Métodos de estudio de la
biología molecular
Introducción
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METODOS DE BIOLOGIA
MOLECULAR
Como les decía, la biología molecular se entretiene estudiando moléculas,
especialmente 2, p...
Electroforesis trabaja con electricidad,
cátodo y ánodo, con diferencia de
potencial eléctrico por electrodo
circula corri...
Otro método que es más simple y rápido es un método eléctrico, se pone todo
en un sistema eléctrico y así las moléculas de...
molécula estará marcada radioactivamente y esa reacción con la molécula
se le pone al papel y se marcara solo la que tenga...
Lo otro es la cromatografía de columna, es
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donde queramos, que se puede hacer?
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Otra tecnología importante es el uso de genes reporteros, ustedes saben
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Otra tecnología importantísima es el PCR
Fue creada por kary mullis gano el nobel con 20mil dólares, y vendió la patente
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métodos de estudio en biología molecular

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métodos de estudio en biología molecular

  1. 1. Métodos de estudio de la biología molecular Introducción De acuerdo a lo que nos hemos dado cuenta hemos visto con diferentes profes todo el desarrollo con una serie de temas relacionados con biología celular, constitución química, moléculas inorgánicas y orgánicas haciendo estructuras de mayor nivel y aparecen las partes de la célula , membrana , citoplasma, citoesqueleto, y con otros profesores vieron aspectos relacionados con el citoplasma membranoso núcleo y cromosomas y en las ultimas clases la diferenciación y procesos de meiosis y especificación de las células para cumplir su función específica en los seres vivos. Con eso más o menos esta completo respecto a célula. Pero esto es también molecular, asique daremos nociones (no es un curso de biología molecular) como funciona y trabaja con sus principales aspectos, con este tan importante boom de la biología molecular, metodologías para obtener la información necesaria, y en la próxima clase para ácidos nucleídos y proteínas involucradas directamente en biología molecular. Finalizando con la aplicación de estas técnicas a los diferentes seres vivos que constituyen la biotecnología y terapia génica. Solo saber que existen y como funciona.
  2. 2. METODOS DE BIOLOGIA MOLECULAR Como les decía, la biología molecular se entretiene estudiando moléculas, especialmente 2, proteínas y ácidos nucleídos, por ende las metodologías están dirigidas a estudiar estas 2 moléculas, una de estas 2 metodologías importantes son las que tienen que ver con la separación con las diferentes moléculas de un organismo, ya que en un organismo hay miles de proteínas aquí se separan y se estudian en forma única para reconocer y manipular sus características en forma específica, que es la ELECTROFORESIS eso es una cámara típica, es vertical, porque la muestra corre de arriba hacia abajo, hay otras que son horizontales, esto separa diferentes moléculas sea proteína o acido nucleído, se hace por medio de un gel, que es una estructura que físicamente está entre solido y liquido, lo disolvemos y según su concentración es duro o blando, dependiendo del tipo de sustancia que tenemos que separar, si son muy grandes el gel tiene que ser lo más blando posible con espacio grandes entre sus moléculas para que las otras moléculas puedan pasar. Si son chicas el gel tiene que ser más concentrado, entonces el gel depende de la concentración para ver que separar.
  3. 3. Electroforesis trabaja con electricidad, cátodo y ánodo, con diferencia de potencial eléctrico por electrodo circula corriente por el buffer, por ahí pasan los iones de ahí los electrones pasan por el gel y de ahí al otro buffer llegando al ánodo haciendo el recorrido, con esa circulación las partículas del gel empiezan a movilizarse según peso. Si son positivas se van al polo negativo, y si son negativas van al ánodo. Hay que hacer algo para que todas las muestras sean negativas, “WELLS” pocillos para poner la muestra (la rafa lo pregunto *o*) Para que todas las moléculas sean negativas se tratan con una sustancia que las carga negativamente, SDS se pega a las moléculas de proteína y todas las proteínas están cargadas negativamente, y así corren al polo positivo. Una vez que el gel ha corrido y las moléculas de acuerdo al tamaño se posicionan, las mas chicas corren mas y pasan por los orificios y las más grandes solo pasan por los orificios grandes y así se quedan más atrás y se demoran más tiempo. Una vez que se separan las moléculas hay que moverlas del gel porque ya el proceso siguiente es manipular esas bandas que se generaron y manipular un gen es difícil es quebradizo y resbaladizo, lo más probable es que se caiga, para que evitar eso se hace otro proceso en el cual se traspasa desde el gel hacia un papel de nitrocelulosa. Este papel tiene la capacidad de absorber acido nucleído y proteínas, entonces si lo colocamos pegado al papel de nitrocelulosa y hacemos circular agua, es algo simple y barato, de manera que el buffer pasa por el gel y lleve las moléculas al papel de nitrocelulosa, arriba de ese hay papel absorberte normal
  4. 4. Otro método que es más simple y rápido es un método eléctrico, se pone todo en un sistema eléctrico y así las moléculas del gel se van al papel. De esa manera se obtiene que todo quede en el papel de nitrocelulosa y el gel queda sin nada, ese papel es mucho mas manipulable, tiene las bandas de las moléculas igual que el gel igual eso se puede trabajar para reconocer que tipo de moléculas son las diferentes bandas que se generaron. Si busco algo especifico lo podemos hacer con anticuerpos, si queremos saber la insulina ponemos en la bolsa el anticuerpo anti insulina y luego se reconocerá la banda marcada, una es por anticuerpos Lo interesante y general del procedimiento es que podemos tener en forma separada moléculas especificas esa es su capacidad, de un conjunto de una célula o tejido en forma única limpia y separada una de otra Así podemos hacer varias cosas podemos diluir, cortamos y diluimos la proteína en un buffer o bien cortamos el papel de micro celulosa y lo diluimos en tubo de ensayo y ahí está la proteína o acido núcleos que se necesita. Northen blot reconoce la presencia de ácidos ribonucleicos ARN los marca con acido desoxirribonucleico, se pone un gel papel y se marca, esa marcación se hace con radio actividad, una molécula de ADN con radioactividad reacciona con el papel. Reaccionara solo moléculas parecidas que tengas bases complementarias esas bases complementarias se unirán en el papel y verán la radioactividad del papel. Esa banda son los ácidos nucleídos que andamos buscando. Se buscan con acido desoxirribonucleico mas por ejemplo carbono 14 , algo radioactivo, Se verá solo que esta marcado. Se prepara la secuencia y se maca con carbono 14, entonces esa
  5. 5. molécula estará marcada radioactivamente y esa reacción con la molécula se le pone al papel y se marcara solo la que tenga la secuencia complementaria, y así la molécula se pegara, si no la tiene simplemente no se pega no hay complementariedad, y ahí aparecerá la banda. Porque esa está marcada,. Otra tecnología utilizada de separación es la CROMATOCRAFIA se usan sistemas simples, en que simplemente es una probeta, que se pone una sustancia que es un polvo blanco y sobre el una mezcla de sustancias, esa mezcla tiene diferentes compuestos y algunos de esos compuestos tendras afinidad mayor o menor con la sustancia que hay en la columna, las que no tengan ninguna afinidad pasaran rápidamente, eso pasa rápidamente y sale primero, lo que sea de mayor tamaño o mas afinidad se demorara mas y saldrá en segundo lugar, y si hay otra más grande o mas afín saldrá en tercer o cuarto dependiendo el numero de moléculas de la mezcla. Lo principal es colocar la mezcla ahí arriba y se separa, La idea es tener compuestos distintos de un volumen mas o menos grandes. Unos 100ml. Pero a veces la muestra son unos pocos micro litros o 1 o 2 ml. De ahí se usan otros métodos., Cromatografía en papel, en esas manchas se ponen las mezclas de diferentes compuestos unos mas grandes o pequeños con mas o menos carga y se ponen en forma coloreada, marcando en colores, se ponen las gotas en un trozo de papel con un solvente que puede ser alcohol o acetona dependiendo que queremos separar, cuando ponemos papel en el liquido el liquido sube por capilaridad llegando a las manchas arrastrándolas los mas pesados se quedan atrás y los livianos suben y al final hay como un arcoíris pasando los conjuntos de moléculas y tenerlos individualmente, se corta el papel y se tendrá esa molécula específicamente.
  6. 6. Lo otro es la cromatografía de columna, es una técnica bastante desarrollada , hay diferentes tipos de cromatografía, la parte básica es una columna de vidrio o de lo que sea, pero el principio es el mismo, ocurre que en la columna de vidrio se coloca una matriz es una sustancia generalmente solida partículas muy pequeñas en polvo y gránulos dependiendo del tipo de matriz porque hay una que separa sustancias eléctricamente que separan por tamaño que separan que no están cargadas eléctricamente etc. Consiste en que la muestra que es una mezcla de varias moléculas se colocan en la superficie de la matriz y se hace pasar a través de ella generalmente de un solvente. Esta mezcla pasa a través de la matriz y las diferentes moléculas tienen diferente afinidad por la matriz, abran unas que se retrasan o que van más rápido. Y al final se van separando de manera que la roja sale primero luego la verde y luego la negra se queda pegada al sistema de esa manera recogeremos las sustancias prácticamente puras, porque es muy difícil que existan 2 moléculas iguales. El sistema puede ser de intercambio iónico es decir que la matriz en la columna está cargada positivamente, aquellas que no tienen carga pasan sin fijarse, las que tienen carga positiva se repelen y pasan positivamente y las negativas se pegan, esas se quedan adheridas a la matriz, entonces solo quedaran las moléculas rojas , se agrega un buffer y se sueltan. También puede ser que la columna tenga partículas en la matriz con partículas con espacios de manera que las moléculas pasan por esos espacios y eso muestra que las que pasan por ahí se demoraran mas entonces es una separación por tamaño, cromatografía de filtración en gel Y por último la de afinidad es cuando está marcada por anticuerpo, la separación acá es especifica solo se pega el antígeno, lo único que se pegara ahí es la insulina. Luego con el buffer se obtiene la insulina en un tubo.
  7. 7. Otro procedimiento bastante utilizada ahora es el sistema MICROARRAYS o micro ordenadores, esa tecnología es un sistema que utiliza básicamente unas tarjetitas con weas pequeñas donde se ponen las mezclas, en volúmenes no más de 5 o 10microlitros, y en esos orificios se hacen reacciones, compuestos necesarios para que reacciones y den algún color Luego en la tarjeta se verán diferentes colores , en cada uno de los orificios se coloca en la parte de abajo un trozo de ADN o ARN , eso se llaman oligos porque son moléculas chicas de 8 y 20 bases no mas, entonces esos oligos tienen la característica de que se les coloca una secuencia de bases que es la que nosotros queremos reconocer , si queremos reconocer si hay o no un ADN modificado como la de la muestra del ratón ,o si hay un ADN que tiene que ver con cáncer, entonces se sabe la secuencia, y si queremos saber la presencia o ausencia ponemos la secuencia mas característica, sacamos ese ADN y lo marcamos con radioactividad o fluorescencia debería traer la secuencia complementaria, es decir en el oligo esta la complementaria y se pegan por lo tanto ese ADN queda pegado en el fondo del orificio si no la tiene no se pega y cuando se lava se sale,. Y no abran marcas y si se pega abra marcas y el color rojo en los orificios es la marca en el ADN. En ese tipo de tecnología se pueden hacer para hacer muchas cosas, el microarray a dado mucha información respecto a composición de ácidos nucleícos de diferentes componentes en los seres vivos.
  8. 8. Otra tecnología es la FISH “Florence in situ hybridization” Estudio de cromosomas si hay una secuencia especifica en un cromosoma específico. Hay que obtener células para sacar el cromosoma, ese cromosoma con dna tiene secuencias de nucleótidos, si queremos reconocer alguna secuencia especifica hacemos un oligo especifico pero complementario. Con esa secuencia marcada con fluorescencia se hace la reacción con esa molécula con el cromosoma, y la región en donde esta esa secuencia se marca, viendo la fluorescencia en el cromosoma y esa secuencia esta, se observa el cromosoma completo o regiones chicas, como enzimas, donde reaccionara el oligo? En aquella región que tendrá la secuencia complementaria. También pueden marcarse sin buscar un gen específico, esperamos encontrar para cualquier gen 2 cromosomas y si hay 3 hay porque hay problemas (trisomia) Una de las herramientas claves que ha tenido la responsabilidad del desarrollo de la biología molecular, son las enzimas de restricción, son unas proteínas que están en las bacterias, estas son enzimas, de restricción. Porque cortan las moléculas de ADN en ciertas regiones especificas, las bacterias las usan para romper las proteínas que ingresan los virus, cuando los virus la infecta la bacteria hace la proteína y así corta la proteína del virus, así sacaron las proteínas de las bacterias y vieron la especificidad, cortan secuencias especificas, una proteína no la corta la pepsina en el estomago, no la corta en cualquier lugar sino que elige en una secuencia de aminoácidos especifico.
  9. 9. EcoR1 corta entre G y A de esa manera podemos elegir la enzima para cortar donde queramos, que se puede hacer? Uno de los tantos uso de las enzimas de restricción es el de insertar trozos de dna complementario en el plásmido que es un ADN extra celular de la bacteria, se abre el plásmido con la secuencia pegajosa libre, por ende si querernos ponerle otro trozo de ADN echo o sacado de otra célula , como la insulina 150 nucleótidos, y en los extremos le ponemos la secuencia complementaria que corto ecor1 y con ligasa se pegan y se les une al plásmido y queda con DNA recombinante que es la mezcla del dna de plásmido con el dna extraño. Que no es la de la bacteria, Pero el sistema es universal, entonces cuando coloquemos el plásmido en la bacteria lo reconocerá como propio y hará insulina. Una vez que se ha producido el dna recombinante se pone en el interior de la bacteria esta la reconoce como si fuera propio y empieza a dividirse y a producir la proteína que el trozo de ADN le permite hacer.
  10. 10. Otra tecnología importante es el uso de genes reporteros, ustedes saben que las proteínas son 30.000 en mamíferos, si hay 5 coloreados son mucho, hemoglobina es de color rojo y se seguimos buscando es difícil buscar proteínas con color. Entonces en nuestras preparaciones será difícil saber si hay o no hay proteína porque no se ve nada, como la albumina con agua no se ve nada, entonces hay que hacer una reacción específica para colorearla. Entonces el gen reportero tiene como finalidad permitir la identificación la identidad de determinados genes para ver si están o no están presentes, estos son secuencias que pueden generar proteínas coloreadas, se colocan en forma siguiente al gen que queremos estudiar., que ocurrirá? Que el gen que tiene para proteína X le ponemos después el gen reportero que son chicos producirá una proteína coloreada ya que la proteína x no tiene color. Pero siempre irán juntas, en cualquier experimento la proteína estará en la cantidad y lugar que esta la proteína reportera, entonces si esta gen reportero esta la proteína, solo interesa que diga si está o no y en qué cantidad. Un gen reportero muy utilizado es la proteína fluorescente verde. Que se extrajo de una medusa que es chica como 50-60 entonces es un gen pequeño de 100 y algo bases. Que produce una proteína de color verde fluorescente, entonces si lo ponemos al lado de uno que estamos estudiando veremos cómo reacciona, se agregan secuencias hasta que coincidan. Es una molécula que nos permite ubicar lo que queremos con mucha facilidad
  11. 11. Otra tecnología importantísima es el PCR Fue creada por kary mullis gano el nobel con 20mil dólares, y vendió la patente por 300.000.000 . aweonao. Es importante porque permite hacer dna a partir de una muestra muy pequeña, lo hace por 3 cosa: desnaturacion, annealing de primers y luego la extensión. Básicamente esa técnica fue posible porque ese científico estudio una polimerasa, que trabaja a temperatura muy altas sobre 90ºC, eso dice que las bacterias tienen moléculas que trabajan a esa temperatura ese fue el descubrimiento el tomo las enzimas y las utilizo en ese procedimiento porque la desnaturacion del dna tiene que ser a 94ªc que es donde se separan los enlaces de hidrogeno y quedan las 2 cadenas complementarias separadas, luego la otra es a 54ªc donde trabaja la polimerasa, y luego es a 72ºC todas las reacciones son bastante altas, Cualquier polimerasa se desnaturaria entonces tiene que ser esa polimerasa especifica. Puede partir teóricamente de una molécula de dna.
  12. 12. Separar en el paso 1, luego en el annealing se ponen los primer que son los trozos de dna que queremos reproducir El primer es lo mismo que en el caso de los mircroarrays que son entre 8 y eo nucleótidos con secuencia específica para saber si hay o no, tendremos el dna de una célula x ,tenemos que replicar un trozo determinado de ese dna, Se pone una secuencia de la región en un lado y luego en la cadena complementaria. Así se acota el trozo. Porque cuando coloquemos el primer será la secuencia complementaria de eso. Se pegara justo ahí, porque ahí está su secuencia complementaria. ¿Y donde se pega el otro primer? Ocurrirá que empieza a formarse la molécula ahí en cada extremo de las hebras, y en la tercera etapa en la extensión lo que continua haciendo la polimerasa es seguir poniendo los nucleótidos después del primer, hasta que encuentre la otra y cuando se encuentran las 2 se termina la síntesis. Con eso lo que estamos haciendo es seleccionar el trozo de dna que se quiere reproducir. Eso se realiza muchas veces 1 a 2 a 4 a 8 y así 2^35 en 140 minutos 2horas 20 minutos hay esa cantidad de copias que es lo que ocurre
  13. 13. La secuenciación es saber el orden de los nucleótidos en la secuencia de ADN. La secuenciación es muy importante para saber que enzimas utilizar. El año 2000 se secuencio casi en 98% el genoma del ser humano, para eso se necesitaba esa técnica, cada vez se ha ido mejorando, secuencia el dna preparar el gel que toma un día, tomaba 2 días para la secuencia, ahora la secuenciación es muy tecnológica en donde simplemente se pone el dna en la maquina y esta hace todo. Se basa el procedimiento en que es muy similar de PCR, hay igual 3 etapas Se desnatura se corta a 94ºc y se separan las 2 cadenas Luego un annealing con primer para hacer el trozo de ADN que nos interesa, no nos interesa todo el ADN solo partes especificas En la tercera etapa (extencion) está la diferencia, con el PCR se pone ddntp`s solo nucleótidos mientras que en la secuenciación se usa una mezcla de nucletipos con dntp`s que significa?Una secuencia de nucleótidos de dna que es lo que se observa ahí, unidos por el oxigeno entre fosfato y azúcar, esa es dexosi porque es dexoxi ribosa, porque el carbono no tiene el oxigeno se le saco por eso es dexosi , entonces ese es el nucleótido que se agrega para la secuenciación para el PCR , que tiene un oh que no tiene el oxigeno porque es deoxi nucleótido para PCR. Pero en la secuenciación se agrega el deoxinucleotido y el dideoxinucleotido no tiene ninguno de los dos oxígenos. Porque es importante el deoxi = porque la unión es importante al oxígeno por eso tiene que tener el oh y si no lo tiene no se une y no hay reacción y cuando no lo tendrá? Cuando nosotros usemos la molécula de didexoxi. Cuando tenemos los deoxis hay reacción y entra otro tro tro pero si entra un dideoxi ahí se para la reacción porque no encontrara el oxigeno y se detiene la reacción. El dideoxi puede entrar en cualquier parte porque es al azar .al principio al medio o al final de la reacción. Significa que se van generando trozos de dna de diferente tamaño dependiendo en donde ingrese el dideoxi que terminan en un nucleótido determinado. Porque se ponen nucleótidos marcados diferente. Al final tendremos una mezcla de trozos de diferente tamaño de los ácidos nucleícos unos muy chicos y unos muy grandes. Y se les hace una electroforesis, ósea que pasan por el gel que se van separando de acuerdo a su tamaño que se separan según tamaño. El sistema actual que es automático hace una cosa así igual. Se ponen los nucleótidos en el gel y en el computador se obtiene la información, si sabemos el color del nucleótidos etc. se sabe la secuencia ddTTP ddGTP etc.

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