Desinfección y callogénesis de zanahoria

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El explante desarrolla el proceso de callogénesis posterior a la desinfección y siembra, como respuesta a la composición química y hormonal del medio de cultivo. El propósito de este trabajo fue desinfectar la raíz de zanahoria (Daucus Carota) y establecer callogénesis a partir de la misma aplicando procedimientos de desinfección con detergente al 1% durante quince minutos, se enjuago y posterior se sumergió en solución de cloro al 3% con tres gotas de Tween 20 durante 10 minutos. El medio utilizado para la siembra fue MS enriquecido con 3mg/L de 2,4-D y 0,5mg/L de BAP. Se evaluó la formación de callos semanalmente. Los resultados no mostraron contaminación de los cultivos.

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Desinfección y callogénesis de zanahoria

  1. 1. Desinfección y establecimiento in vitro de callogénesis a partir de raíz de zanahoria (Daucus Carota) Paola E. Ayala Canchignia Carrera de Ingeniería en Biotecnología, Cultivo de Tejidos Vegetales Departamento de Ciencias de la Vida, Universidad de las Fuerzas Armadas-ESPE Sangolquí - Ecuador. Octubre 15, 2013 RESUMEN El explante desarrolla el proceso de callogénesis posterior a la desinfección y siembra, como respuesta a la composición química y hormonal del medio de cultivo. El propósito de este trabajo fue desinfectar la raíz de zanahoria (Daucus Carota) y establecer callogénesis a partir de la misma aplicando procedimientos de desinfección con detergente al 1% durante quince minutos, se enjuago y posterior se sumergió en solución de cloro al 3% con tres gotas de Tween 20 durante 10 minutos.El medio utilizado para la siembra fue MS enriquecido con 3mg/L de 2,4-D y 0,5mg/L de BAP. Se evaluó la formación de callos semanalmente. Los resultados no mostraron contaminación de los cultivos. Palabras clave:Desinfección, callogénesis, cultivo in vitro. ABSTRACT Explant callogenesis process develops after seed disinfection and, in response to hormonal and chemical composition of the culture medium. The purpose of this study was to disinfect the root of carrot (Daucuscarota) and establish callus formation from the same disinfection procedures using detergent 1% for fifteen minutes, rinsed and immersed in subsequent chlorine solution 3% three drops of Tween 20 for 10 minutes. The medium used for seeding was MS supplemented with 3mg / L 2,4-D and 0.5 mg / L BAP. Was evaluated weekly callus formation. The results showed no contamination of crops. Key words: Disinfection, callus formation, in vitro culture. INTRODUCCIÓN Uno de los pilares fundamentales de la biotecnología es la regeneración de plantas in vitro por organogénesis o embriogénesis somática. La aplicación de la biología molecular y celular al mejoramiento genético de plantas requiere que las células simples vegetativas desarrollen una planta completa (totipotencia). Esta premisa es útil tanto para inducir variabilidad genética por variación somaclonal o transformación genética directa como generar uniformidad genética para la multiplicación clonal o la propagación de material elite (Lorenzo Feijoo, 2007). Uno de los métodos más eficientes para poder reproducir masivamente material vegetal in vitro es a través de la inducción a callogénesis, a partir de la cual se puede obtener una organogénesis indirecta o una embriogénesis somática indirecta. Mediante callogénesis se genera tejido de callo a partir de un explante, de preferencia juvenil, debida a
  2. 2. que éste es morfo genéticamente más viable y con la ayuda de reguladores de crecimiento se estimula la formación de órganos (organogénesis indirecta) o de embriones somáticos (embriogénesis somática indirecta)(Jácome, 2012). El objetivo de este trabajo fue desinfectar y establecer callogénesis a partir de la raíz de zanahoria (Daucus Carota) el propósito de evaluar la formación de callos y si existe o no contaminacióncomo las causadas por los virus u hongos. Desde el descubrimiento de la embriogénesis somática por Stewart y Reinert la zanahoria ha sido empleada como sistema modelo para investigar la gran cantidad de aspectos bioquímicos, fisiológicos y genéticos del cultivo de células (Mc Donald, Jackman, Thorup, & Dandekar, 1995). Para la inducción de callos de zanahorias se utilizan reguladores de crecimiento como el ácido 2,4 diclorofenoxiacético (2,4D) (George, Hall, & De Klerk, 2008) MATERIALES Y METODOS La composición del medio nutritivo es importante y los reguladores suelen utilizarse en bajas concentraciones (0.10.5 mg/L); la auxina puede ser necesario para la formación de raíces, auxinas y citoquininas para estimular la división celular; A nivel celular el ácido 2,4 diclorofenoxiacético (2,4 -D) es utilizado como regulador de crecimiento con frecuencia para el cultivo in vitro ya que este es capaz de imitar a las hormonas naturales del crecimiento de las plantas causando un crecimiento celular anormal y acelerado(Bejarano, y otros, 2007); en general el 2,4-D afecta el metabolismo de la planta, síntesis de ácidos nucleicos y proteínas que alteran la actividad enzimática, respiración y división celular. El BAP es utilizado como regulador de crecimiento ya que modifica el crecimiento y morfogénesis de la planta, en general, actúa en el crecimiento indiferenciado a nivel de meristemos de modo que puede considerarse un inductor de callo en ciertos tejidos. Preparación de la muestra: Se adquirió varias zanahorias de tamaño pequeño para fácil manipulación, selavó cuidadosamente y sometió a proceso de desinfección. Preparación del medio de cultivo: El medio utilizado fue Murashige y Skoogcon 6g/l, enriquecido con 30mg/L de azúcar, 0,05 mg/l de BAP y 3,5mg/L de 2,4-D. Preparación de la sala de siembra: Se desinfectó el piso de la sala de siembra con kalipto, se limpiaron las cámaras de flujo laminar con papel toalla estéril y sablón. Se introdujo en la cámara todo el material a utilizar en la siembra: lámparas de alcohol, juego de pinzas, bisturí, servilletas estériles, plástico adherente, ligas, botellas de agua estéril, vasos de precipitación vacíos. Se prendió las UV de las cámaras de flujo durante 20 min, se apagó la UV y encendió el flujo de aire durante 15 min. Desinfección del explante: Se preparó 500 ml de una solución al1% de detergente y se sumergió los explantes, en agitación constante durante 15 minutos. Se lavó las muestras dos veces con agua destilada. Posteriormente se colocó los discos de zanahoria en 500 ml de una solución de cloro al 3% más tres gotas de tween 20 durante 10 a 15 minutos. Después de este proceso de desinfección, los explantes fueron trasladados a la cámara de flujo, donde se realizaron tres lavados y se retira los signos de necrosis
  3. 3. Explante Contaminació n Semana 1 Semana 2 Semana 3 Raíz 1 1 1 Raíz 2 Ninguna 0 1 1 Raíz 3 Ninguna 0 1 1 Raíz 4 N° frasco 0 Ninguna 0 1 1 Ninguna 0 0 1 Raíz 2 Antes de sellar el frasco se flameó la boca. Finalmente se selló el frasco con 2 capas de plástico adherente, se aseguró con una liga y se rotuló cada frasco. Se colocó los frascos en la estantería cubiertos con plástico negro. Ninguna Ninguna 0 1 1 Raíz 3 0 ningún cambio 1 inicio de Desdiferenciación 2 formación parcial de callo 3 formación completa de callo Ninguna 0 1 1 Raíz 4 Siembra del explante: Se cortó los segmentos de material vegetal necrosado a causa del cloro. Se trabajó con el explante sobre una servilleta estéril y cerca del flujo de aire de la cámara. Se flameó las pinzas y bisturí con savlón antes y después de manipular cada explante y se colocó un explante por frasco. Escala: Raíz 1 en el tejido superficial y quedan los discos listos para la siembra. Ninguna 0 0 1 Desdiferenciación 1 Se evaluó aparición de contaminantes, brotes encontrados en los discos y variaciones en forma y color. RESULTADOS 2 Tabla 1 Evaluación semana de explantes. Fotografía 1 Fotografía 2 La presencia de contaminantes tales como hongos y bacterias tuvo un porcentaje de 0% lo que indica que los medios y el explantes estaban libres de contaminantes (Tabla 1) esta determinación de contaminantes se lo obtuvo mediante observación a los medios (Fotografía 1).
  4. 4. DISCUSIÓN Según (Jiménez & Bangerth, 2001) establecen que la iniciación de suspensión de células en zanahoria es sencilla a partir de casi cualquier parte de la planta cultivada en 2,4D, se ha observado que en este medio se agregó también BAP, y es conocido previamente que el 2,4D es uno de los mejores inductores de callo. Se puede atribuir el retardo en la callogénesis por posible exceso en el tiempo de inmersión del tejido y las concentraciones utilizadas, ya que algunos autores sugieren un máximo de 3% de NaClO y se utilizó 3% de cloro más tres gotas de Tween. Para las contaminaciones observadas en otros frascos se puede atribuir a tres fuentes importantes de contaminación, la cristalería (en los bordes de los frascos o mala manipulación de los mismos), mala manipulación dentro de la cámara y sobre el tejido vegetal. CONCLUSIONES y RECOMENDACIONES: Los procedimientos de desinfección y manipulación fueron exitosos porque ninguno de los ocho explantes sembrados presento contaminación. Pero hay que evitar la muerte del tejido por causa del proceso de desinfección, por lo cual se recomienda mantener periodos de inmersión cortos y concentraciones bajas alrededor del 1% para el etanol y no más de 3% para el hipoclorito de sodio. Evaluar detalles como desinfección apropiada de cristalería y equipo de trabajo para minimizar las pérdidas por contaminación. BILIBOGRAFÍA: Atehortúa Garcés, L. (2009). Bioagricultura urbana y cambio climático. Colombia: Corporación Universitaria Lasallista . Bejarano, F., Harikrishan, V., Souza, J., Rozas, M., Nivia, E., Ramírez, F., y otros. (2007). 2,4 D Razones para su prohibición mundial. México: Tlatolli. George, E. F., Hall, M. A., & De Klerk, G. (2008). Plant Propagation by Tissue Culture (Tercera ed., Vol. Primer). The Background. Jácome, J. (Agosto de 2012). Repositorio ESPE. Recuperado el Octubre de 2013, de Establecimiento, inducción y evaluación a callogénesis in vitro de Romerillo: http://repositorio.espe.edu.ec/bitstrea m/21000/5678/1/AC-BIO-ESPE033915.pdf Jiménez, V. M., & Bangerth, F. (2001). Endogenous hormone levels in explants and in embryogenic and nonembryogenic cultures of carrot.Physiologia Plantarum. Lorenzo Feijoo, J. C. (2007). Biotecnología de la caña de azúcar.Cuba: Universitaria. Mc Donald, K., Jackman, A., Thorup, J., & Dandekar, A. (1995). Applied Biochemestry and Biotechnology.

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