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Aplicaciones de la propagación masiva    de plantas. Molecular Farming              Dra. María Alejandra Alvarez          ...
Molecular Farming• Se define como una estrategia alternativa de producir  moléculas (proteínas, ácidos grasos) de aplicaci...
Ventajas• Bioseguridad• Maquinara de síntesis proteica eucarionte• Producción en condiciones controladas  (sistemas confin...
Aspectos críticos• Glicosilación: no siempre debe ser idéntica, hay estrategias para  resolverlo (humanización de glicopro...
Sistemas de producción• Planta a campo• Sistemas confinados (cultivos in           vitro,  invernáculos, piletas, hidropon...
Cultivos in vitro• Callos• Cultivos de órganos (raíces, tallos)   – Frascos agitados   – Bioreactores• Suspensiones celula...
Raíces transformadas             •Rápido crecimiento             •Estado de organización             •Estabilidad de produ...
Biorreactores para el cultivo de raíces     Bioreactor de lecho de goteo                                              Bior...
Suspensiones celulares• Frascos agitados  – Pequeños volúmenes  – Conocimiento del    sistema  – Estudios para escalado
Bioreactores• Volumen 1 -3000 litros• Producción en gran escala• Modelo acorde al sistema y  escala de producción
Tipos de bioreactores usados en       cultivos vegetales
Consideraciones para el diseño• Crecimiento y demanda de oxígeno• Estado de agregación y propiedades  reológicas• Sensibil...
Crecimiento y demanda de oxígeno• Tiempos de duplicación altos ( 20-100hs)   – BY-2: 12 hs   – NT-1, Xanthi: 18-24 hs• Tas...
Agregados-reología• Distribución de tamaños según la especie,  inóculo, medio de cultivo, tipo de bioreactor,  condiciones...
Sensibilidad a las fuerzas de corte• Tamaño celular (largo: 100- 500 µm , diámetro: 20-50 µm) mayor a  bacterias (diámetro...
Espuma/pared celular• En la fase de crecimiento exponencial• Exacerbada durante la fase estacionaria• Las células entrampa...
Estrategias para productos            intracelulares• Aumento de la tasa de crecimiento• Aumento de la concentración de bi...
Estrategias para productos            extracelulares• Mayor tasa de crecimiento• Mayor concentración de biomasa• Fase expo...
Tanques agitados                                                  Agitador de paletas planas o Rushton• Pros   –   Flexibi...
Neumáticos: burbujeo• Pros   –   Fácil de escalar   –   Bajos costos   –   Bajos riesgos de contaminación   –   Sin genera...
Neumáticos: airlift• Pros   – Direccionamiento del burbujeo   – Buena transferencia de oxígeno   – Menor shear stress, sin...
Wave®• Pros  – Shear stress  – Transferencia de oxigeno  – Costos operacionales• Cons  – Escalado  – Transferencia de calo...
De membrana• Pros   – Remoción de productos     extracelulares   – Bajo shear stress   – Bajos costos operacionales• Cons ...
Algunos ejemplos comercialesProducto             Sistema                     CompañíaVacunas aviares      Suspensiones cel...
Eco-PodReactor temporario para algas.Producción de biocombustibles.
Muchas gracias por su atención   malvarez@centromilstein.org.ar
Bioreactores xi 2009
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Bioreactores xi 2009

  1. 1. Aplicaciones de la propagación masiva de plantas. Molecular Farming Dra. María Alejandra Alvarez malvarez@centromilstein.org.ar Instituto de Ciencia y Tecnología Dr. César Milstein CONICET- Fundación Pablo Cassará Jornada de Actualización en Propagación Masiva de Plantas y sus Aplicaciones Buenos Aires 2 de noviembre 2009
  2. 2. Molecular Farming• Se define como una estrategia alternativa de producir moléculas (proteínas, ácidos grasos) de aplicación terapéutica o industrial en organismos transgénicos (animales, vegetales)• Los motores primarios de este desarrollo son economía, eficiencia y seguridad.• La demanda de USA de proteínas recombinantes se expande en un 13% por año.• Mercado actual: 50 mil millones de U$.• Mercado estimado en 2010: 10 mil millones de U$.
  3. 3. Ventajas• Bioseguridad• Maquinara de síntesis proteica eucarionte• Producción en condiciones controladas (sistemas confinados)
  4. 4. Aspectos críticos• Glicosilación: no siempre debe ser idéntica, hay estrategias para resolverlo (humanización de glicoproteínas).• Tiempo: optimización del esquema de producción• DSP: igual que para cualquier otra plataforma, se resuelve si el producto no requiere purificación, usando fusión a oleosinas o con cultivos in vitro (secreción al medio).• Rendimiento: Al menos 1% de proteína total soluble para ser competitivo con otros sistemas. Optimización a distintos niveles: ingeniería genética, actividad proteolítica, etc.
  5. 5. Sistemas de producción• Planta a campo• Sistemas confinados (cultivos in vitro, invernáculos, piletas, hidroponia, etc.)
  6. 6. Cultivos in vitro• Callos• Cultivos de órganos (raíces, tallos) – Frascos agitados – Bioreactores• Suspensiones celulares – Frascos agitados – Bioreactores
  7. 7. Raíces transformadas •Rápido crecimiento •Estado de organización •Estabilidad de producción
  8. 8. Biorreactores para el cultivo de raíces Bioreactor de lecho de goteo Bioreactor de lecho de niebla con malla para inmovilizar a las raíces (nutrient mist reactor) Inóculo Salida de aire Malla de inmovilización Adición de nutrientes peristáltica Rotámetro Filtro de aire Bomba Bomba de aire Generador de niebla Aire Aire Reservorio Intensidad Condensador On Off de niebla Cámara Controlador Bomba de cultivo Tomado de:Hairy Roots, Culture and Application, 1997.
  9. 9. Suspensiones celulares• Frascos agitados – Pequeños volúmenes – Conocimiento del sistema – Estudios para escalado
  10. 10. Bioreactores• Volumen 1 -3000 litros• Producción en gran escala• Modelo acorde al sistema y escala de producción
  11. 11. Tipos de bioreactores usados en cultivos vegetales
  12. 12. Consideraciones para el diseño• Crecimiento y demanda de oxígeno• Estado de agregación y propiedades reológicas• Sensibilidad a las fuerzas de corte• Formación de espuma/ pared celular
  13. 13. Crecimiento y demanda de oxígeno• Tiempos de duplicación altos ( 20-100hs) – BY-2: 12 hs – NT-1, Xanthi: 18-24 hs• Tasa de captación de oxígeno (OUR): 5-10 mmol- O2/l h (microorganismos: 10-90, células animales: 0.02-0.1 x 10-9)• A alta densidad celular, productividad volumétrica limitada por la transferencia de oxígeno.• Concentración de oxígeno disuelto crítica: 1.3 – 1.6 g m3, 20% saturación.• KLa en bioreactor: 10 – 50 hs -1 (microorganismos: 100-1000; células animales: 0.25-10), rango restringido.• Aireación: 0.5 – 1 vvm (neumáticos), 0.05-0.1 vvm (tanques agitados), altos niveles tóxicos.
  14. 14. Agregados-reología• Distribución de tamaños según la especie, inóculo, medio de cultivo, tipo de bioreactor, condiciones de cultivo, etc.• Gradiente de nutrientes y oxígeno en el interior de los agregados• Reología: varía a lo largo de la curva de crecimiento (redondeadas- elongadas).
  15. 15. Sensibilidad a las fuerzas de corte• Tamaño celular (largo: 100- 500 µm , diámetro: 20-50 µm) mayor a bacterias (diámetro < 1 µm), hongos (largo <100 µm, diámetro: 5- 10 µm), células animales ( diámetro: 10-100 µm)• Alto volumen de vacuolas (90% volumen total)• Pared celular rígida, no- flexible.• Alta sensibilidad durante la fase tardía de crecimiento exponencial y estacionaria temprana (elevado tamaño celular, elevado tamaño vacuolar)• Influye sobre: viabilidad, liberación al medio de compuestos intracelulares, cambios metabólicos, cambios morfológicos, patrones de agregación.• Valores de productividad menores a los de cultivos en frascos agitados
  16. 16. Espuma/pared celular• En la fase de crecimiento exponencial• Exacerbada durante la fase estacionaria• Las células entrampadas en la espuma tienen deficiencia de nutrientes y oxígeno: caída de la productividad• Crecimiento en pared, impeler, sensores.• Taponamiento de filtros de aire.• Estrategias posibles: menor velocidad de agitación y aireación, agregado de anti-espumas (0.01 % del V), por aeración de superficie o sin burbujeo, uso de disrruptor mecánico de espuma.
  17. 17. Estrategias para productos intracelulares• Aumento de la tasa de crecimiento• Aumento de la concentración de biomasa• Fase exponencial más extensa• Batch-/batch alimentado a alta densidad celular• Cultivo semi-continuo o continuo para evitar grandes agregados celulares y adhesión a superficies
  18. 18. Estrategias para productos extracelulares• Mayor tasa de crecimiento• Mayor concentración de biomasa• Fase exponencial más extensa• Batch, batch alimentado, perfusión en cultivos de alta densidad celular• Recuperación de producto in situ• Mayor estabilidad de proteínas por agregado de aditivos estabilizantes o inhibidores de proteasas.
  19. 19. Tanques agitados Agitador de paletas planas o Rushton• Pros – Flexibilidad – Altos coeficientes de transferencia de masa – Homogéneos – Aplicable a cultivos de alta densidad Agitador de paletas inclinadas – Permite trabajar en GMP• Cons – Sistema de mezclado (shear stress) – Costos – Generación de calor – Riesgos de contaminación en válvulas
  20. 20. Neumáticos: burbujeo• Pros – Fácil de escalar – Bajos costos – Bajos riesgos de contaminación – Sin generación decalor – Bajo shear stress• Cons – Transferencia de oxígeno pobre – Mezclado ineficiente en cultivos de alta viscosidad – Formación de espuma a alta aireación
  21. 21. Neumáticos: airlift• Pros – Direccionamiento del burbujeo – Buena transferencia de oxígeno – Menor shear stress, sin generación de calor – Menores tiempos de mezclado – Menores costos, sencillez de escalado, eficiente circulación de fluidos• Cons – Mezclado ineficiente en cultivos de alta viscosidad – Formación de espuma a alta aireación
  22. 22. Wave®• Pros – Shear stress – Transferencia de oxigeno – Costos operacionales• Cons – Escalado – Transferencia de calor – Estrategias operacionales avanzadas
  23. 23. De membrana• Pros – Remoción de productos extracelulares – Bajo shear stress – Bajos costos operacionales• Cons – Escalado – Oxigenación – Baja transferencia de calor – Monitoreo on- line
  24. 24. Algunos ejemplos comercialesProducto Sistema CompañíaVacunas aviares Suspensiones celulares de Dow AgroSciences tabaco (4-40 mg l-1)glucocerebrosidasa Suspensiones celulares de Protalix Biotherapeutics zanahoria (Fase III)paclitaxel Suspensiones celulares de Phyton Biotech TaxusIPLEX™ (macasermin Suspensiones celulares (2 Phyton Biotech+ Insmedrinfabato ) g l-1)
  25. 25. Eco-PodReactor temporario para algas.Producción de biocombustibles.
  26. 26. Muchas gracias por su atención malvarez@centromilstein.org.ar

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