バイオイメージング研究のためのImageJによるデジタル画像解析法(2012年6月版)

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バイオイメージング研究のためのImageJによるデジタル画像解析法(2012年6月版)

  1. 1. バイオイメージング研究のための ImageJ によるデジタル画像解析法 2012-06-15東京大学 大学院新領域創成科学研究科 先端生命科学専攻 朽名 夏麿
  2. 2. 生命現象のスケールと画像 塩基配列 200 nm 2000 km 生体分子 超微細構造 オルガネラ 細胞 組織 器官 個体 地球環境 個体群 10 nm 10 m 10 mm 1 km 105 km (10-8 m) (10-5 m) (10-2 m) 1m (103 m) (108 m)0.1 nm(10-10 m) スケール 画像 (バイオイメージング) 電顕 衛星画像 デジタル画像は生命科学の広いスケールで扱われる実験データ. その解析法を習得することで,共焦点顕微鏡だけでなく,電顕や デジカメ,Google Earth のような衛星画像を用いた研究も容易に. 生物以外の分野での ‘つぶし’ も効くし,生活や趣味にも役立つ.
  3. 3. デジタル画像解析をはじめる前に顕微鏡で撮影する際 適切な撮像設定(レンズ,励起光強度,露光時間,ピンホール径等). 留意点: S/N(シグナル-ノイズ比),ダメージ,サチュレーション防止等適切な画像解析の環境 良いソフトウェア: 現時点では ImageJ の利用を勧める. マシン: OSは問わない.速くてメモリが多いもの.64 bit OS 推奨. 良いモニタを正しく設定して使う.
  4. 4. インストールと基本画面
  5. 5. ImageJ と KBI plugins のインストール http://hasezawa.ib.k.u-tokyo.ac.jp/zp/Kbi/ImageJTutForNaist
  6. 6. ImageJ の基本画面 ← メニューバー ← ツールバー ← ステータスバー ← 画像タイトル 画像情報(サイズ等) ← 画像ウインドウ タバコBY-2 液胞膜 赤い三角形の付く アイコンは右クリック で機能切り替え可. ツールバー 赤い線: 頻用するもの. 青い線: selection (ROI).http://rsb.info.nih.gov/ij/docs/tools.html
  7. 7. 本実習での表記メニュー操作に関して: File - Open… File から Open… を選択する.ショートカット操作に関して: t Windows : t キー. Mac : コマンド + t キー. Shift + c Windows : Shift を押しながら c キー. Mac : コマンド と Shift を押しながら c キー.※コマンド一覧は Plugins - Shortcuts - Control Panel… でツリー形式, Plugins - Shortcuts - Create Shortcut の Command 欄でプルダウン形式で確認できる.※メニューの一部は ij.jar 内の IJ_Props.txt を編集することでカスタマイズ可能. JARはZIP形式として展開できる. メニューを完全に変更したい場合は ImageJ.java をいじる.※ ショートカットの一覧表示や追加は Plugins - Shortcuts メニューから可能. 一部のショートカットはソース中に埋め込まれている ( t とか < とか) .
  8. 8. デジタル画像の基本
  9. 9. 画素と画素数 ←画像情報: 159x153 pixels; 8-bit; 24K 159153 + キーで拡大 - キーで縮小 (3200%) : 拡大・縮小率 画素, pixel (picture element)画像ウインドウ左上に青い枠が表示されている場合,ウインドウに画像全域が収まっていない.現在表示されている部位が,画像全域のどこに相当するかを示している.
  10. 10. 座標系と画素と輝度 ←画像情報: 159x153 pixels; 8-bit; 24K x (3, 0) 輝度30 (x,y) = (0, 0) (3, 2) 輝度 35 輝度 21 ImageJ では左上を原点(0, 0)とし,右に X 軸,下にY軸が伸びる.y 各画素には輝度 (強度,intensity.明度 brightness とも言う) が割り当てられている. ※ 「0 から数えること」「左上が原点であること」 に注意.
  11. 11. 159 座標系と画素と輝度 File - Save As - Text Image… 153 x (3, 0) 輝度30 (x,y) = (0, 0) (3, 2) 輝度 35 輝度 21y 159列 表示を縮小 Excel で開いた例 153行
  12. 12. PowerPoint 等での強拡大に注意 PowerPoint で拡大 補間なしPowerPoint や Photoshop 等で補間をともなう"強拡大"をするとデジタル的な解像度や分解能と関係なく擬似的にズームしたようになるが,解像度や分解能が上がる訳ではない. 補間ありデータ解釈を誤らないよう注意.
  13. 13. Brightness & Contrast による表示状態の変更 ( Shift + c キー) 真っ白 真っ黒 スライドバーを動かすことによる調整は,表示上の"明るさ"を 変えているに過ぎない.→ 輝度は変化しない. 8-bit 画像の場合は Apply ボタンを押すことによって,その時の 表示範囲が0~255にスケールされる.→ 輝度が変化する.
  14. 14. 輝度ヒストグラム ( h キー )h位置情報を無視した上で,全画素について輝度の分布を可視化したもの.輝度の基本的な統計量(最小,最大,平均,標準偏差等)も表示されている.
  15. 15. 輝度のタイプ 輝度のデータ型. ビット深度(bit depth), bits per pixel, 量子化ビット数等とも呼称. グレイスケール画像, 濃淡画像 ≠白黒画像 8-bit: 0~255 の整数(integer) 16-bit: 0~65535 の整数(integer) 32-bit: 浮動小数点数(float) 実数の近似値.±3.4*1038 の 範囲で7桁位の精度. (3, 0) 輝度30 カラー画像 8-bit Color: 使わない. RGB Color: 赤緑青の3チャネルを(0, 0) (3, 2) 重ねることによるカラー表現.輝度 35 輝度 21 各チャネルのデータ型は8-bit, 16-bit, 32-bit のいずれかで, チャネル間では統一されている.
  16. 16. 輝度のビット深度 輝度 28 =256 段階グレイスケール画像, 濃淡画像 255 ≠白黒画像8-bit: 0~255 の整数(integer)16-bit: 0~65535 の整数(integer)32-bit: 浮動小数点数(float) 0 8 bits/pixel 位置(pixel) 実数の近似値.±3.4*1038 の 範囲で7桁位の精度.原画像のビット深度はカメラによって異なり,8~16 bits/pixel が主.12 bits/pixel (212 , 0~4095) や 14 bits/pixel (214 , 0~16383)のカメラで得た画像は 16 bits/pixel の画像フォーマットとして扱う(大は小を兼ねる).輝度には必ずノイズが混じるので,深度が大きい方が一概に高性能というわけではない.画像処理的には内部で 32-bit (float) を用いることも多い(小数やマイナスの値が扱えるので) .
  17. 17. 画像情報の修正 (ビット深度,スケール情報) ビット深度: Image - Type - …スケール情報: Analyze - Set Scale…
  18. 18. この章のまとめ: デジタル画像の基本まず解析対象をさまざまな「見方」で見よう. 表示上の"明るさ"をさまざまに設定し,必ず一度は「サチる」状態 までコントラストを上げる. Shift + c キー ズーム機能によって,必ず「画素」の大きさが認識できる倍率まで 拡大する. + キーで拡大,- キーで縮小 回転(Image - Transform -...),白黒反転(Image - Lookup Tables - Invert LUT),擬似色表示(Image - Lookup Tables - ...)も有効.画像処理・画像解析の基本的概念を覚えておこう. 画素(pixel),輝度(intensity),ビット深度(bit depth), 輝度ヒストグラム(intensity histogram)
  19. 19. 実習班ごとに指定した画像ファイルを用いて,以下について解析せよ.Q1. 以下の表を埋めよ.水平画素数 中央の画素の座標と輝度垂直画素数 最小輝度全画素数 最大輝度と,その画素の座標ビット深度 平均輝度※ 複数枚の画像(Z軸や時間軸がある画像)の場合, Image - Stack - Z Project… - Max Intensity によって1枚の投影画像に変換してから解析すること.Q2. ヒストグラムウインドウで Live ボタンを押した後(赤文字になる), 画像に下記の処理(ガウスぼかしによるノイズ抑制)を行なった 場合に,ヒストグラムがどのように変化するかを述べよ. 処理: Process - Filter - Gaussian Blur… にて Preview を ON, Sigma(Radius)の値を0,1,2,4,8,16,32と増やす. 注意: ヒストグラムウインドウでなく画像に対して処理すること.
  20. 20. 形の解析: 二値化,粒子解析,繊維解析
  21. 21. 手作業でのROI設定を介した形状解析: 長さ t Excel 等にペースト or テキストファイルに保存して R スクリプトで統計処理 等.線分や曲線をマウスで引き, t キーで ROI Manager に登録,を繰返す.ROI Manager の「Show All」をチェックしておくと見やすい.Measure ボタンで登録済の ROI 全部をまとめて測定.角度や長さ(画素単位)が得られる. Excel等でμmに変換し,統計処理.ROI: region of interest,関心領域,注目領域
  22. 22. 手作業でのROI設定を介した形状解析: 面積 or t測定項目は Analyze - Set Measurements... で決定.「測定対象領域をマウスで指定し, t キーで ROI Manager に登録」を繰返す.Measure ボタンで測定.
  23. 23. 二値化による領域抽出 ( Shift + t キー) 二値画像 (白黒画像) グレイスケール画像 (濃淡画像) or蛍光像の場合,「高い輝度の領域」が「測定対象領域」の場合が多い.閾値となる輝度を決め,二値画像(白黒画像)に変換することで,領域抽出(領域分割, segment)ができる.ではどのように閾値を決めればいいのか?
  24. 24. 人間の目視による閾値決定作業者の感覚が頼り.同じ人が作業しても,閾値が同じになるとは限らない(部屋やモニタの明るさの影響など).
  25. 25. 自動閾値決定Threshold ウインドウでは,人間による閾値決定だけでなく自動閾値決定もできる.右図のように,複数のアルゴリズムから選択する.いずれも輝度ヒストグラムをもとに「ある明るさ」を閾値として背景と背景(解析対象)を分ける.画像自体と解析対象に関する輝度分布の性質によって,適切なアルゴリズムは異なる.
  26. 26. 二値化を介した粒子解析の例 二値画像グレイスケール画像 Analyze - Analyze Particles…
  27. 27. 二値化を介した繊維構造の解析例シロイヌナズナ気孔 アクチン繊維 共焦点画像 バンドパスフィルタ 二値化像 細線化像 による繊維等の強調 気孔開閉の指標 アクチン繊維の配向の指標 短径 / 長径 長径 気孔に対する アクチン繊維の角度  短径  気孔 灰色: 気孔領域 この場合, この場合,黒色: アクチン繊維 短径 / 長径=0.47 アクチン繊維の角度=54.3°
  28. 28. バンドパスフィルタ 輝度プロファイル(左図の黄色い線) 細胞表層微小管のプラス端Process - FFT - Bandpass Filter... 注目している物を,おおよその大きさを指定することで 強調する処理.ノイズや細胞形状の影響を抑制する.
  29. 29. この章のまとめ: 形の解析領域抽出 (segmentation,領域分割) の方法 * マウス等で測定部位を描いて ROI を設定する. * 輝度を閾値として二値化する. Shift + t キー. * 人間による閾値決定. * 自動閾値決定.粒子解析 (ノイズ除去等) → 領域抽出 → (ノイズ除去等) → 測定繊維解析 濃淡画像→二値画像→細線画像の場合: (ノイズ除去等) → 領域抽出 → … → 細線化 → … → 測定 濃淡画像→細線画像の場合: (ノイズ除去等) → … → 細線化 → … → 測定
  30. 30. 実習Q3. 班ごとに指定した画像ファイルを ImageJ で読み込み,適切な画像解析手法を用いて,以下の表を埋めよ. ミトコンドリア ゴルジ体解析に用いた領域抽出手法1個あたりの面積細胞内密度※ 輝度を閾値とした二値化手法を用いた場合,閾値を決めた方法と,閾値がいくつかも示せ.※ 細胞内密度の単位は「1000 * 1000 pixel あたりの個数」とせよ.※ 大きさの単位は「pixel」とせよ.ヒント: 画像が背景領域を含む場合は,事前に解析領域を 矩形ROIで選択し,Shift + x で切り出すことができる.
  31. 31. 実習Q4. 指定した画像中のアクチン繊維の配向を解析せよ.手順1. 最大輝度投影 手順3 Image - Stack - Z Project … - Max Intensity手順2. 画像の複製 Shift + d キー BP1手順3. バンドパスフィルタ BP2 Process - FFT - Bandpass Filter... - 右図※ 赤く囲ったパラメタ(BP1,BP2)は強調する対象の 大きさの範囲.適切に設定せよ.手順4. 二値化 (適切な手法を採用すること)手順5. 細線化 Process - Binary - Skeletonize 手順6,7手順6. 細線画像からの配向解析(画像全体からの測定) Plugins - kbi - Kbi_LinesAngle - mode = eachSlice ※ theta: 平均角度,normAvgRad: 並列度,totalPair: 全長手順7. 細線画像からの配向の可視化 Plugins - kbi - Kbi_LinesAngle - mode = map※ 黄色い丸で囲ったパラメタは解析領域の大きさとステップ.BP1 BP2 二値化法と閾値 平均角度 並列度 全長
  32. 32. 動きの解析
  33. 33. スタック画像 時系列画像(動画像,動画,XYT) や,焦点面を変えて撮影した連続 画像(立体画像,XYZ)はともに スタック画像として操作できるが, ZとTの区別が無いことに注意. スタック画像を構成する2次元画像 をスライスとかフレームと呼ぶ. ステータスバーの z=2 はタバコ培養細胞微小管プラス端 「Z座標の値が2」を示す (0から数えている. 0-origin) . 画像情報欄の 3/10 は 表示中のスライスを変更 「全10枚中3枚目」を示す (1から数えている.1-origin).再生 (速度設定: Image - Stacks - Tools - Animation Options...)
  34. 34. 動き解析のための輝度投影Brightness & Contrast, Image - Type - 8-bit Image - Stacks - Z Project - Max Intensity 最大輝度投影 Plugins - kbi - Kbi_StkFilter - maxHsvProject 輝度投影(疑似色) time
  35. 35. 動き解析のための粒子追跡 輝度投影 1スライス目 10スライス目 (疑似色) T-1平均速度:(pixel/slice) T: スライス数
  36. 36. 動き解析のためのカイモグラフ最大輝度投影 1スライス目 10スライス目 Plugins - kbi - Kbi_DynProf - kymoStatic 位置 p t 平均速度: (pixel/slice)時間
  37. 37. オプティカルフロー
  38. 38. 動き解析のためのオプティカルフロー法 Plugins - kbi - Kbi_Flow シロイヌナズナ胚軸表皮 小胞体CSU, EM-CCD, 50 ms * 100 frame Plugins - kbi - Kbi_DynProf - kymoStatic 位置時間
  39. 39. この章のまとめ: 動きの解析スタック画像:2次元画像のもつX,Y軸に加え,時間軸(T軸)をもつ3次元データ.動きの可視化と計測: * ムービーとして再生. * 輝度投影. * 粒子追跡. * 手動. * 自動. * カイモグラフ. * オプティカルフロー法.
  40. 40. 実習Q5. 指定した画像中に分布するミトコンドリアやゴルジ体について, 個々の時間平均速度を測定せよ. その後,オルガネラ平均速度を測定せよ. 単位: pixel / frameカイモグラフ法 1 2 3 4 5 6 7 8 平均ミトコンドリアゴルジ体粒子追跡法 or 1 2 3 4 5 6 7 8 平均オプティカルフローミトコンドリアゴルジ体 ※ オプティカルフローを試したい班は声をかけて下さい.
  41. 41. まとめ
  42. 42. なぜ画像解析をするのか?* 撮影した画像をどのように扱うか,という問題. 典型的な何枚かを原稿に貼り付け,legend を書いて終わり? 定量性,そして客観性. 同じ画像から,解析次第で様々な情報が引き出せる.* 何のために可視化したり撮影するのか,という問題. 可視化,撮像,解析までトータルに考えて実験計画を立てる. 研究者のツールとしての画像解析,という段階へ.
  43. 43. もう少し詳しく学ぶには省略したがバイオイメージングで重要な事項 * blur (ボケ) と PSF(点像分布関数, point-spread function). 蛍光ビーズによるPSF測定.blur の影響と対策. * ノイズ,とくにGaussノイズとショットノイズ. 撮像法との関係と,ノイズ抑制の手法. * 背景 (background) 輝度の高さと分布の扱い.参考になる本 田村秀行 (2002) コンピュータ画像処理 オーム社,ISBN-13: 978-4274132643 Burger W & Burge MJ (2007) Digital Image Processing: An Algorithmic Introduction using Java Springer, ISBN-13: 978-1846283796 ※ ImageJ 本.バイオ指向.プラグインの作例が豊富.参考になるサイト 英語なら ImageJ 公式サイトを起点に充実.翻訳??
  44. 44. 謝辞* Plant Organelles Database2 で公開されている画像を例として一部で 用いました. Mano S et al. (2008) Nucleic Acids Res 36: D929-D937. http://podb.nibb.ac.jp/Organellome/* 小胞体流動の画像提供と KbiFlow 開発への協力を 下記グループからいただきました. 京都大 理学研究科 西村いくこ先生,嶋田知生先生,田村謙太郎先生,上田晴子先生
  45. 45. 補遺: ImageJ の主なメニュー項目の紹介
  46. 46. File メニュー: ファイルの読み込み・書き込み等 New: 新規作成. System Clipboard で他アプリから画像の 読み込みができる. Open...: 画像ファイル等を開く. Import: 各種フォーマットの 画像ファイル等を開く. Close: 画像ウインドウを閉じる. Save: 画像ウインドウの内容をファイルに 保存する. ※ Save しない限り,ファイルは書き 変わらない. Quit: ImageJ を終了する.
  47. 47. Edit メニュー: 画像の切り貼り,描画 Undo: 直前の作業の取消し. 1ステップ限定かつ 一部のみ対応. Cut, Copy, Paste: 画像の切り貼り. 対象は画像全域かROI . Copy to System: 他アプリへのコピー. Clear, Fill, Draw: 単色描画.実際の色は Color Pickerで色は設定. Selection: ROI の制御. (Selection = ROI) Add To Manager: 複数のROI を管理.
  48. 48. Image メニュー: 種別,色,スタック,変形,複製等,色々 Type: 輝度タイプの変換. 8-bit, 16-bit, 32-bit, RGB color... Adjust: 表示上の明るさの調整や二値化等. Color: グレイスケール画像とカラー画像の 変換等. Stacks: 時系列画像(動画像),立体画像の 処理.輝度投影,スライス一覧(montage) の作成等. Crop: ROI 部分の切り出し. Duplicate: 画像ウインドウの複製. Rename: 画像ウインドウのタイトル変更. Scale: 画像解像度の変更.つまり画像サイズ の拡大・縮小. ※表示の拡大・縮小と混同しないよう注意.
  49. 49. Process メニュー: 基礎的な画像処理(フィルタ等) Find Edges: 輪郭強調. Binary: 2値画像(白黒画像)処理. Math: 加減乗除等による 各画素の輝度変更. Filters: ノイズ抑制等のフィルタ. Image Calculator: 画像と画像の間 の演算. 加減乗除等.
  50. 50. Analyze メニュー: 測定やグラフ関係 Measure: ROI 部分の諸パラメタの測定. Analyze Particles...: 粒子解析. Set Measurements...: Measure で測定する パラメタの選択. Set Scale...: 1画素が何 m かを設定する. Histogram: 輝度ヒストグラムの表示. Plot Profile: 輝度プロファイルの表示. 他のメニュー Plugins: プラグイン,マクロ,ショートカット キー設定等. Window: 画像ウインドウ,ログウインドウ等 の一覧や並び換え. Help:ブラウザにウェブ上のマニュアルを 表示する等.

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