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Biología molecular

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Biología molecular

  1. 1. 1 BIOLOGÍA MOLECULARGeneralidades♣La base química de la herencia es el ADN, este se encuentra organizado en genes .♣Esos genes codifican información , que es transcrita o copiada en forma de ARNm♣Es el ARNm quien se encarga de llevar la información para que sea traducida.♣Esos genes no funcionan de manera autónoma, son dependientes de la regulación por transducción deseñales y productos de los mismos genes.Antecedentes:Avery, MacLeod y McCarty (1944):El DNA contiene la información genética. Determinación genética del carácter (tipo) de la cápsula de unneumococo específico podía ser transmitida a otro neumococo de un tipo capsular diferente introduciendoDNA purificado del primer tipo en el segundo.Reglas de Chargaff para ADN de Doble hélice, 1949Rosalind Franklin, Maurice Wilkins:En 1953, James Watson y Francis Crick combinaron los datos químicos y físicos del ADN y propusieron el modelo estructural del ADN, con las siguientes características:
  2. 2. 2♣ Las dos hebras están enrolladas una alrededor de la otra formando una doble hebra helicoidal♣ Las dos cadenas de polinucleótidos se mantienen equidistantes, al tiempo que se enrollan en torno a un ejeimaginario♣ El esqueleto azúcar-fosfato sigue una trayectoria helicoidal en la parte exterior de la molécula♣ Las bases se dirigen hacia el interior. Las de una hebra enfrentadas con la de la otra (pb) e interactúan entresi por puentes de H. Cada pbesta en el mismo plano y este es perpendicular al eje de la hélice ACIDOS NUCLEICOSADN:Constituido por 4 desoxinucleótidos: Desoxiadenosina, desoxiguanosina, desoxicitidina, desoxitimidinaLos pares de bases están conformados:A ----- T y C ------- GGobierna la síntesis de proteínas, la información (código genético) está determinada por la secuencia denucleótidos. NO TODO EL ADN ESTÁ FORMADO POR GENES*El “inicio” se define como 5„ y el “fin” como 3„*Los términos 5‟ y 3‟ indican la posición de los nucleótidos en el esqueleto de ADN en relación con la moléculade azúcar*Las dos cadenas de la doble hélice están orientadas en direcciones opuestasTIPOS DE ADN:Dependen del enrollamiento de la cadena y su orientación:ADN B: hélice orientada a la derecha con una distancia de 3,4 Aº entre pares de bases y 10,4 pares de basepor vuelta. Forma predominante in vivo.ADN A: predomina en los híbridos ADN-ARN es similar a la B pero mas compacta 2,3 Aº entre pares de bases y11 pares de bases por vuelta.ADN Z: las bases de las dos cadenas se posicionan mas hacia la periferia de una hélice orientada a laizquierda. Hay una distancia de 38 Aº entre pares de bases y 12 bases por vueltaARN :Constituido por una sola hebra, sus nucleótidos son: Uridina, Adenosina, Guanosina, Citdina.Es de 5 a 10 veces más abundante que el ADN Tipos:-ARNr -ARNm -ARNt Tipos de ARN en eucariotas♣ARN heterogéneo nuclear (hnRNA).♣ARN mensajero (mRNA).♣ARN ribosómico (rRNA).♣ARN de transferencia (tRNA).♣ARN citoplasmático pequeño (scRNA)♣ARN nuclear pequeño (snARN)
  3. 3. 3ARNhnRepresenta las moléculas precursoras del RNAm que son transcritas directamente del DNA y que codificanpara una proteína determinada.Incluye secuencias codificantes (exones) y no codificantes (intrones). Es el RNA que será procesado.ARNmRepresentan las moléculas procesadas del hnRNA que codifican para una proteína determinada. Susecuencia de nucleótidos es traducida en una secuencia de aminoácidos en el proceso de traducción parasintetizar una proteína .Se incluyen formas muy heterogéneas tanto en tamaño como en secuencia, existiendo, en general, unamolécula de mRNA para cada gen o grupo de genes que vayan a expresarseARNtEs el más pequeño con unos 75 nucleótidos de medida. Su función es transportar los aminoácidos en formaactivada hasta el ribosoma, durante el proceso de traducción del mRNA. Existe al menos un tipo de tRNA paracada uno de los 20 aminoácidos. Todos presentan en su extremo 3´ la secuencia de nucleótidos CCA,independientemente del aminoácido que transporten. El extremo 3´ constituye el extremo aceptor delaminoácido.ARNrEs el tipo de ARN predominante en la célula, forma parte de los ribosomas y por ende participa en latraducción de proteínas. Actúan como ribozimas en la síntesis protéica, teniendo actividad peptidil-transferasa, permitiendo la formación del enlace peptídico.Hay diferentes tipos en función de sus coeficientes de sedimentación:Procariotas: 16 S (Subunidad pequeña 30S); 23 S y 5 S (Subunidad grande 50S)Eucariotas: 18S (Subunidad pequeña 40S); 28S, 5,8S y 5S (subunidad grande 60S)scRNAParticipa en el proceso de soldadura de los exones durante la formación del ARNm. Son pequeñas secuenciasde unos 150 nucleótidos de media. Es un ARN de unos 300 nucleótidos es el RNA que forma parte del SRP(SignalRecognitionParticle) que ejerce una función específica en el envío de proteínas recién sintetizadashacia compartimentos intra-o extracelulares.snRNASecuencias pequeñas de unos 150 nucleótidos de media. Participan en el proceso de eliminación de intronesy unión de exones. Forma parte de los espliceosomas (SNURPS, factores de empalme y pre-ARNm), queparticipan en la maduración del ARNmEMPAQUETAMIENTO DEL ADN-Histonas: Proteínas asociadas con la cromatina del DNA.-Nucleosomas: Unidad estructural construida con ocho moléculas de histona y DNA superenrollado con giro ala izquierda.
  4. 4. 4 1 Bucle son 50x106pb 1 Roseton son 6 bucles 1 Vuelta de espiral son 30 rosetones 2 Cromatidas con 2x10 vueltas de espiralREPLICACION SEMICONSERVATIVA DEL ADNProceso por el cual se sintetiza el ADN y se dice que es semiconservativa porque las cadenas de ADN parentalsirven como moldes para las dos cadenas complementarias Cada molécula generada por el proceso dereplicación contiene una cadena parenteral intacta y una nueva de síntesis.  REPLICACION EN PROCARIOTAS:En procariotas el ADN es circular, este proceso de replicación ha sido ampliamente estudiado en E. coli.La replicación tiene un lugar de inicio denominado OriC, al cual se unen aproximadamente 30 moléculas deproteína A y su característica principal es ser bidireccional.Con ayuda de proteínas de replicación las hebras parentales se separan en OriC y se forma una doblehorquilla que se desplaza en ambos sentidos alejándose del origen.En procariotas la replicación debe ser guiada por la intervención de las siguientes enzimas:.. Cebadores:Para que la ADN polimerasa pueda dar inicio a la síntesis es necesario un extremo 3‟-OH libre que es aportadopor el cebador (oligonucleótido de ARN) y se sintetiza en dirección 5‟ 3‟ por una primasa (ARN polimerasa)que añade inicialmente un desoxirribonucleótido al grupo 3‟-OH y luego continúa añadiendo al extremo 3‟ dela cadena en crecimiento...Eliminación de errores en el apareamiento de bases:El primer punto de control es ejercido por la Pol III en su función exonucleasa y tras la replicación otrosmecanismos reparan apareamientos erróneos que escapan a la primera corrección de errores.
  5. 5. 5  REPLICACION EN EUCARIOTAS:El proceso es similar que en procariotas las diferencias principales radican en el tamaño del ADN eucariota y laasociación del ADN eucariota con las histonas en los nucleosomas.Hay muchos puntos de origen para la replicación de este ADN.Polimerasas en eucariotas:Existen al menos 9 clases de ADN polimerasas (α, β, γ, δ, ζ, ε, κ, η, ι) la δ es la principal enzima replicativa laspolimerasas α, β y ε participan en la reparación del ADN, la polimerasa γ en la replicación del ADNmitocondrial.En 1968, ReijiOkazaki demostró que la síntesis de una de las cadenas (conductora) en dirección 5‟-3‟ hacia lahorquilla es continua y la otra cadena (retrasada) es discontinua y se sintetiza en fragmentos cortos(fragmentos de Okazaki) en sentido 5‟------3‟ alejándose de la horquilla para posteriormente unirse pero econjunto el proceso avanza hacia la horquilla de replicación.TOPOISOMERASA:-Desenrollamiento del ADN parental-Enrollamiento de las hebras de ADN en la cabeza de la horquilla de replicación-Rotura transitoria que sirve como eslabón giratorio para permitirla rotación libre de las hebras de ADNDaños en el ADN Errores de replicación: Alteraciones de la polimerasa en la selección del nucleótido por ejemplo ocasionado por presencia excesiva de un nucleótido en particular. Daños espontáneos: Ocurre a 37°C, que se pierden bases espontaneamente quedando sitios apurinicos o apirimidicos que influyen en la sintesis de la cadena complemantaria. Daños endógenos: Producidos por radicales libres. Daños exógenos: A) Radiaciones ionizantes (rayos X y γ) producen ruptura de doble cadena, bases dañadas. B) Radiaciones UV produce dimerización de pirimidinas REPARACIÓN DEL ADNREPARACIÓN DIRECTA: por este mecanismo se reparan metilación de guanina y en alguno casos dimeros depirimidinas, no hay intervención de nucleasas ni ADN polimerasas.REPARACIÓN INDIRECTA: Con intervención de nucleasas y ADN polimerasas, se requiere hebra moldeperteneciente al mismo cromosoma o cromosoma homólogo.*Escisión de base: reparación puntual de alteraciones en bases nitrogenadas, se origina un sitio AP que luegoes retirado y se resintetiza la hebra.*Escisión de nucleótidos: reparación de alteraciones que distorsionan la conformación del duplex y queobstaculizan la trascripción y replicación (bases alteradas o mal apareadas). Una nucleasa escinde unaporción de la hebra próxima al daño y luego se resintetiza.*Recombinación de regiones homólogas/unión de fragmentos terminales de hebras rotas: reparan lesiones enlas que se afectan ambas hebras o en las que no existe una hebra que pueda actuar como molde fiable.Mecanismo complejo.TRANSCRIPCIÓNProceso de síntesis de ARN. Mecanismo celular por el cual la información genética contenida en el ADN estransferida a una molécula de ARNDurante la transcripción la información genética del ADN es copiada al ARN mensajero (ARNm):La transcripción comienza al inicio del gen, en 5 (región del promotor) y continua hasta el fin del gen en 3.La secuencia del ARNm es complementaria a la del molde de ADN usada para la transcripción, exceptoque las bases de uracilo sustituyen a las timinas.
  6. 6. 6La nueva molécula de ARN es procesada a través de:“Splicing”: escisión de los intrones.“Capping”: modificación del extremo 5‟.Poli adenilación: adición de adeninas en el extremo 3‟. -Utiliza el molde de ADN para polimerizar ribonucleótidos 5´trifosfato (NTPs). El crecimiento es en dirección 5´ -3´ No requiere un cebador Solo se trascribe un fragmento del ADN utilizando una sola hebra, denominada sin sentido y la otra es lahebra con sentido.Fases:1)Iniciación: tiene lugar en secuencia promotora o promotores2)Elongación: por acción de la ARN Polimerasa (ARNP)3)Terminación: a)Independiente del factor b)Dependiente del factor1)Pre-iniciación: Se requiere el reconocimiento de una región promotora, lo cual se da gracias a los factoresde iniciación. Esos promotores tienen secuencias especificas, muy conservadas en varias especies (cajasTATA). La formación del complejo de transcripción se realiza sobre el promotor TATA, allí se forma el núcleo delcomplejo de iniciación. Sobre la caja TATA se fija una proteína de unión (TBP) junto con el factor detranscripción (TFIID). Después, a ellos se unen otros factores de transcripción específicos Esto conforma elcomplejo de pre-iniciación cerrado (Hemivida 10 seg aprox.)1)Iniciación: Apertura de hebras de ADN (helicasa), en las cajas TATA Unión de los factores y proteínas detranscripción, permitiendo el posicionamiento de ARN pol (Subunidad σ) al molde de ADN. Esto se denominacomplejo abierto. Una vez formado la ARN pol comienza a unir rNTPs, culminando de esta manera la fase deiniciación. Cuando la cadena transcrita alcanza unos 23 nucleótidos se inicia la elongación2) Elongación:Sitio para los rNTP, semisaturación de 10μM. primeras reacciones de formación de enlaces fosfodiester tienen eficiencia baja. Aborto de 2 a 9 residuos. LasDisociación de la subunidad σ y se continua por la polimerasa “core”.3) Terminación:a)Independiente del factor (características): segmentos simétricos ricos en GC, que en el trasncrito forman un bucle troncal. DosTrayecto posterior de 4 a 8 residuos de A. La ARNP reduce la velocidad o realiza una pausa. La estabilidad de los pbdeGC hace que el molde sea difícil de desenrollar.b) Dependiente del factor ρ Características: lleva a cabo por una proteína con actividad ADN-ARN helicasa. La proteína ρ (rho) se une al transcrito en formación Secuando la ARNP realiza una pausa. pausa de la ARNP en lugares de terminación dependiente de ρ posiblemente por acción de la proteína NusA. La TRADUCCION Síntesis de proteínas guiada por un molde de ARNm.No es más que la etapa final de la expresión génica.Es sólo el primer paso en la constitución de una proteína funcional.Todos los ARNm se leen en dirección 5´- 3´.
  7. 7. 7Las cadenas polipeptídicas se sintetizan desde el extremo amino terminal al carboxi terminal. Cada aminoácido viene codificado por tres bases (codón) en el ARNm.Tiene lugar en los ribosomas.Implica la interacción de tres tipos de moléculas de ARN (ARNm, ARNt y ARNr).El ARNt sirve de adaptador entre el ARNm y los aminoácidos de la proteína.Etapas:1)Iniciación: unión del ARNt iniciador y del ARNm a la subunidad pequeña del ribosoma.2)Elongación: unión de varios aminoácidos a la cadena polipeptídica creciente.1)Terminación: se encuentra el codón de terminación y se disocia el ribosoma liberando la cadenapolipeptídica sintetizada.Inicio de la traducción en células procariotas:1)Unión de tres factores de iniciación (IF-1, 2 y 3) a la subunidad pequeña ribosómica.2)Unión a la subunidad ribosómica pequeña del ARNm y del ARNt iniciador (fMet). Liberación de IF-3 y uniónde la subunidad ribosómica grande.3)Unión de la subunidad ribosómica grande al complejo por hidrólisis del GTP, con liberación de IF-1 e IF-2unido a GDP.Inicio de la traducción en células eucariotas.1)Unión de tres factores de iniciación (eIF-3, 1 y 1A) a la subunidad pequeña ribosómica.2)Llegada al ribosoma del ARNt iniciador (Met) por el eIF-2 (formando complejo con GTP) y del ARNm porvarios IF.3)Reconocimiento del codón de iniciación (AUG) con hidrólisis de ATP.4)Liberación de eIF-2 y otros IF por hidrólisis de GTP.5)Unión de la subunidad ribosómica grande al complejo.Etapas de la elongación de la traducción.1)Unión del ARNt iniciador (fMet o Met) al sitio P (peptidil) del ribosoma.2)Llegada de un segundo aminoacil al sitio A (aminoacil) del ribosoma dirigido por EF-Tu (unido a GTP) que selibera luego de la hidrólisis del GTP.
  8. 8. 8Etapas de la elongación de la traducción.3)Formación del enlace peptídico y transferencia del fMet al aminoacilARNt ubicado en el sitio A.4) Translocación del peptidilala-met al sitio P y la del ARNt libre al sitio E (liberación).El sitio A queda vacío, ocasionado por el desplazamiento del ribosoma tres nucleótidos a través del ARNmmediado por EF-G por hidrólisis de GTP.Terminación de la traducción.1)Reconocimiento de un codón de terminación (ej: UAA) por un factor de liberación y no por un ARNt.2)Liberación de la cadena polipeptídica completa y disociación del ARNt y ARNm del ribosoma El código está organizado en tripletes o codonesEl código genético es degenerado: existen más tripletes o codones que aminoácidos, de forma que undeterminado aminoácido puede estar codificado por más de un triplete.El código genético es no solapado o sin superposiciones: un nucleótido solamente pertenece a un únicotriplete.La lectura es "sin comas": el cuadro de lectura de los tripletes se realiza de forma continua , sin que existanespacios en blanco.El código genético nuclear es universal: el mismo triplete en diferentes especies codifica para el mismoaminoácido. La principal excepción a la universalidad es el código genético mitocondrial
  9. 9. 9Con 3 bases hay 64 combinaciones posibles (redundancia)¿Cuál es la secuencia de aminoácidos que se traduce de esta secuencia de ARN?CCA CAA GAC UAGa)Pro GIn Asp Stopb) Pro His Asp Trpc) His GIn Asp Stopd) Pro GIn His Stop DADAS LAS HEBRAS CODIFICANTES:5--TGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATG --35 --TGCATATCGTAGGCGATAACAATATCAGTCCATCAGCAGCTATC --3 a)REALICE LA PLANTILLAb) ARNmc) TRADUZCA EL TRANSCRITO

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