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Plantas haploides a partir de anteras y granos de polen

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Se estudió la obtención de brotes mediante la organogénesis directa a partir de Saintpaulia ionantha, utilizando explantes de hoja, cultivados en medio Murashige y Skoog, suplementado con AIA y KIN.
El ensayo fue realizado en dos ocasiones debido a la presencia de un hongo endógeno en planta usada en el primer ensayo, lo cual condujo a una contaminación total de los explantes sembrados, por tal motivo el segundo ensayo registra el uso de Bagsin-Captan, fungicidas sistémico y de contacto respectivamente, para prevenir la invasión fúngica.

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Plantas haploides a partir de anteras y granos de polen

  1. 1. Obtención de plantas haploides mediante el cultivo in vitro de anteras y granos de polen de cucarda (Hibiscus rosasinensis). Ayala Paola, Chasiquiza Alexandra Carrera de Ingeniería en Biotecnología, Cultivo de Tejidos Vegetales Departamento de Ciencias de la Vida, Universidad de las Fuerzas Armadas-ESPE Sangolquí - Ecuador. Noviembre, 2013 RESUMEN El cultivo de anteras meristemoses utilizado generalmente para la obtención de plantas haploides, las cuales se regeneran mediante embriogénesis somática o por organogénesis a partir de callo. La flor de cucarda (Hibiscus rosa sinensis), presenta numerosos estambres. Se usó como medio de cultivo MS, enriquecido con 0,8mg/L de tiamina, 0,2mg/L de KIN, 2mg/L de AIA, 20m/L de azúcar y 7,5g/L de agar con pH ajustado a 5,7-5,8. Los resultados fueron exitosos,no existió contaminaciónni explantes necrosados. Palabras clave:Propagación, polen, microesporas, óvulos y cultivo in vitro. ABSTRACT Anthers meristem culture is generally used to obtain haploid plants which are regenerated via somatic embryogenesis or organogenesis from callus. Cockade flower (Hibiscus rosasinensis), has numerous stamens. Was used as a MS medium, enriched with 0.8 mg / L thiamine, 0.2 mg / l KIN, 2mg / L IAA, 20m / L of sugar and 7.5 g / L of agar, pH adjusted to 5 ,7-5, 8. The results were successful; there was no contamination or necrotic explants. Key words: Propagation, pollen, microspores, ovules and in vitro culture. INTRODUCCIÓN Hibiscua rosa sinensis es una planta ornamental común con muchas variedades. Arbustos generalmente menores de 8 pies de altura en el cultivo, pero pueden ser de 15piesen las zonas tropicales. Hojas de forma ovoides y color verde brillante. Flores en ejes superiores de las hojas, solitarias, con pétalos de 2-5 pulgadas de largo y de color rojo brillante, o, a veces rosa, púrpura, naranja, amarillo o blanco. Los cultivares pueden ser individuales, dobles y de color rojo, amarillo, blanco o naranja. El fruto es una cápsula de 5 células cada una con 3 semillas. Crece principalmente en las zonas tropicales y se cultivaba originalmente en Asia(Dvorkin PharmD & Whelan MS, 2012) El cultivo de tejidos vegetales, permite la obtención de altas tasas de multiplicación a partir de un explante inicial, gracias a la totipotencia de las células vegetales. El explante puede ser tomado de, tallo, raíz, hoja, meristemos, embriones, etc.; o de tejidos no somáticos como: anteras,
  2. 2. polen, microesporas, etc.(Narváes, 2009). óvulos, El cultivo in vitro de anteras con polen inmaduro, permite que el polen se divida para formar embriones o callo. Por lo general el cultivo de anteras se utiliza para la obtención de plantas haploides, las cuales se regeneran a través de la embriogénesis somática a partir del polen, directamente o por la vía de organogénesis a partir de un callo (Abdelnour A., 1994). El objetivo de esta práctica es evaluar la viabilidad y obtener formación de callo a partir de anteras de cucarda (Hibiscus rosa sinensis). MATERIALES Y METODOS Se recolectóplantas de cucarda y se realizó lavados con agua corriente para remover impurezas yse preparó 500ml de una solución de detergente al 2% más tres gotas de tween20, se sumergió las flores de cucarda en la solución poniéndolas en agitación durante 20minutos. Posterior a este tiempo se lavó los explantes, 2 veces con agua destilada y una vez con agua estéril. Se eliminó el agua y se prosiguió a sumergir las muestras en 500ml de una solución de cloro al 2% más 3 gotas de Tween durante 10 minutos en agitación. Terminado del lavado con cloro, se trasladó los explantes a la cámara de siembra previamente esterilizada de acuerdo a procedimiento descrito en prácticas anteriores y se realizó 2 lavados con agua estéril. Finalizado los lavados, se realizó cortes a las capsulas de cucarda desde su base de tal manera que los filamentos de las anteras quedaron libres. Se colocó las anteras en un frasco de medio de cultivo. Se utilizó medio remanente de la práctica de violeta, MS enriquecido con enriquecido con 0,8mg/L de tiamina, 0,2mg/L de KIN, 2mg/L de AIA, 20m/L de azúcar y 7,5g/L de agar con pH ajustado a 5,7-5,8. Se incubó a temperatura ambiente y después de 7 días de la siembra se evaluó, presencia de callo y contaminación por hongos o bacterias. Se establecieron 3 escalas para la evaluación de los resultados como se indica en la Tabla 1,2. Tabla 1.- Leyenda de valores de contaminación. Contaminación por hongo y bacteria 0 No existe contaminación 1 Poca contaminación 2 Contaminación masiva Tabla 2.-Leyenda de valores de necrosis. Necrosis No necrosis Necrosis media Necrosis alta 0 1 2 RESULTADOS Como se observó en las Fotografía 1 y 2 no existe contaminación en ninguno de los frascos: 1P 2P Fotografía 1.- Frascos con polen de cucarda de Paola Ayala. 1A 1B Fotografía 2.- Frascos con polen de cucarda de Alexandra Ch.
  3. 3. Para evaluar el desarrollo de anteras en cultivo in vitro se tomaron los siguientes parámetros: porcentaje de contaminación, viabilidad, oxidación, necrosis y formación de callo. Frasco Contaminación (%) 1P 2P 1A 2A 0 0 0 0 Tabla 3.- Porcentaje de contaminación entre los diferentes explantes de cucarda. Frasco Oxidación (%) 1P 2P 1A 2A 0 0 0 0 Tabla 4 Porcentaje de Oxidación entre los diferentes explantes de polen de cucarda. DISCUSIÓN La obtención de brotes a partir de polen y anteras, es viable gracias al bajo nivel de contaminación y la respuesta de los explantes y la baja contaminación se debió al buen proceso de desinfección y al cuidado que se tuvo en el momento de la siembra. Debido a las limitaciones de esta técnica se puede considerar su uso solo en determinados cultivos en los cuales se dependen del genotipo de la planta, es decir solo ciertas plantas van a estar predeterminadas a generar líneas homocigotas como el arroz, la cebada, el trigo, papa y maíz entre otras (Lentini et al, 1997). Los resultados posibles que se pueden obtener del cultivo in vitro de anteras, es la formación de callo u organogénesis, en la primera las microesporas que se encuentran dentro de las anteras inmaduras inducen la formación de callo, mientras en la segunda se generan embriones (Núñez, V, 1984). Los mejores resultados al obtener callo se obtienen con anteras completas, para generar una abertura por la cual los granos de polen tengan un contacto más directo con el medio enriquecido (Lentini et al, 1997). Se debe controlar de mejor manera la etapa fisiológica de la planta para generar androgénesis ayudara a tener mejores resultados en la obtención de callos y regeneración de pantas. En estudios realizados sobre Solanum lycpersicon, se encontró que la mayor producción de callo ocurre cuando el meiocito está entre metafase I y telofase II (Roca et al ,1993). CONCLUSIONES: Posterior a la primera semana de los explantes no presentaron oxidación o necrosis, lo que nos indica buena adaptación al medio. La técnica fue exitosa debido a la ausencia de necrosis o contaminación, pero esta técnica es limitada y se la puede considerar eficiente solo en determinados cultivos que son económicamente importantes. En este estudio se evaluó la viabilidad de las anteras y el desarrollo de callo en anteras de cucarda, con resultados satisfactorios en la viabilidad de anteras, existió por lo menos un crecimiento mínimo de cada uno de los explantes, pero no se generó callo, nuestra respuesta en la mayoría de explantes solo fue el desarrollo de la antera.
  4. 4. BIBLIOGRAFÍA Abdelnour A., E. J. (1994). Conceptos básicos del Cultivo de Tejidos Vegetales. UCA-CATIE. RECOMENDACIONES Se necesita mejorar el tiempo de respuesta, mediante condiciones de cultivo (luz, temperatura, humedad) o cambiando concentraciones de fitorreguladores en el medio. El desarrollo que tengan las anteras es fundamental para un crecimiento rápido de los brotes, por lo que es necesario buscar botones florales a punto de abrirse, para asegurar el estado de madurez de los explantes. El cultivo meristemos es una técnica útil en la obtención de plantas libres de contaminantes, y que además, permite el desarrollo directo de brote, sin formación de callo u organogénesis asegurando que la inestabilidad genética y la variación somaclonal se reducen al mínimo. Dublin, P. (1987). Multiplication végétative, "in vitro" de l. Arabusta. Café Cacao; Techniques de reproduction végétative "in vitro" et amélioration génetique chez les caféirs cultivés.; Techniques de reproduction végétative "in vitro" et amélioration génétique chez les ca. Paris: IFCC. Dvorkin PharmD, L., & Whelan MS, J. (2012). Bostono University School of Medicine. Recuperado el 2013, de Hibiscus Rosa Sienensis: http://www.bu.edu/bhlp/Clinical/crosscultural/herbal_index/herbs/Hibiscus% 20Rosa%20Sinensis.html López, C., & Cazola, J. (2006). Saneamiento del material vegetal: Cultivo de Meristemos. Recuperado el 2 de 11 de 2013, de http://www.encuentros.uma.es/encuen tros41/meristemos.html Narváes, S. (2009). Regeneración de brotes a partir de hojas provenientes de plantas in vitro de rosa, variedad akito. Sangolquí, Ecuador: Tesis de Grado. Rafael, M. (1987). Regeneración "in vitro" de explantes caulinares del cafeto (Cofiea arabica cv. 'Catimor'). Caracas, Venezuela: Escuela de Biología, Facultad de Ciencias, Universidad Central de Venezuela. Roca, W., & Beltrán, J. (1984). Cultivo de Meristemos para la Conservación de Germoplasma de yuca in vitro. Cali, Colombia: CIAT.
  5. 5. CUESTIONARIO Calcular la proporción de los granos de polen en cada antera que se desarrolló en las plántulas. La cantidad y viabilidad de granos de polen se pueden conocer por la metodología de hematocitómetro. La técnica consiste en la observación de los granos de polen bajo el esteromicroscopio, coloreando los granos viables con azul de anilina en lactofenol al 1% que es llevado a la cámara de hematocitómetro con una pipeta de Pasteur y se calcula según la siguiente fórmula. ¿Cómo puede usted determinar si las plantas son haploides o diploides? En las plantas, las dos fases nucleares reciben nombres diferentes: las formas haploides, desarrolladas a partir de los gametos, se denominan gametofitos, mientras que las formas diploides se denominan esporofitos. Las plantas haploides contienen la mitad del material genético necesario, para poder dar origen a una nueva planta, es decir este será incapaz de reproducirse, convirtiéndose en un híbrido. Por lo cual se las puede identificar, al no ser viables reproductivamente se las considera plantas haploides.

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