Successfully reported this slideshow.
We use your LinkedIn profile and activity data to personalize ads and to show you more relevant ads. You can change your ad preferences anytime.

HPLC-HIgh Pressure/Performance Liquid Chromatography

ALL Chromatographic of HPLC in Details

  • Login to see the comments

HPLC-HIgh Pressure/Performance Liquid Chromatography

  1. 1. 0.0
  2. 2. Injection System HHPPLLCC Waste
  3. 3. High Pressure Liquid Chromatography:  TThhee nnaammee ““HHPPLLCC”” oorriiggiinnaallllyy rreeffeerrrreedd ttoo tthhee ffaacctt tthhaatt hhiigghh pprreessssuurree wwaass nneeeeddeedd ttoo ggeenneerraattee tthhee ffllooww rreeqquuiirreedd ffoorr lliiqquuiidd cchhrroommaattooggrraapphhyy iinn ppaacckkeedd ccoolluummnnss..  TThhee eeaarrllyy 11997700’’ss ssaaww aa ttrreemmeennddoouuss lleeaapp iinn tteecchhnnoollooggyy.. TThheessee nneeww ““HHPPLLCC”” iinnssttrruummeennttss ccoouulldd ddeevveelloopp uupp ttoo 66,,000000ppssii ((440000 bbaarr)) ooff pprreessssuurree,, aanndd iinncclluuddeedd iimmpprroovveedd ddeetteeccttoorrss aanndd ccoolluummnnss..  HHPPLLCC rreeaallllyy bbeeggaann ttoo ttaakkee hhoolldd iinn tthhee mmiidd ttoo llaattee 11997700’’ss.. WWiitthh ccoonnttiinnuueedd aaddvvaanncceess iinn ppeerrffoorrmmaannccee,, tthhee nnaammee wwaass cchhaannggeedd ttoo HHiigghh PPeerrffoorrmmaannccee LLiiqquuiidd CChhrroommaattooggrraapphhyy ((HHPPLLCC)).. HHiigghh PPeerrffoorrmmaannccee LLiiqquuiidd CChhrroommaattooggrraapphhyy ((HHPPLLCC)) iiss nnooww oonnee ooff tthhee mmoosstt ppoowweerrffuull ttoooollss iinn aannaallyyttiiccaall cchheemmiissttrryy,, wwiitthh tthhee aabbiilliittyy ttoo sseeppaarraattee,, iiddeennttiiffyy aanndd qquuaannttiittaattee tthhee ccoommppoouunnddss tthhaatt aarree pprreesseenntt iinn aannyy ssaammppllee tthhaatt ccaann bbee ddiissssoollvveedd iinn aa lliiqquuiidd.. IInnttrroodduuccttiioonn
  4. 4. HPLC System Provide High sensitivity High Accuracy Find out purity / impurity profile For the non volatile compound / high Mol. Wt. BBaassiicc PPrriinncciippllee OOff HHPPLLCC
  5. 5. HPLC Pressure Performance High Pressure Pump High Accuracy High Sensitivity BBaassiicc PPrriinncciippllee OOff HHPPLLCC
  6. 6. Copyright © 2008, Advance Analytical Research & Training Institute HHPPLLCC
  7. 7.  Adsorption Chromatography • Normal Phase • Reversed Phase • Ion exchange • Affinity • Hydrophobic Interaction  Partition Chromatography • Liquid Liquid chromatography • Gas chromatography  Size exclusion Chromatography • Gel filtration • Gel permeation • Gel chromatography PPrriinncciipplleess OOff SSeeppaarraattiioonn
  8. 8. PPrriinncciipplleess OOff SSeeppaarraattiioonn
  9. 9.  Adsorption Chromatography • The principle of separation is adsorption. Separation of components takes place because of the difference in affinity of compounds towards stationary phase. This principle is seen in normal phase as well as reversed phase mode, where adsorption takes place. PPrriinncciipplleess OOff SSeeppaarraattiioonn
  10. 10. AAddssoorrppttiioonn CChhrroommaattooggrraapphhyy
  11. 11.  Ion exchange chromatography • The principle of separation is ion exchange, which is reversible exchange of functional groups. In ion exchange chromatography, an ion exchange resin is used to separate a mixture of similar charged ions. For cations, a cation exchange resin is used. For anions, an anion exchange resin is used. PPrriinncciipplleess OOff SSeeppaarraattiioonn
  12. 12. PPrriinncciipplleess OOff SSeeppaarraattiioonn
  13. 13. PPrriinncciipplleess OOff SSeeppaarraattiioonn
  14. 14.  Affinity Chromatography • Affinity chromatography uses the affinity of the sample with specific stationary phases. This technique is mostly used in the field of biotechnology, microbiology, biochemistry etc. PPrriinncciipplleess OOff SSeeppaarraattiioonn
  15. 15.  Size exclusion chromatography • In this type of chromatography, a mixture of components with different molecular sizes are separated by using gels. The gel used acts as molecular sieve and hence a mixture of substances with different molecular sizes are separated. Soft gels like dextran, agarose or polyacrylamide are used. Semi rigid gels like polystyrene, alkyl dextran in non aqueous medium are also used. The mechanism of separation is by steric and diffusion effects. PPrriinncciipplleess OOff SSeeppaarraattiioonn
  16. 16. PPrriinncciipplleess OOff SSeeppaarraattiioonn
  17. 17. PPaarrttiittiioonn CChhrroommaattooggrraapphhyy
  18. 18. IInnssttrruummeennttaattiioonn
  19. 19. IInnssttrruummeennttaattiioonn
  20. 20. RREESSEERRVVOOIIRR TToo hhoolldd ssoollvveenntt oorr MMoobbiillee PPhhaassee ((BBeeccaauussee iitt mmoovveess)).. PPUUMMPP uusseedd ttoo ggeenneerraattee aanndd ccoonnttrrooll tthhee ffllooww aatt aa ssppeecciiffiieedd ffllooww rraattee,, ttyyppiiccaallllyy iinn mmiilllliilliitteerrss ppeerr mmiinnuuttee.. SSoommeettiimmeess tteerrmmeedd aass ““SSoollvveenntt ddeelliivveerryy ssyysstteemm”” oorr ““SSoollvveenntt MMaannaaggeerr””.. IINNJJEECCTTOORR TToo iinnttrroodduuccee ((““iinnjjeecctt””)) tthhee SSAAMMPPLLEE iinnttoo tthhee fflloowwiinngg mmoobbiillee pphhaassee ssttrreeaamm,, wwhhiicchh ccaarrrriieess tthhee ssaammppllee iinnttoo tthhee HHPPLLCC CCOOLLUUMMNN.. SSoommeettiimmeess tteerrmmeedd aass ““SSaammppllee MMaannaaggeerr”” oorr ““AAuuttoo SSaammpplleerr””.. CCOOLLUUMMNNSS ccoonnttaaiinnss tthhee cchhrroommaattooggrraapphhiicc ppaacckkiinngg mmaatteerriiaall nneeeeddeedd ttoo ccrreeaattee tthhee sseeppaarraattiioonn.. TThhiiss iiss ccaalllleedd aass SSttaattiioonnaarryy PPhhaassee.. IInnssttrruummeennttaattiioonn DDEETTEECCTTOORR nneeeeddeedd ttoo ““sseeee”” tthhee sseeppaarraatteedd ““ccoommppoouunndd bbaannddss”” aass tthheeyy eelluuttee ffrroomm tthhee HHPPLLCC ccoolluummnn.. MMoobbiillee PPhhaassee eexxiittss tthhee ddeetteeccttoorr iinn ttoo tthhee wwaassttee..
  21. 21.  A modern HPLC apparatus is equipped with one or more glass or stainless steel reservoirs, each of which contain 500 ml or more of solvent.  Mobile phase preparation and use: • Sample must be soluble in mobile phase • Solvent filtration. • Solvent degassing.  Sample must be soluble in mobile phase. If it is not soluble then sample may clot in the column and damage it.  Different grades are available. AR/ LR/ GR/ HPLC/ GRADIENT/ SPECTROSCOPIC etc. Clean, high purity HPLC grade solvents and reagents should be used while preparing mobile phase. MMoobbiillee PPhhaassee
  22. 22.  Solvent filtration: • Solvents should be filtered through a 0.45 micron filter. This is especially critical with salts and buffers. Also ensure that the filter material is compatible with the solvent used. The benefit of solvent filtering includes: 1. Improved pump performance (including seals, check valves and plunger) 2. Increase in injector life • MMoobbiillee After filtering, PPhhaassee store the solvent in a covered reservoir to prevent dust and debris from entering the solvent.
  23. 23. SSoollvveenntt ffiillttrraattiioonn
  24. 24. SSoollvveenntt ffiillttrraattiioonn
  25. 25. SSaammppllee ffiillttrraattiioonn
  26. 26. SSaammppllee ffiilltteerrss
  27. 27. SSaammppllee ffiillttrraattiioonn
  28. 28. MMoobbiillee PPhhaassee
  29. 29.  Mainly used for premixed mobile phase.  If the mobile phase reservoir is placed in an ultrasonic bath, the sound waves remove small bubbles which can escape more easily.  not recommended for on-line mixing systems  often used in conjunction with vacuum degassing. SSoonniiccaattiioonn
  30. 30. VVaaccuuuumm DDeeggaass
  31. 31. VVaaccuuuumm DDeeggaass
  32. 32.  A stream of helium bubbles will sweep dissolved air out of liquids.  Helium sparging is very effective; it can reduce the dissolved air.  This makes helium sparging especially suitable for use with on-line mixing systems. HHee DDeeggaass
  33. 33.  This is the most convenient approach to degassing.  There is in built facility for degassing.  This only degas the solvent, not filter. IInn--lliinnee DDeeggaass
  34. 34.  Improper solvent preparation leads to: • Out gassing in pump head • Air bubbles or particles trapped in the detector flow cell • Mobile phase contamination • Damage to pump, check valves and seals. • Plugged in-line filters, frits, check valves or connecting tubing. • Poor injection precision. • High system back pressure. • Flow related base line noise. • Shifting retention times. • Abnormal peak shapes. • In correct qualitative/ quantitative results. MMoobbiillee PPhhaassee
  35. 35.  Pumps are used to pass mobile phase through the column at high pressure and at controlled flow rate.  Ideal pump: • Generation of pressures up to 6000 psi • Flow rate ranging from 0.1 to 10 ml/min • Flow control and flow reproducibility of ± 0.5% • It should be composition resistant and give a pulse free output. • Mobile phase change should be easy. HHiigghh PPrreessssuurree PPuummpp
  36. 36.  Pumps are categorized into 1. Single head reciprocating piston pump (Dual Piston Pump) 2. Syringe pump 3. Diaphragm pump  Depending upon elution technique, they are categorized into 1. ISOCRATIC ELUTION 2. GRADIENT ELUTION HHiigghh PPrreessssuurree PPuummpp
  37. 37.  Pressure gauge (Dampener) • To reduce pulsations  Piston • For suction of mobile phase from solvent reservoir and its withdrawal to column  Check valves • Piston in co ordination with check valve maintain flow rate  Purge valve • For purging of system. If there is any bubble in mobile phase and it is passed into the system then there are chances of damage of piston, check valves, column etc. so purging is done in which some of the mobile phase is bypassed and then it is allowed to pass into the system. PPaarrttss OOff PPuummpp
  38. 38. TThhiiss iiss tthhee ppiiccttuurree ooff ppiissttoonn aalloonngg wwiitthh sseeaall.. PPiissttoonn iiss mmaaddee uupp ooff ssttaaiinnlleessss sstteeeell,, bboorroossiilliiccaattee oorr SSaaffiirree ggllaassss.. MMoottoorr ddrriivveenn ppiissttoonn mmoovveess tthhrroouugghh tthhiiss sseeaall aanndd ggiivveess aaccccuurraattee ffllooww.. PPiissttoonn
  39. 39. IIff mmoobbiillee pphhaassee iiss nnoott ffiilltteerreedd// ccoonnttaammiinnaatteedd,, ppaarrttiiccllee ggeettss ttrraappppeedd bbeettwweeeenn sseeaall aanndd pplluunnggeerr rreessuullttiinngg iinn ssccrraattcchheess oonn ttoo tthhee ssuurrffaaccee ooff pplluunnggeerr aanndd ggiivveess nnoonn rreepprroodduucciibbllee ffllooww rraattee.. PPiissttoonn
  40. 40. TThhiiss iiss tthhee ppiiccttuurree ooff cchheecckk vvaallvvee.. DDeeppeennddiinngg uuppoonn tthhee ddeessiiggnn ooff ppuummpp,, CChheecckk tthheerree aarree vvaallvvee ttwwoo oorr mmoorree tthhaann ttwwoo cchheecckk vvaallvveess aarree pprreesseenntt.. IInn cchheecckk vvaallvvee,, tthheerree iiss aa bbaallll aanndd sseeaatt aarrrraannggeemmeenntt wwhhiicchh iiss eexxppllaaiinneedd iinn nneexxtt sslliiddee..
  41. 41. CChheecckk vvaallvvee Ball Seat Holder
  42. 42. CChheecckk vvaallvvee
  43. 43. SSiinnggllee hheeaadd rreecciipprrooccaattiinngg ppiissttoonn ppuummpp •TThhee ttwwiinn ppiissttoonn ppuummppss wwiitthh sshhoorrtt ssttrrookkee aarree aammoonngg tthhee mmoosstt ccoommmmoonnllyy uusseedd ppuummppss ffoorr HHPPLLCC.. • BBootthh ppuummpp hheeaaddss aarree sswwiittcchheedd iinn sseerriieess,, wwhheerreebbyy tthhee ppiissttoonn iinn tthhee ffiirrsstt ppuummpp hheeaadd ddeelliivveerrss aa ssppeecciiffiicc vvoolluummee ppeerr ssttrrookkee.. SSiinnggllee HHeeaadd RReecciipprrooccaattiinngg PPiissttoonn PPuummpp
  44. 44. SSiinnggllee HHeeaadd RReecciipprrooccaattiinngg PPiissttoonn PPuummpp
  45. 45. SSiinnggllee HHeeaadd RReecciipprrooccaattiinngg PPiissttoonn PPuummpp
  46. 46.  Advantages: • Modest cost • Pressure up to 8000 psi • External reservoir • Simple mechanical design  Limitation: • pulse noise • Seal, valve maintenance SSiinnggllee HHeeaadd RReecciipprrooccaattiinngg PPiissttoonn PPuummpp
  47. 47. DDuuaall PPiissttoonn PPuummpp
  48. 48. SSyyrriinnggee PPuummpp
  49. 49.  Advantages: • Pulse free • High pressure up to 10000 psi • Convenient flow control  Limitation: • Expensive • Difficult solvent change refill SSyyrriinnggee PPuummpp
  50. 50. DDiiaapphhrraaggmm PPuummpp
  51. 51.  Types of HPLC pumps based on elution techniques: 1. ISOCRATIC: A separation that employs a single solvent of constant composition is termed as isocratic elution. 2. GRADIENT: A separation that employs two (or more) solvent systems that differ significantly in polarity is termed as gradient elution. • Frequently separation technique is greatly enhanced by gradient elution. Here the proportion of the solvent is varied in programmed way, sometimes continuously and sometimes in a series of steps. Modern HPLC equipment is often equipped with devices that introduce solvents from two or more reservoirs into a mixing chamber at rates that vary continuously. HHiigghh PPrreessssuurree PPuummpp
  52. 52. IIssooccrraattiicc
  53. 53. GGrraaddiieenntt
  54. 54. GGrraaddiieenntt
  55. 55. GGrraaddiieenntt
  56. 56. EElluuttiioonn TTeecchhnniiqquueess
  57. 57. CCoommppaarriissoonn bbeettwweeeenn IIssooccrraattiicc && GGrraaddiieenntt
  58. 58. IIssooccrraattiicc GGrraaddiieenntt LLeeaasstt CCoommpplleexx MMoorree ccoommpplleexxiittyy CCoommppoossiittiioonn rreemmaaiinnss ccoonnssttaanntt 4400%% WWaatteerr//6600%%MMeetthhaannooll PPrreemmiixxeedd SSoollvveennttss AAuuttoommaatteedd SSoollvveenntt BBlleennddiinngg CCoommppoossiittiioonn vvaarriieess wwiitthh ttiimmee BBoottttllee AA:: 110000%% WWaatteerr BBoottttllee BB:: 110000 MMeetthhaannooll 00 %% BB ttoo 110000%% BB oovveerr 1100 mmiinnuutteess MMuusstt wwaasshh ccoolluummnn wwiitthh hhiigghh ssttrreennggtthh ssoollvveenntt aafftteerr pprroolloonnggeedd uussee MMuusstt rree--eeqquuiilliibbrraattee ccoolluummnn bbeeffoorree rree--iinnjjeeccttiinngg CCoommppoouunndd CCoommppaarriissoonn ccoo--eelluuttiioonn ffrreeqquueenntt bbeettwweeeenn mmoorree NNoo ccoommppoouunndd IIssooccrraattiicc ccoo--eelluuttiioonn && GGrraaddiieenntt ddiiffffiiccuulltt ttoo ggeett rreessoolluuttiioonn ooff DDwweellll vvoolluummee eeffffeeccttss ccoommppoouunnddss
  59. 59. IInnjjeeccttoorrss
  60. 60.  Manual Injectors • Samples are loaded by the analyst  Auto samplers • Loads and inject samples; limited pre-injection treatment of samples (e.g., dilution or addition of aliquots of a standard)  Sample Managers • Integrates sample pre-treatment and injection with other system parameters such as the selection of the column, analytical conditions and processing method. IInnjjeeccttoorrss
  61. 61. RRoottoorr SSeeaall LLoooopp MMaannuuaall IInnjjeeccttoorrss
  62. 62. MMaannuuaall IInnjjeeccttoorrss
  63. 63. AAuuttoo ssaammpplleerr
  64. 64. CCoolluummnnss
  65. 65. CCoolluummnnss
  66. 66. CCoolluummnn HHaarrddwwaarree
  67. 67. CCoolluummnn HHaarrddwwaarree
  68. 68. CCoolluummnn HHaarrddwwaarree
  69. 69. CCoolluummnn HHaarrddwwaarree
  70. 70. AAnnaallyyttiiccaall CCoolluummnnss
  71. 71. AAnnaallyyttiiccaall // PPrreepp CCoolluummnnss
  72. 72. CCOOAA OOff CCoolluummnn
  73. 73.  Protects the analytical column.  It is located between the pump and the sample injector.  Used when mobile phase ph is greater than 8.  Particle size is larger than analytical column.  It saturates the mobile phase so high PH mobile phase does not dissolve the silica inside the analytical column. PPrree CCoolluummnnss
  74. 74.  It is a short column.  Located between sample injector and analytical column.  Used when dirty samples are to be injected like blood, urine, soil samples etc.  Contain same particle size and packing material as that of analytical column.  It is cheap and can be refilled. GGuuaarrdd CCoolluummnnss
  75. 75. PPrree ccoolluummnnss && gguuaarrdd ccoolluummnnss
  76. 76. Preparatory Columns • Used in bulk drugs. • Mainly for synthesis purpose • Preparatory column has a large column diameter to facilitate large volume injections. Micro bore Columns • used for analytical and small volume assays. • Diameter is 1-2 mm. • Increase in sensitivity without loss in resolution. Preparatory ccoolluummnnss && MMiiccrroo bboorree ccoolluummnnss
  77. 77. MMiiccrroobboorree && AAnnaallyyttiiccaall CCoolluummnn
  78. 78.  TThhrreeee pprriimmaarryy cchhaarraacctteerriissttiiccss ooff cchheemmiiccaallss ccaann bbee uusseedd ttoo ccrreeaattee HHPPLLCC sseeppaarraattiioonnss.. TThheeyy aarree:: • PPoollaarriittyy –– ((NNoorrmmaall PPhhaassee oorr RReevveerrsseedd PPhhaassee)) • EElleeccttrriiccaall CChhaarrggee –– ((IIoonn EExxcchhaannggee)) • MMoolleeccuullaarr SSiizzee –– ((GGPPCC oorr SSEECC TTyyppee)) RReetteennttiioonn MMeecchhaanniissmm
  79. 79.  NNoorrmmaall aanndd rreevveerrsseedd pphhaassee cchhrroommaattooggrraapphhyy iiss mmaaiinnllyy bbaasseedd oonn PPOOLLAARRIITTYY..  IInn iioonn eexxcchhaannggee cchhrroommaattooggrraapphhyy,, sseeppaarraattiioonn iiss aacchhiieevveedd oonn tthhee bbaassiiss ooff iioonniicc pprrooppeerrttiieess ooff ssaammppllee..  IInn ssiizzee eexxcclluussiioonn cchhrroommaattooggrraapphhyy,, ssaammppllee mmiixxttuurree iiss sseeppaarraatteedd bbaasseedd oonn ssiizzee ooff tthhee mmoolleeccuulleess ooff tthhee ssaammppllee.. RReetteennttiioonn MMeecchhaanniissmm
  80. 80.  AA ssiimmppllee rruullee ddeessccrriibbeess tthhiiss bbeehhaavviioorr ffoorr ppoollaarriittyy--bbaasseedd rreetteennttiioonn mmeecchhaanniissmmss::  ““LLiikkee AAttttrraaccttss LLiikkee,, aanndd OOppppoossiitteess aarree NNoott AAttttrraacctteedd WWhheenn WWee UUssee PPoollaarriittyy””.. –– JJuusstt ooff ooppppoossiittee ttoo mmaaggnneettiissmm.. • PPoollaarr wwiillll aattttrraacctt PPoollaarr ((lliikkee)),, aanndd rreeppeell NNoonn--PPoollaarr ((ooppppoossiitteess)).. • NNoonn--PPoollaarr wwiillll aattttrraacctt NNoonn--PPoollaarr ((lliikkee)),, aanndd rreeppeell PPoollaarr ((ooppppoossiitteess)).. • SSaammee PPrriinncciippllee iiss aapppplliieedd wwhhiillee sseelleeccttiinngg ccoolluummnn ssttaattiioonnaarryy pphhaassee && mmoobbiillee pphhaassee ffoorr ccoommppoouunndd rreetteennttiioonn.. PPoollaarriittyy RRuulleess
  81. 81. PPoollaarriittyy
  82. 82. PPoollaarriittyy OOff SSttaattiioonnaarryy && MMoobbiillee PPhhaassee
  83. 83. PPoollaarriittyy OOff SSaammppllee AAnnaallyyttee
  84. 84. PPrriinncciipplleess OOff SSeeppaarraattiioonn
  85. 85. PPrriinncciipplleess OOff SSeeppaarraattiioonn
  86. 86.  CCoommppeettiittiivvee ppoollaarr iinntteerraaccttiioonnss • TThhee mmoorree ppoollaarr ccoommppoonneenntt,, tthhee mmoorree ssttrroonnggeerr,, iitt wwiillll bbee aaddssoorrbbeedd aanndd ssoo rreettaaiinneedd lloonnggeerr..  PPhhyyssiiccaall aaddssoorrppttiioonn iiss aa ddyynnaammiicc rreevveerrssiibbllee pprroocceessss..  PPoollaarr ((ssppeecciiffiicc bbuutt nnoonniioonniicc)) iinntteerraaccttiioonnss ooff aannaallyyttee wwiitthh ppoollaarr aaddssoorrppttiioonn ssiitteess ((SSiiOOHH,, --NNHH22,, --CCNN,, DDiiooll)) ccaauussee iittss rreetteennttiioonn  DDiiffffeerreenntt ssoorrppttiioonn aaffffiinniittiieess bbeettwweeeenn aannaallyytteess rreessuulltt iinn tthheeiirr sseeppaarraattiioonn • MMoorree ppoollaarr aannaallyytteess rreettaaiinneedd lloonnggeerr • AAnnaallyytteess wwiitthh llaarrggeerr nnuummbbeerr ooff ppoollaarr ffuunnccttiioonnaall ggrroouupp aarree rreettaaiinneedd lloonnggeerr • SSttrruuccttuurraall iissoommeerrss aarree oofftteenn sseeppaarraatteedd RReetteennttiioonn MMeecchhaanniissmm IInn NNPPCC
  87. 87. PPrriinncciipplleess OOff SSeeppaarraattiioonn
  88. 88. PPrriinncciipplleess OOff SSeeppaarraattiioonn
  89. 89.  NNoonn ppoollaarr ((nnoonnssppeecciiffiicc)) iinntteerraaccttiioonnss ooff aannaallyyttee wwiitthh hhyyddrroopphhoobbiicc aaddssoorrbbeenntt ssuurrffaaccee ((--CC1188,, CC88,, PPhheennyyll,, CC44))  DDiiffffeerreenntt ssoorrppttiioonn aaffffiinniittiieess bbeettwweeeenn aannaallyytteess rreessuullttss iinn tthheeiirr sseeppaarraattiioonn • MMoorree ppoollaarr aannaallyytteess rreettaaiinneedd lleessss • AAnnaallyytteess wwiitthh llaarrggeerr hhyyddrroopphhoobbiicc ppaarrtt aarree rreettaaiinneedd lloonnggeerr • AAllmmoosstt nnoo sseeppaarraattiioonn ooff ssttrruuccttuurraall iissoommeerrss  NNoonnssppeecciiffiicc ((hhyyddrroopphhoobbiicc)) iinntteerraaccttiioonnss aarree aatt lleeaasstt tteenn ttiimmeess wweeaakkeerr tthhaann ppoollaarr • SSmmaallll ddiiffffeerreenncceess iinn ccoommppoonneenntt mmoolleeccuullaarr ssttrruuccttuurree ccoouulldd hhaavvee aa ssiiggnniiffiiccaanntt eeffffeecctt iinn tthheeiirr rreetteennttiioonn RReetteennttiioonn MMeecchhaanniissmm IInn RRPPCC
  90. 90. PPrriinncciipplleess OOff SSeeppaarraattiioonn
  91. 91.  Normal Phase Chromatography • Retention by interaction between polar stationary phase and polar sample molecules using non polar mobile phase. PPrriinncciipplleess OOff SSeeppaarraattiioonn
  92. 92.  Reversed Phase Chromatography • Retention by interaction between non polar hydrocarbon chain of stationary phase and non polar part of sample molecules using polar mobile phase. PPrriinncciipplleess OOff SSeeppaarraattiioonn
  93. 93. PPrriinncciipplleess OOff SSeeppaarraattiioonn
  94. 94. SSuummmmaarryy OOff SSeeppaarraattiioonn MMooddeess
  95. 95. PPrrooppeerrttiieess NNoorrmmaall PPhhaassee RReevveerrsseedd PPhhaassee PPoollaarriittyy OOff SSttaattiioonnaarryy PPhhaassee hhiigghh llooww PPoollaarriittyy OOff mmoobbiillee PPhhaassee llooww hhiigghh SSaammppllee eelluuttiioonn oorrddeerr LLeeaasstt ppoollaarr ffiirrsstt MMoosstt ppoollaarr ffiirrsstt RReetteennttiioonn ccaann bbee IInnccrreeaassiinngg ssuurrffaaccee ooff iinnccrreeaasseedd bbyy ssttaattiioonnaarryy pphhaassee IInnccrreeaassiinngg ssuurrffaaccee ooff ssttaattiioonnaarryy pphhaassee IInnccrreeaassiinngg ooff nn--aallkkyyll cchhaaiinn lleennggtthh ooff ssttaattiioonnaarryy pphhaassee RReedduucciinngg ppoollaarriittyy ooff mmoobbiillee pphhaassee IInnccrreeaassiinngg ppoollaarriittyy ooff mmoobbiillee pphhaassee Properties OOff NNoorrmmaall && RReevveerrsseedd PPhhaassee RReedduucciinngg wwaatteerr ccoonntteenntt ooff mmoobbiillee pphhaassee ((wwiitthh nnoonn ppoollaarr eelluueenntt)) IInnccrreeaassiinngg ppoollaarriittyy ooff RReedduucciinngg ppoollaarriittyy ooff
  96. 96. Q : Find out polarity index of Methanol : Water : ACN  60: 20: 20 Polarity index of methanol= 5.1 Polarity index of water= 9.0 Polarity index of ACN= 5.8 Polarity index of mobile phase= PaPb + PcPd + PePf Pa= Polarity Index of methanol Pb= Ratio Of Methanol Pc= Polarity Index of water CCaallccuullaattiioonn Pd= FFoorr Ratio PPoollaarriittyy Of Water IInnddeexx Pe= Polarity Index of ACN Pf= Ratio Of ACN
  97. 97. Ans : Polarity Index Of Mobile Phase = (5.1)(0.6) + (9.0)(0.2) + (5.8)(0.2) = 3.06 + 1.8 + 1.16 = 6.02 Q : Prepare two mobile phases which polarity index is less than 6.02 and more than 6.02. CCaallccuullaattiioonn FFoorr PPoollaarriittyy IInnddeexx
  98. 98. CCoolluummnnss
  99. 99.  Analytical Scale: • High Performance Liquid Chromatography (HPLC) provides analytical data as to what compounds were present in a sample, and their concentration.  Preparative Scale: • HPLC can also supply a purified quantity of each compound that is collected in a “ Fraction ” of the flow output from the Detector. • The instrument component that performs this function is called a “Fraction Collector”. • This process is called “Preparative Chromatography”. HHPPLLCC SSccaalleess ((AAnnaallyyttiiccaall // PPrreeppaarraattiivvee))
  100. 100. PPrreeppaarraattiivvee HHPPLLCC
  101. 101.  MMaaiinnllyy uusseedd ttoo mmeeaassuurree tthhee ccoonncceennttrraattiioonn ooff ccoommppoonneennttss pprreesseenntt iinn ssaammppllee.. DDeetteeccttoorrss uusseedd ddeeppeennddss uuppoonn tthhee pprrooppeerrttyy ooff tthhee ccoommppoouunnddss ttoo bbee sseeppaarraatteedd.. DDiiffffeerreenntt ddeetteeccttoorrss aavvaaiillaabbllee ffoorr HHPPLLCC aarree:: • UUVV//VVIISS  FFiixxeedd wwaavveelleennggtthh  VVaarriiaabbllee wwaavveelleennggtthh ((iinncclluuddiinngg PPDDAA)) • RReeffrraaccttiivvee IInnddeexx ((RRII)) • FFlluuoorreesscceennccee • EElleeccttrroocchheemmiiccaall ((EECCDD)) • OOtthheerrss ((CCoonndduuccttiivviittyy,, MMaassss ssppeeccttrroommeetteerr,, EELLSSDD)) DDeetteeccttoorrss
  102. 102.  HHiigghh sseennssiittiivviittyy  NNeegglliiggiibbllee bbaasseelliinnee nnooiissee  LLaarrggee lliinneeaarr ddyynnaammiicc rraannggee  RReessppoonnssee iinnddeeppeennddeenntt ooff vvaarriiaattiioonnss iinn ooppeerraattiinngg ppaarraammeetteerrss ((pprreessssuurreess,, tteemmppeerraattuurree,, ffllooww--rraattee……eettcc..))  RReessppoonnssee iinnddeeppeennddeenntt ooff mmoobbiillee pphhaassee  LLooww ddeeaadd vvoolluummee  NNoonn--ddeessttrruuccttiivvee  SSttaabbllee oovveerr lloonngg ppeerriiooddss ooff ooppeerraattiioonnss..  SSeelleeccttiivvee CCrriitteerriiaa FFoorr DDeetteeccttoorrss
  103. 103. DDeetteeccttoorrss
  104. 104.  Selective detection minimizing effects from other components.  High sensitivity detection at maximum absorption wavelength.  Most frequently used detector in HPLC analysis  Compounds must contain a UV absorbing chromophore  Must work in the linear range of Beer’s Law.  It can be operated at fixed wavelength and variable wavelength. UUVV//VViissiibbllee ddeetteeccttoorr
  105. 105. BBaassiiccaallllyy ddeetteeccttoorr ccoonnssiissttss ooff aa ffllooww--cceellll tthhrroouugghh wwhhiicchh tthhee mmoobbiillee pphhaassee aanndd rreessoollvveedd ssaammppllee mmoovveess.. ooppttiiccss sshhiinnee tthhrroouugghh tthhee ddeetteeccttoorr cceellll aanndd vvaarriiaattiioonn iinn ooppttiiccaall pprrooppeerrttiieess aarree ddeetteecctteedd.. DDeetteeccttoorr FFllooww CCeellll
  106. 106. DDeetteeccttoorr FFllooww CCeellll
  107. 107. RRaaddiiaattiioonn SSoouurrccee
  108. 108. UUVV // VViissiibbllee SSppeeccttrroopphhoottoommeetteerr
  109. 109. EEffffeecctt ooff WWaavveelleennggtthh OOnn CChhrroommaattooggrraamm
  110. 110. EEffffeecctt ooff WWaavveelleennggtthh OOnn CChhrroommaattooggrraamm
  111. 111. PPhhoottoo DDiiooddee AArrrraayy
  112. 112.  AAnnaallyyttee aabbssoorrbb aatt ddiiffffeerreenntt wwaavveelleennggtthh ((fflleexxiibbiilliittyy ooff ddeetteeccttiioonn))  NNeeeedd ttoo vveerriiffyy ppeeaakk hhoommooggeenneeiittyy ((""ppeeaakk ppuurriittyy""))  NNeeeedd ooff UUVV ssppeeccttrroossccooppyy ddaattaa • ffoorr lliibbrraarryy iiddeennttiiffiiccaattiioonn • FFoorr ffaasstteerr mmeetthhoodd ddeevveellooppmmeenntt RReeaassoonnss FFoorr UUssiinngg PPDDAA
  113. 113.  FFiirrsstt HHPPLLCC ddeetteeccttoorr ddeevveellooppeedd  TTyyppiiccaallllyy rreeffeerrrreedd ttoo aass UUnniivveerrssaall ddeetteeccttoorrss..  DDeetteeccttss aallll ddiissssoollvveedd ssoolluutteess-- ““nnoonn--ssppeecciiffiicc””..  RRII rreessppoonnssee ddeeppeennddss oonn tthhee ddiiffffeerreennccee iinn RRII bbeettwweeeenn mmoobbiillee pphhaassee aanndd ssoolluuttee((ss))..  SSeennssiittiivviittyy rreeaacchheess mmaaxxiimmuumm wwhheenn RRII ddiiffffeerreenncceess aarree ggrreeaatteesstt..  CCaann ddeetteecctt mgg lleevveell bbuutt oonnllyy ffoorr iissooccrraattiicc rruunnss..  CCoommmmoonnllyy uusseedd ffoorr:: SSuuggaarrss,, PPoollyymmeerrss aanndd FFaattttyy AAcciiddss RRII ddeetteeccttoorr
  114. 114. RRII ddeetteeccttoorr
  115. 115. CCoommppaarriissoonn bb//ww UUVV && RRII DDeetteeccttoorr
  116. 116.  IInnccrreeaasseedd SSeelleeccttiivviittyy aanndd SSeennssiittiivviittyy  AAnnaallyytteess nnoott oonnllyy aabbssoorrbbss UUVV//VViiss rraaddiiaattiioonn bbuutt aallssoo rreelleeaasseess tthhee eenneerrggyy iinn tthhee ffoorrmm ooff lliigghhtt ooff lloonnggeerr wwaavveelleennggtthh..  SSeennssiittiivviittyy iiss iinn tthhee ppgg rreeggiioonn ((uupp ttoo 11000000xx UUVV))  ddeetteeccttoorr iiss vveerryy sseennssiittiivvee,, bbuutt iittss rreessppoonnssee iiss oonnllyy lliinneeaarr oovveerr aa rreellaattiivveellyy lliimmiitteedd ccoonncceennttrraattiioonn rraannggee..  MMaaiinnllyy uusseedd iinn ffoooodd iinndduussttrryy.. FFlluuoorreesscceennccee DDeetteeccttoorr
  117. 117. FFlluuoorreesscceennccee DDeetteeccttoorr
  118. 118.  GGeenneerraallllyy uusseedd ffoorr IIoonn CChhrroommaattooggrraapphhyy  DDeetteeccttss tthhee aabbiilliittyy ooff aannaallyyttee ttoo ccaarrrryy aa cchhaarrggee • ssoolluutteess aarree iioonniicc (( aacciidd aanndd bbaasseess)) • IInnoorrggaanniicc aanniioonnss aanndd ccaattiioonnss CCoonndduuccttiivviittyy DDeetteeccttoorr
  119. 119.  ““DDeessttrruuccttiivvee”” ddeetteeccttiioonn mmooddee  SSaammppllee iiss eeiitthheerr ooxxiiddiizzeedd oorr rreedduucceedd iinn tthhee cceellll..  HHiigghh sseennssiittiivviittyy wwiitthh ppiiccooggrraamm ((1100--1122 ggrraammss)) ttoo hhiigghh ffeemmttooggrraamm ((1100--1155 ggrraammss)) rraannggee..  PPrrooppeerr sseelleeccttiioonn ooff bbuuffffeerr,, eelleeccttrrooddee aanndd vvoollttaaggee iiss ccrriittiiccaall ttoo ssuucccceessss aass wweellll aass ccoonnddiittiioonniinngg tthhee mmoobbiillee pphhaassee.. EElleeccttrroocchheemmiiccaall DDeetteeccttoorr
  120. 120. RReeffeerreennccee EElleeccttrrooddee WWoorrkkiinngg EElleeccttrrooddee AAnnaallyyttee iiss ooxxiiddiizzeedd oorr rreedduucceedd EElleeccttrroollyyttee ((mmoobbiillee pphhaassee)) AAuuxxiilliiaarryy EElleeccttrroodd ee EElleeccttrroocchheemmiiccaall DDeetteeccttoorr
  121. 121. RRII UUVV//VVIISS FFlluuoorr.. EECCDD CCoonndd.. RReessppoonnssee UUnniivveerrssaall SSeelleeccttiivvee DDeetteeccttoorrss ((CChhrroommoopp hhoorree)) SSeelleeccttiivvee ((FFlluuoorroopphh oorree)) SSeelleeccttiivvee ((OOxxiiddaattiioonn oorr RReedduuccttiioonn )) SSeelleeccttiivvee ((IIoonnss)) SSeennssiittiivviittyy mggrraamm nnaannooggrraamm ppiiccooggrraamm ppiiccooggrraamm ppiiccooggrraamm LLiinneeaarr 110044 110055 110033 110066 110055 RRaannggee FFllooww SSeennssiittiivviittyy YYeess NNoo NNoo YYeess YYeess TTeemmpp.. SSeennssiittiivvee YYeess NNoo NNoo YYeess YYeess
  122. 122. DDeetteeccttoorrss
  123. 123.  PPrroocceessss tthhee ddeetteeccttoorr oouuttppuutt aanndd iinntteeggrraattee iitt ttoo ffoorrmm aa mmeeaanniinnggffuull cchhrroommaattooggrraamm..  MMooddeemm IInntteeggrraattiioonn ssyysstteemm ddoo mmoorree tthhaann jjuusstt tthhaatt..  TThheeyy ddoo pprroocceessssiinngg ooff tthhee cchhrroommaattooggrraamm,, ccaallccuullaattiioonnss,, ssttaattiissttiiccaall aannaallyyssiiss,, ddaattaa bbaacckk--uupp aanndd ssttoorraaggee..  DDaattaa SSyysstteemmss aallssoo ccoonnttrrooll vvaarriioouuss ppaarraammeetteerrss ooff tthhee ssyysstteemm..  TThhaannkkss ttoo tthheessee aaddvvaanncceedd ssyysstteemmss tthhaatt wwee nnoo lloonnggeerr hhaavvee ttoo ccuutt cchhrroommaattooggrraamm ppeeaakkss aanndd wweeiigghh tthheemm oonn aannaallyyttiiccaall bbaallaanncceess ffoorr iinntteerrpprreettaattiioonn!! DDaattaa SSyysstteemmss
  124. 124. TThhaannkk YYoouu
  125. 125. Mechanical Separation Power:
  126. 126. Mechanical Separation Power:
  127. 127. Common Column Problems and Remedies Three most important problems in HPLC method development:  Variability in retention and resolution  Band tailing  Short column lifetime Retention and resolution irreproducibility • Sample retention should be repeatable from run to run • It is important to check column retention during method development at least daily, using a particular set of conditions • Values of K and a should not change by more than 2-3% over time.
  128. 128. Retention and Resolution Variations in HPLC Effect Cause Column-column Variation in support, bonding differences Column changes during use Disturbance in bed, loss of bonded phase, dissolution of silica support, buildup of non-eluted material Extra-column effects From system to system: large injn. Volume, large tubing volume between. injection valve and column Poor control of separation Changes in mobile phase composition, flow rate and temp. Column overload Too large a sample mass
  129. 129. Solutions to the Irreproducibility Problems  Initially select a good column of less-acidic highly purified support (if silica based) and maintain other column parameters same throughout the application  Eliminate chemical or silanol effects for silica-based columns by using favourable mobile phase conditions.  Equilibrate the column with proper mobile phase  Use proper laboratory techniques that ensure stable day-to- day operation.  Ensure continuing supply of the same column.
  130. 130. Causes of Tailing (Asymmetrical) Peaks Bad column: An initial bad column (poorly packed). Plugged frit or void. Sample overload Wrong solvent for sample Extra column effects Chemical or secondary retention (silanol) effects Inadequate buffering Contaminating heavy metals
  131. 131. Short column lifetime Columns degrade for several reasons: Partially blocked (plugged) frit or column bed Adsorbed sample impurities (garbage). Initially poorly packed columns Mechanical or thermal shock creating voids Chemical attack on the stationary phase Symptoms of impending column death: Column backpressure increase Tailing bands Loss in plate number Loss of selectivity Copyright © 2008, Advance Analytical Research & Training Institute