreer je minimaal 10ml van debovenstaande vloeistof. Vervolgens pipetteer je 4ml van dit filtraat door de Bond ElutMycotoxin kolom. Hierna wordt er 2ml gepipetteerd van het verkregen extract en verdampt.Wanneer dit gebeurd is wordt er 0,5ml van oplossing ACN/H2O (20/80) toegevoegd.Vervolgens kun je dit injecteren. Dit was echter voor het bepalen van mycotoxines doormiddel van de HPLC/MS.Er is een aanpassing gedaan om deze kolom toch te gebruiken in plaats van 0,5ml oplossingACN/H2O met een verhouding van 20/80 te gebruiken is er gebruik gemaakt van 2mloplossing A, zodat dit overeenkomt met de loopvloeistoffen die er gebruikt worden. Het zijndezelfde als voor de Biofarm kolom.Omdat deze kolom zowel DON als 15-A-DON doorlaatis er een combistandaard gemaakt, deze bevat [DON]=17,6µg/ml en voor [15-A-DON]= 16,8µg/ml. Hiermeeworden de recovery voor deze kolom uitgevoerd. DeDON en 15-A-DON zijn oplost in 100% acetonitrile.De oplossing is te geconcentreerd om te gebruiken voorhet onderzoek, daarom is deze oplossing 10x verdunddoor 10ml te pipetteren in een rondbodem kolf envervolgens in te dampen door middel van devacuümrotatie verdamper, in afbeelding 4 is eenvacuümrotatie verdamper te zien, hierna is er een aantalmilliliter oplossing A (ACN/H2O/MeOH) toegevoegden even in het trilbad gehouden, zodat de ingedampteDON en 15-A-DON opgelostten. Dit is vervolgenskwantitatief overgebracht in een maatkolf van 100ml engevuld met oplossing A.. Afbeelding 4: De vacuümrotatie verdamper 17,6µg / mlDe [DON] zou dan moeten zijn: [ DON ] = = 1,76µg / ml . En voor 15-A-DON zou 10 16,8µg / mldit dan moeten zijn [15 − A − DON ] = = 1,68µg / ml . Om dit te controleren is er 10van beide standaarden een analyse verricht deze is in duplo uitgevoerd. De resultaten staan infiguur 10 onder het hoofdstok resultaten. Beide metingen zijn in duplo uitgevoerd om zeker tezijn van de eerste waarde. Uit de resultaten is naar voren gekomen dat de verdunning goed is.Na de controle van de verdunde standaard is, zijn er recoverys uitgevoerd met de Bond Elute®Mycotoxin kolommen van Varian.De recovery is als volgt uitgevoerd. Eerst is er 4ml verdunde spikeoplossing in het spuitjegepipetteerd, dit is vervolgens gemeten. Deze resultaten staan in figuur 11 van de resultaten.Ook is er nogmaals 4ml Combistandaard ingedampt en vervolgens aangevuld met oplossingA. Ook deze is door de kolom gegaan. De resultaten zijn te vinden in figuur 11 en 11a.Na deze recovery is er gekeken of er bij 3 breimonsters waar geen DON en 15-A-DON inhoort te zitten er ook daadwerkelijk geen DON en 15-A-DON aanwezig is. Hiervoor zijn er 3breimonsters genomen en gemeten. De bijbehorende resultaten staan in figuur 13. De spectra 14
  15. 15. Proeve van bekwaamheidvan deze 3 breimonsters zijn vergeleken met zowel een combistandaard als een breimonsterwaar wel DON en 15-A-DON aanwezig zijn, deze spectra zijn te zien in de bijlage 9/10/11. Indeze 3 bijlagen stellen de groene spectra de monsters voor die geen DON en 15-A-DONzouden bevatten.Duidelijk is te zien dat deze monsters een lage [DON] bevatten, maar het is de vraag of ze ookgeen 15-A-DON bevatten. Ook in figuur 13 van de resultaten zijn zeer lage [DON] te zien diegemeten zijn door de HPLC, Er zit misschien zo weinig in dat het haast niet te meten is. Delicht blauwe lijn van is van de standaard, de 15-A-DON piek ligt op de goede plaats, bij deoverige monsters is het de vraag of er wel 15-A-DON aanwezig is of dat het monsterverontreiniging is dat in het monster zit. Dit moet nog verder uitgezocht worden door degenedie met dit onderzoek verder gaat. 15
  16. 16. Proeve van bekwaamheid Resultaten Figuur 1: De stapgradiënt voor het opschonen van de kolom Tijd (min) % opl. A % opl. B flow (ml/min) 0,0 100 0 1,0 7,0 100 0 1,0 7,1 75 25 1,0 15,0 75 25 1,0 15,1 0 100 1,5 35,0 0 100 1,5 35,1 100 0 1,0 45,0 100 0 1,0 Figuur 2: StandaardenreeksStandaard [DON] [15-A-DON] Verdunning µg/ml µg/ml 1 0,06 0,055 25ml Std 2  50ml opl. A 2 0,12 0,11 25ml Std 3  50ml opl. A 3 0,29 0,28 25ml Std 4  50ml opl. A 4 0,73 0,7 25ml Std 5  50ml opl. A 5 1,83 1,75 25ml Std 6  50ml opl. A 6 4,58 4,37 13ml spike  50ml opl. A Methode DON (area) 15-A-DON (area) Rechtstreeks 149000 125000 Rechtstreeks 2 146000 125000 Kolom 36000 0 Kolom 2 45000 0 Figuur 3: Verdunde spike oplossing rechtstreeks en door de kolom 16
  17. 17. Proeve van bekwaamheid Figuur 5: Teruggevonden DON ID [DON] µg/ml DON (area) recovery DONCtrlCombi 5,52 149000BreiA+toev. 1,17 42000 61%BreiB+toev. 1,17 47000 68% 17
  18. 18. Proeve van bekwaamheid Figuur 5a: Teruggevonden 15A-DON ID [15-A-DON] 15-A-DON recovery µg/ml (area) 15A-DON CtrlCombi 3,36 122000 - BreiA+toev. 1,12 45500 90% BreiB+toev. 1,12 50000 82% Figuur 6: Verdunde DON oplossing ID [DON] µg/ml DON rechtstreeks 3,46 DON 1ste opvang 1,82 DON 2e opvang 0,58*DON rechtstreeks is 5ml spike oplossing ingedampt, en vervolgens aangevuld met 25ml MilliQ H2O en daarna gemeten.**DON 1ste opvang is 5ml van de verdunde spike oplossing door de DONprep kolom, zonder wassen met H2O en MeOH. Figuur 7: Verdunde DON oplossing met 2 druppels PEG toegevoegd ID [DON] µg/ml DON rechtstreeks* 3,333 DON 1ste opvang** 1,61*DON rechtstreeks is 5ml spike oplossing ingedampt, en vervolgens aangevuld met 25ml MilliQ H2O en 2 druppels PEGdaarna gemeten**DON 1ste opvang is 5ml van de verdunde spike oplossing met 2 druppels PEG door de DONprep kolom, zonder wassenmet H2O en MeOH. Figuur 8: Resultaten TP3 Breimonster Inweeg TP3 [DON] µg/ml [DON] µg/kg (ppb) TP3 rechtstreeks 22,790 0,123 809,56 TP3 1ste opvang 22,790 <0,02 <150 TP3 2de opvang 22,790 <0,02 <150 TP3 na kolom 22,790 0,259 681,88 Figuur 8a: Resultaten TP4 Breimonster Inweeg TP4 [DON] µg/ml [DON] µg/kg (ppb) TP4 rechtstreeks 20,848 0,062 446,08 TP4 1ste opvang 20,848 <0,02 <150 TP4 2de opvang 20,848 <0,02 <150 TP4 na kolom 20,848 0,158 454,52 18
  19. 19. Proeve van bekwaamheid Figuur 9: Resultaten ter bevestiging Biofarm ID [DON] µg/ml TP4 rechtstreeks 0,17 1ste opvang <0,02 2de opvang <0,02 Na kolom 0,15 Figuur 10: Verdunde spikeoplossing met oplossing A: µg/ml [DON] 1,81 [DON] duplo 1,79 [15-A-DON] 1,74 [15-A-DON] duplo 1,76 Figuur 11: Verdunde spikeoplossing door kolom: µg/ml [DON] 0,61 [DON] duplo 0,62 [15-A-DON] 1,15 [15-A-DON] duplo 0,94Figuur 11a: Verdunde spike oplossing ingedampt en aangevuld met oplossing A: µg/ml [DON] 10,38 [DON] duplo 7,56 [15-A-DON] 9,75 [15-A-DON] duplo 6,71 19
  20. 20. Proeve van bekwaamheid Figuur 12: Analyse breimonster op mycotoxines Analyse [DON] µg/ml [15-A-DON] µg/ml 1. Breimonster in oplossing A 0,13 0,33 rechtstreeks 2. Breimonster in oplossing A na 0,06 0,22 de kolom 3. Breimonster in oplossing A met 0,74 1,61 verdunde standaard (1:10) rechtstreeks 4. Breimonster in oplossing A met 0,92 0,72 verdunde standaard (1:10) na de kolom Figuur 13: Analyse breimonster waar geen mycotoxines aanwezig zijn Analyse [DON] µg/ml [15-A-DON] µg/ml* Brei nummer 33558 < 0,04 ? Brei nummer 03864 < 0,04 ? Breinummer 7661 < 0,04 ?* De [15-A-DON] was niet goed te meten, want het leek in het spectra in bijlage 7/8/9verplaatst te zijn of het is helemaal niet aanwezig. Dit moet verder onderzocht worden. 20
  21. 21. Proeve van bekwaamheid Conclusie en DiscussieDe opdracht was naar mijn idee in het begin leek heel eenvoudig te zijn. Een methodeontwikkelen voor het bepalen van mycotoxines in suikerbieten brei. Dit bleek toch een stukmoeilijker dan ik had gedacht. Gelukkig had ik goede steun aan Peter Gijssel mijnstagebegeleider hier binnen IRS. Hij wist heel veel af van mycotoxines. Ik ben samen methem begonnen aan het onderzoek. Er was al een voorschrift dit is gebruikt om te dienen alsvoorbeeld en als richtlijn.Er staat onder andere de voorbewerking in van de breimonsters. Dit is onveranderd gebleventijdens deze methodeontwikkeling. Wel moesten er veel dingen worden veranderd enuitgezocht worden wat de beste instellingen waren voor het analyseren van mycotoxines. Hetoptimale punt is nog niet bereikt in deze proef, maar er zijn wel een aantal standaard gegevensnodig om te kunnen beginnen.De loopvloeistoffen die nodig waren voor het bepalen van de mycotoxines bijvoorbeeld. Erstond in het voorschrift een mobiele fase oplossing bestaande uit H2O en ACN in deverhouding 60/40, dit is aangepast naar de huidige loopvloeistoffen/oplossingen.  Loopvloeistof A (oplossing A): H2O/ ACN/ MeOH (82,5% / 12,5% / 5%)  Loopvloeistof B: H2O/ ACN/ MeOH (15% / 80% / 5%)Ook is er een aparte stapgradiënt gemaakt om te zorgen dat de kolom van de HPLC mooischoon is. De stapgradiënt die hierbij hoort staat in figuur 2 van de resultaten.Het volgende probleem was of er voorbereiding nodig is om mycotoxines te bepalen in brei.Het antwoord hierop is ja, want wanneer de brei geëxtraheerd is moet het eerst gefilterdworden alvorens je de vloeistof in een vial doet om te laten analyseren. Zondervoorbewerking van het monster kan er niet kwantitatief geanalyseerd worden. Door gebruik temaken van een zuiverings kolom kan je ervoor zorgen dat de analyse nog nauwkeuriger is,vooral wanneer je de zuiverings kolom van Varian gebruikt. Deze haalt de onzuiverheden uithet mengsel waardoor er een zuiverder extract ontstaat. Tevens is deze kolom geschikt ommeerdere soorten mytoxines op te zuiveren. Nog een voordeel van deze kolom is dat er geenmaximale concentratie is, maar ook de prijs van een Varian kolom is een stuk lager dan deprijs van een DONprep kolom.De DONprep kolom daarin tegen is meer een kolom die ervoor zorgt dat het filtraat zuiverderwordt, een nadeel van deze kolom dat deze kolom een maximale [DON] heeft van 2µg/ml,maar ook dat deze kolommen specifiek zijn voor DON. Je kan hiermee dus geen anderemycotoxines meten. Verder onderzoek naar een methode voor het goed bepalen vanmycotoxines is noodzakelijk. 21
  22. 22. Proeve van bekwaamheid Bijlage Bijlage 1; De ijklijn van DON y=3,88x2+2,32x-0,00 r2=0,999988Bijlage 2; De ijklijn van 15-A-DON Y=-1,52x2+2,71x-0,00 r2=0,9999886 22
  23. 23. Proeve van bekwaamheidBijlage 3: spectra van een standaard 23
  24. 24. Proeve van bekwaamheidBijlage 4; Spikeoplossing in ACN Bijlage 5; Spikeoplossing ingedampt en oplossing A 24
  25. 25. Proeve van bekwaamheid Bijlage 6; Procedure om de DONprep kolom te gebruiken 1 2 3 4 51. De DONprep kolom met vloeistof om de enzymen goed te houden2. De aanwezige vloeistof dat dient ter bescherming van de enzymen door de kolom spoelen en in een spoelkolf opvangen.3. Voeg 2ml monsterextract toe aan de kolom, en vang dit op in een spoelkolf4. Was de kolom met demiH2O en blaas deze goed droog, vang wederom de vloeistof op in de spoelkolf5. Was de kolom met 2ml MeOH, en van dit op in een rondbodem kolf om dit te gebruiken voor de vacuümrotatie verdamper. Bijlage 7: Brei monsters TP3 spectra rechtstreeks en na de kolom 25
  26. 26. Proeve van bekwaamheid Bijlage 8: Brei monsters TP4 spectra rechtstreeks en na de kolomBijlage 9: Brei 33558 vergeleken met een standaard en monster dat wel DON en 15-ADON bevat 26
  27. 27. Proeve van bekwaamheidBijlage 10: Brei 03864 vergeleken met een standaard en monster dat wel DON en 15-ADON bevatBijlage 11: Brei 7661 vergeleken met een standaard en monster dat wel DON en 15-ADON bevat 27
  28. 28. Proeve van bekwaamheid Samenvatting Nederlands:Op 26 februari 2008 ben ik begonnen met de methode ontwikkeling voor het aantonen vanmycotoxines. De opdracht was om te kijken of er een betere, goedkopere en snellere methodete ontwikkelen, want de huidige methode die beschreven staat in het voorschrift voor hetgebruik van de DONprep kolom heeft een vrij lange voorbewerking nodig om tot eenresultaat te komen.In de afgelopen weken en maanden heb ik onderzoek gedaan naar de mogelijkheid om eenmethode te ontwikkelen voor het bepalen van mycotoxinen.De eerste weken van het onderzoek gingen wat stroef, maar hoe langer we er aan bezig warendes te interessanter het werd. Tijdens de methodeontwikkeling zijn er 2 kolommen getest, eenvan Biopharm en een van Varian.Op beide kolommen zijn er diverse bepalingen uitgevoerd, om te bepalen wat eventueel debeste kolom is voor het bepalen van mycotoxines in suikerbieten brei. Na het doen van velebepalingen met zowel de kolommen van Varian als die van Biofarm is het vrij duidelijkgeworden dat de kolom van Varian het meest geschikt was. Dit komt doordat de monstersweinig voorbewerkt hoeven te worden voordat ze door de kolom gaan, dit scheelt tijd. Eentweede reden om te deze kolom te gebruiken voor het bepalen van mycotoxines is dat dezekolom niet specifiek is voor 1 soort myxotoxine.Voordat je de kolom van Biofarm kan gebruiken moet het monster wel eerst allerlei stappenondergaan en dit kost tijd, daarbij komt dat deze kolom alleen maar specifiek voordeoxynevalon.Dus tot dusver kan er geconcludeerd worden dat uit de resultaten is gebleken dat het nodig isom de monsters voor te bewerken en op te zuiveren door middel van een zuiveringskolom, hetliefst door een kolom die geen specifieke binding aangaat. Uiteraard moet dit onderzoekverder worden voortgezet om een nieuwe methode te ontwikkelen. 28
  29. 29. Proeve van bekwaamheid Engels:On the 26th February 2008 I started with the project of developing a method fordemonstrating the presence of mycotoxines. The assignment was to look if there is a better,cheaper and faster way to determine mycotoxines, because the current method that is wrote inthe prescription for the use of the DONprep column has a quite long treatment needed to getsome results.In the past weeks and months I have researched the possibility of developing a method fordemonstrating the presence of mycotoxines.The first weeks of the investigation were difficult, but how longer I was working on it howinteresting it became. During the development of de method there were 2 columns tested. Onefrom Biopharm and one from Varian.On both columns were done several experiments, to determine what eventually be the mostsuitable column is for measuring mycotoxines in pulp from sugar beets. After doing manytests with the column of Varian as well as the column of Biopharm it was clear which was thebest to use when you’re going to measure mycotoxines.The best option is then to take the column of Varian, called Bond Elute® Mycotoxin, becausethis column can’t measure only deoxynivalenol and 15-acetyl-deoxynivalenol, but also othermycotoxines. This is based on several tests during this development of this method. Otherreason to use is that the sample doesn’t have to go as much preparation.Therefore we can make a conclusion out of the results we have made. It’s needed that youpre-treatment on the samples that you’re going to measure and clean up the samples by meansof using the purification column. Rather using a column that hasn’t has a specific bond withone type of mycotoxines. This research must be continued further on off course, so that therecan be make a whole new and better way to determine several mycotoxines. 29
  30. 30. Proeve van bekwaamheid Literatuurbronnen: Boeken:Titel: The mycotoxin factbook, food and feed topicsUitgever: Wageningen Academic PublishersPlaats en jaar uitgave: Nederland 2006 Internet: 1. http://www.gr.nl/pdf.php?ID=189 2. http://www.r-biopharm.com/product_site.php? language=english&product_id=141&PHPSESSID=3360f64cc7c096e6eb5613557f7c4 3ca 3. http://www.pdv.nl/lmbinaries/pdf1363_pdf_nl_nl.pdf 30

×